依達拉奉對心肺復蘇術后心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究

石新燁 孫經(jīng)武 王佳森 劉振 劉婧玚 董文敬 張翠

中國心血管病患病率及死亡率處于上升階段，其中心血管病死亡率居首位，明顯高于腫瘤及其他疾病，占疾病死亡構成的40%以上[1]，而存在各種心血管基礎性疾病的患者更容易發(fā)生心臟驟停。心臟驟停指人體心臟的射血功能突然停止，伴有心音與大動脈波動消失等癥狀，嚴重威脅患者的生命安全，其在使死亡率升高的同時還易引起相關并發(fā)癥，對患者生活質量造成嚴重影響。對心臟驟?；颊邞迷缙谛姆螐吞K在心臟驟停院前急救中發(fā)揮重要意義[2]。研究發(fā)現(xiàn)，自主循環(huán)恢復（Return of spontaneous circulation，ROSC）后患者主要死于全身缺血再灌注引起的心腦功能障礙[3]。心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是指在冠狀動脈發(fā)生完全或部分梗阻后，重新獲得血流時心肌組織的損傷反而會進行性加重[4]。其涉及多種生物學過程和信號傳導途徑，包括細胞內氧自由基的大量產(chǎn)生[5]、鈣離子超負荷[6]、線粒體通透性轉換孔開放[7]、內皮細胞功能受損[8]、過度炎癥反應[9]及細胞凋亡等。近年有研究顯示細胞焦亡在MIRI 中發(fā)揮重要作用，MIRI 主要通過NOD 樣受體蛋白3/天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1/焦孔素D（NLRP3/Caspase-1/GSDMD）信號通路介導心肌細胞焦亡，其特征是心肌缺血再灌注過程中被激活的Caspase 特異性剪切GSDMD[10]，將N-末端從具有自我抑制作用的C-末端中釋放出來，隨后GSDMD-N 與脂質結合形成非選擇性孔隙，不依賴于增加滲透壓使細胞破裂。釋放出的細胞內活性物質激發(fā)機體免疫反應，使心肌梗死面積擴大，加重心肌功能障礙及結構紊亂。既往研究表明，依達拉奉作為一種自由基清除劑，對MIRI 有保護作用，其可降低因自由基大量生成所導致的細胞膜損傷和蛋白質核酸不可逆的破壞作用，也可以通過降低心臟驟停后的氧化應激來改善心肌功能損傷[11]。本研究通過探討依達拉奉是否通過抑制細胞焦亡通路對心臟驟停心肺復蘇后MIRI 發(fā)揮保護作用，同時降低炎癥因子含量進而減少對心肌的損傷，以期為心臟驟停心肺復蘇后MIRI 新的治療方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及試劑實驗儀器：多導生理信號記錄儀及配套生理信號采集處理系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），動物呼吸機（成都儀器廠成都泰盟科技有限公司），心電圖機（飛利浦有限公司），電泳槽、電轉裝置、電泳儀（Bio-rad 公司），水平搖床（北京六一生物科技有限公司），酶標儀（美國Thermo 公司），臺式低溫離心機（德國Eppendorf 公司），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（山東愛博科技貿(mào)易有限公司），光學相差顯微鏡（奧林巴斯公司），Microm Gmbh 切片機（德國Microm International GmbH 公司）。實驗試劑藥品：戊巴比妥鈉（濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院），10%氯化鉀（中國大冢制藥有限公司），依達拉奉（先聲藥業(yè)有限公司），腎上腺素（北京市永康藥業(yè)有限公司）。SDSPAGE 凝膠配制試劑盒、PMSF、RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液（武漢塞維爾生物科技有限公司），Anti-GAPDH antibody、Anti-NLRP3 antibody、Anti-IL-1βantibody、Anti-Caspase-1 antibody、Anti-GSDMD antibody（Abcam公司）、HRP 標記羊抗兔二抗（博士德生物工程有限公司）。大鼠特異性 ELISA 試劑盒IL-1β、IL-6、TNF-α（博士德生物工程有限公司）。EDTA 抗原修復液、SABC 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司），HE 染色試劑盒（Solarbio 公司）。

