葛根素對實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎炎癥反應(yīng)和骨吸收的影響

萬 妮，莫禮文，詹 樂，陳薈穎，張 黎

（海南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101）

牙周炎作為世界上位居前列的口腔常見疾病，經(jīng)過研究得出其相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)性疾病至少有50 多種［1］。Bernabe 等人報(bào)告說，2017 年全球有7.96 億例重度牙周炎［2］。在我國大陸有近90%的中國成年人患有不同嚴(yán)重程度的牙周病［3］。

越來越多的證據(jù)表明，牙周疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制是由宿主對牙周生物膜微生物反應(yīng)的結(jié)果。牙周病原體還釋放有害的副產(chǎn)物和酶，分解細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白和宿主細(xì)胞膜。一旦啟動(dòng)宿主反應(yīng)，白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或其他宿主組織衍生細(xì)胞釋放出各種炎癥分子，如細(xì)胞因子和前列腺素，引起牙周支持組織的破壞［4］。大量的細(xì)胞因子在牙周炎的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，導(dǎo)致牙周附著喪失和骨吸收。當(dāng)牙周病原體侵入局部病變時(shí)，宿主免疫系統(tǒng)被激活［5］。各種類型的免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞因子和其他元素參與這一過程，從而導(dǎo)致有效地根除致病菌。對牙周炎發(fā)病機(jī)制的研究現(xiàn)在被認(rèn)為屬于“骨免疫學(xué)”的范疇，骨免疫不僅是造成牙周炎中牙槽骨平衡失調(diào)的原因，而且也是調(diào)節(jié)牙周炎最有效的系統(tǒng)［6］。

葛根作為天然植物，在中醫(yī)中應(yīng)用于發(fā)燒、腹瀉、心血管疾病和糖尿病的治療已有數(shù)千年的歷史［7］。葛根素（C21H20O9），由于其豐富的生物活性和藥理安全性，近來被用于大量的藥理研究［8］。葛根素具有具有強(qiáng)大的抗炎、抗癌和抗氧化活性［9］，可調(diào)節(jié)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，可能成為治療牙周炎安全有效的候選藥物［10］。

本研究旨在確定葛根素是否能抑制結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎的牙周支持組織破壞，抑制牙周炎癥和牙槽骨吸收。對宿主免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中部分細(xì)胞因子的調(diào)控作用及對牙周炎組織破壞的保護(hù)作用，從而說明葛根素是牙周炎治療的一種有前景的抗炎候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購買7 周齡Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠［（長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0014）］，體重（220±20）g，聚丙烯合成塑料大鼠籠分籠飼養(yǎng)，每4 只一籠，室溫（24±2）℃，濕度40%～60%，明暗周期12 h/12 h?？勺杂色@得食物和水。所有進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作，均根據(jù)國際動(dòng)物倫理的規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑及儀器 LPS（Sigma，美國）；葛根素（山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20060472）；IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γElisa 試劑盒（凡科維，上海）；多功能酶標(biāo)儀（Rayto RT-6100，廣東）；洗板機(jī)（BIOTEK Epoch2，美國）；Micro-CT 成像系統(tǒng)（AX2000-CT，中國奧影）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 基于隨機(jī)數(shù)字表分組，36只大鼠分3 組（n=12）：對照組（CON），牙周炎組（L），葛根素組（PR，400 mg/kg）。牙周炎組和葛根素組用于慢性牙周炎模型的建立，10%水合氯醛腹腔麻醉，用持針器將2.0 mm 結(jié)扎絲牢固結(jié)扎于左上第一磨牙（M1）近中牙頸部，結(jié)扎絲盡量放入牙頸部。所有大鼠的結(jié)扎由同一個(gè)人完成。一周后，在大鼠M1 頰腭側(cè)正中自齦溝注射20 g/L 的LPS 各25 μL，間隔48 h 注射一次，一共4 次。對照組則同時(shí)在同部位提供等量生理鹽水。4 d 一次檢查鋼絲，看鋼絲有無松動(dòng)，如若鋼絲滑脫，重新結(jié)扎鋼絲。建模成功后，大鼠給藥14 d，均灌胃給藥：CON 組及L 組，提供等量生理鹽水；葛根素組（PR），400 mg/kg 葛根素處理。

1.2.2 標(biāo)本采集 最后一次給藥后24 h 麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血5 mL，以3 000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心血清10 min 后取上清液，凍存于-20 ℃；再處死所有大鼠，部分大鼠分離左側(cè)上頜骨，取M1 頰腭側(cè)實(shí)驗(yàn)處新鮮牙齦組織，凍存于-80 ℃，余下上頜骨組織固定于4%多聚甲醛中；部分大鼠左側(cè)上頜骨標(biāo)本取材后保留牙齦組織，固定于4%多聚甲醛中。

1.2.3 HE 染色 將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中2 d，用10% EDTA 溶液脫鈣8 周，石蠟包埋。每個(gè)樣本沿近遠(yuǎn)中方向被切成5 μm 的切片。用蘇木精和伊紅（HE）對包含左上第一磨牙及遠(yuǎn)中鄰間區(qū)的連續(xù)切片進(jìn)行染色。

1.2.4 ELISA 檢測 根據(jù)說明書要求開展檢測，使用ELISA 試劑盒檢測血清中細(xì)胞因子（IL-4、IL-10、IL-6、IFN-γ）的表達(dá)濃度。

1.2.5 Micro-CT 分析 使用Micro-CT 成像系統(tǒng)（AX2000-CT 中國奧影）掃描上頜左側(cè)的固定標(biāo)本。Micro-CT 的測量條件為：電壓90 kV，電流80 μA，圖像像素大小3 072×3 072；層厚為4 μm。掃描后，使用Vgstudio MAX3.5 版本軟件進(jìn)行分析，平行于M1 頰、腭面牙根長軸測量釉牙骨質(zhì)界（CEJ）到牙槽嵴頂（ABC）的距離。每顆牙齒6 個(gè)測量值，其平均值被定義為每只大鼠