1.2 動物及分組選擇36 只250～300g 雄性 SD 大鼠，購自濟南杰瑞康生物科技有限公司。每3 只合籠飼養(yǎng)，標準飼料購自濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗中心。予以日常光照，不限食物和水。36 只SD 雄性大鼠隨機選擇12 只作為假手術組，只行頸外靜脈及尾動脈置管、氣管插管、Ⅱ導聯(lián)心電圖。其余大鼠制備心臟驟停后心肺復蘇模型，模型完成后隨機分為2 組，分別為生理鹽水組、依達拉奉組，每組12 只，ROSC 后依達拉奉組大鼠靜脈注射依達拉奉3mg/kg，生理鹽水組注射相同劑量的生理鹽水。

1.3 實驗方法

1.3.1 制作模型 本研究采用高鉀合并窒息方式制備心臟驟停后心肺復蘇大鼠模型，此法改良自Sharp 等[12]的制備方法。實驗前大鼠禁食12h，期間自由飲水。戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔麻醉，行氣管插管連接呼吸機（參數(shù)：通氣頻率70 次/min，潮氣量6ml/min，呼吸比1:3），經(jīng)四肢皮下電極探針常規(guī)記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖。右側頸靜脈置管以0.3ml/kg的劑量脈沖式注射10% KCl 溶液，注射時一次性給藥，給藥時間1s 左右。尾動脈置管后連接多導生理信號記錄儀及配套生理信號采集處理系統(tǒng)。待大鼠發(fā)生心臟驟停后，立刻關閉呼吸機使呼吸受抑制，計時5min 后，立即打開呼吸機開始心肺復蘇，胸外心臟按壓頻率180～200 次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3，按壓放松時間比1:1，按壓時間3～5min，1min 后靜脈注射0.04mg/kg 腎上腺素，若無效于4min 后重復1 次，5min 自主循環(huán)仍未恢復則視為復蘇失敗。若心肺復蘇成功，ROSC 后生理鹽水組與依達拉奉組立即經(jīng)頸靜脈分別給予生理鹽水/依達拉奉（3mg/kg）。待大鼠自主呼吸恢復后即可拔除氣管插管。取材：誘導大鼠ROSC 6h 后處死，用手術剪沿胸骨下緣剪開大鼠胸部以暴露心臟，左心室取血，離心后分裝血清于-80℃冰箱保存組織。分離心臟后一部分心肌組織用預冷的4℃PBS 漂洗干凈后，置于-80℃冰箱中保存，另一部分置于4%多聚甲醛緩沖液固定。

心臟驟停判斷標準：有創(chuàng)動脈壓顯示動脈搏動波消失，且平均動脈壓<20mmHg；心電圖顯示為無脈性電活動、心室顫動或呈一條直線。ROSC 標準：心電圖顯示出現(xiàn)室上性節(jié)律（包括竇性、房性或交界性）；平均動脈血壓維持30mmHg 以上。見圖1。

圖1 大鼠心臟驟停實驗過程中的心電圖表現(xiàn)

1.3.2 大鼠血流動力學監(jiān)測 經(jīng)四肢皮下電極探針常規(guī)記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖后，監(jiān)測心率（HR）、收縮壓、舒張壓，生理鹽水組及依達拉奉組在ROSC 30min后再次經(jīng)尾動脈記錄HR、收縮壓、舒張壓。

1.3.3 蛋白印跡法（Western Blot）檢測各組大鼠細胞焦亡信號通路表達情況 取暫存于-80℃冰箱的大鼠心肌組織，勻漿，提取蛋白，依次進行蛋白變性、蛋白定量、電泳、轉膜，室溫封閉2h，洗膜并加入Caspase-1、GSDMD 及IL-1（1:1 000）抗體，以GAPDH（1:5 000）為內參，4℃孵育過夜，洗膜加二抗室溫孵育2h，顯像，采用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白相對內參表達量。

1.3.4 HE 染色 心肌組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木素溶液、伊紅溶液染色，乙醇再次脫水，封片后光鏡下觀察各組心肌組織病理變化。

1.3.5 免疫組化 心肌組織切片置于60℃溫箱中烤片2h，脫蠟、水化后，EDTA 熱抗原修復，3% H2O2室溫孵育20min，PBS 液漂洗（3 次×5min）后加山羊血清封閉液，室溫下放置15min 后加入NLRP3、Caspase-1、GSDMD 抗體（1:100）4℃過夜。次日PBS漂洗后滴加生物素標記山羊抗大鼠抗體，37℃孵育30min，PBS 漂洗后DAB 顯色2min，自來水充分沖洗后蘇木素復染3min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察圖像并拍照，每張切片隨機選取5 個視野，通過ImageJ 軟件分析圖像。

1.3.6 ELISA 檢測炎癥因子 將采集的大鼠血液在4℃離心機中以3 000r/min 離心15min，獲取血清，使用ELISA 試劑盒檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，用酶標儀檢測450nm 處吸光度值，計算各因子含量。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用雙側檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組血流動力學比較造模前各組大鼠的體重、HR、收縮壓、舒張壓差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。ROSC 后30min，與假手術組相比，生理鹽水組大鼠HR 增快，生理鹽水組及依達拉奉組大鼠收縮壓與舒張壓大幅度下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與生理鹽水組相比，依達拉奉組大鼠HR 減慢，收縮壓及舒張壓位于正常范圍內且平穩(wěn)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表1 三組實驗前基線水平比較（±s）

表1 三組實驗前基線水平比較（±s）

分組HR（次/min）收縮壓（mmHg） 舒張壓（mmHg）體重（g）假手術組233.91±14.91105.12±11.1298.53±12.22263.72±9.65生理鹽水組246.50±18.77108.05±10.55102.74±9.40249.91±16.80依達拉奉組241.17±22.29107.46±10.68101.38±12.08266.36±15.90 F 1.2640.2400.4290.413 P 0.2960.7880.6540.666

表2 三組ROSC 30min 后HR、血壓水平比較（±s）

表2 三組ROSC 30min 后HR、血壓水平比較（±s）

注:與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

分組HR（次/min）收縮壓（mmHg） 舒張壓（mmHg）假手術組233.91±14.92105.12±11.1298.53±12.22生理鹽水組 281.46±36.02**53.47±7.79**50.10±9.99**依達拉奉組 239.83±37.34#82.27±15.88**## 77.14±14.39**##F 8.27856.07047.032 P 0.0010.0000.000

2.2 三組心肺復蘇后大鼠心肌組織形態(tài)的變化HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞無水腫，心肌纖維條理清晰呈束狀排列，細胞形態(tài)及結構正常。生理鹽水組細胞排列紊亂，且部分細胞斷裂，伴有周圍炎性細胞浸潤，依達拉奉組上述情況緩解。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織HE 染色（×40）

2.3 三組炎癥因子表達情況與假手術組相比，生理鹽水組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），依達拉奉組IL-1β、IL-6、TNF-α 表達量稍下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與生理鹽水組相比，依達拉奉組IL-1β、IL-6、TNF-α 顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 三組大鼠血清中炎癥因子水平比較（pg/ml，±s）

表3 三組大鼠血清中炎癥因子水平比較（pg/ml，±s）

注:與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

分組IL-1βIL-6TNF-α假手術組67.09±12.7838.32±23.4076.58±7.67生理鹽水組 122.14±33.37*112.57±20.56*145.92±58.96**依達拉奉組 61.68±12.81##36.82±9.22##67.77±6.73##F 11.64231.98010.594 P 0.0020.0000.001

2.4 三組心肌細胞焦亡信號通路情況比較Western blot 及免疫組織化學分析檢測細胞焦亡通路關鍵蛋白在大鼠心肌中表達情況顯示：與假手術組相比，生理鹽水組中NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白含量在ROSC 后均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與生理鹽水組相比，依達拉奉組上述蛋白含量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Western blot 檢測IL-1β：與假手術組相比，生理鹽水組中IL-1β 蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與生理鹽水組相比，依達拉奉組蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3、4，表4。

表4 三組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達情況（%，±s）

表4 三組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達情況（%，±s）

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01

分組NLRP3Caspase-1GSDMD假手術組1.38±0.291.67±0.931.20±0.36生理鹽水組44.74±5.03**15.95±2.72**13.50±6.71**依達拉奉組8.18±1.53#5.70±0.59**##2.44±1.15#F 175.87762.65214.794 P 0.0000.0000.010

圖3 Western blot 檢測各組焦亡細胞通路蛋白的表達情況

圖4 免疫組化檢測各組焦亡細胞通路蛋白的表達情況

3 討論

本研究通過制作大鼠心臟驟停后心肺復蘇造成MIRI 模型，ROSC 后給予依達拉奉，觀察藥物對細胞焦亡通路蛋白表達的影響，進而研究對心肌的保護作用機制。

炎癥反應是機體針對有害刺激的重要生理反應，在免疫反應中起重要作用。有研究證明[13，14]，心肺復蘇后全身缺血再灌注損傷誘導炎癥反應激活，多種炎癥因子及炎癥介質釋放可直接抑制循環(huán)和心肌功能，最終導致心肌梗死、纖維化及心力衰竭等不良后果。炎癥反應發(fā)生時，中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞募集到心肌缺血區(qū)域，釋放大量炎癥因子，包括IL-1β、TNF-α 及IL-6 等，其中TNF-α 是較早釋放的具有多種生物效應的重要促炎細胞因子，可誘發(fā)“次級”炎癥因子IL-6 的產(chǎn)生，再通過IL-6 刺激各種細胞群在身體防御中發(fā)揮核心作用[15]，是炎癥介質網(wǎng)絡的重要組成部分。本實驗結果顯示心臟驟停后心肺復蘇模型生理鹽水組的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平較假手術組均升高。Wallert 等[16]應用維生素E 最強的抗氧化形式α-生育酚（α-TOH）對大鼠左冠狀動脈前降支結扎60min 后制備MIRI 模型，結果證明α-TOH 通過抑制MIRI 誘導的氧化和炎癥反應，最終實現(xiàn)保護心功能。西紅花素可以通過Nrf2 減輕炎癥和未折疊蛋白，在心臟保護機制中發(fā)揮關鍵作用[17]。基于既往研究及本實驗研究證明，抗炎是治療心臟驟停心肺復蘇后MIRI 的一種策略。

在心肌缺血的情況下，線粒體功能障礙和溶酶體不穩(wěn)定會增加鉀離子外流，從而激活NLRP3 炎癥小體，促進細胞焦亡[18]。NLRP3 炎癥小體介導的無菌性炎癥貫穿MIRI 整個過程，其引起大量炎癥介質釋放至細胞外，大量促炎刺激信號引起中性粒細胞、巨噬細胞及其他類型白細胞持續(xù)向炎癥部位募集。炎癥體衍生的細胞因子IL-1β 誘導大鼠釋放活性IL-18 介導左室收縮功能障礙，加重MIRI[19]。同時有研究[20]發(fā)現(xiàn)，MIRI 模型中使用藥物抑制NLRP3 炎性小體，可限制大鼠心肌缺血再灌注后繼發(fā)性炎癥損傷和梗死面積；Yue 等[21]發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶的沉默可通過抑制NLRP3/ASC/Caspase-1 軸的激活來改善MIRI 所致的心肌功能障礙。本實驗檢測細胞焦亡通路相關蛋白發(fā)現(xiàn)，NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白在大鼠心臟驟停心肺復蘇后心肌組織中的含量均增加，與上述研究結果相同，表明細胞焦亡參與心臟驟停心肺復蘇后MIRI。

依達拉奉是一種具有抗炎、抗氧化、改善缺血再灌注損傷的藥物[22]，臨床上用于急性腦梗死的治療，可降低腦缺血再灌注損傷。隨著對其研究深入，其在臨床上的應用范圍呈現(xiàn)逐漸擴展趨勢，發(fā)現(xiàn)對于心肌缺血再灌注保護同樣具有十分重要的意義。本實驗結果發(fā)現(xiàn)依達拉奉組血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥因子較生理鹽水組均下降，同時通過Western blot 檢測心肌組織中IL-1β 的表達也驗證MIRI 過程中有大量IL-1β 炎癥因子釋放，同時表明依達拉奉能夠減輕炎癥因子介導的MIRI，從而改善微循環(huán)保護心肌細胞。有研究表明[23]依達拉奉治療急性心肌梗死行CABG 術的患者，通過有效控制血清TNF-α、IL-6、NO 水平，從而保護心肌細胞，改善心功能，提高臨床療效；林菁等[24]發(fā)現(xiàn)依達拉奉能有效降低心臟驟停心肺復蘇成功后患者的血清TNF-α、IL-1β 等促炎性細胞因子水平，均與本實驗結果一致。本實驗中Western blot 檢測依達拉奉組細胞焦亡通路相關蛋白表達量較生理鹽水組均有所下降，在免疫組化中再次驗證結果相同。因此，依達拉奉可能通過抑制細胞焦亡通路蛋白的表達，進而對大鼠心臟驟停心肺復蘇后MIRI發(fā)揮保護作用。

綜上所述，依達拉奉對大鼠心臟驟停心肺復蘇后MIRI 起保護作用，可能機制是通過控制級聯(lián)放大炎癥反應，降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達，進而抑制細胞焦亡有關。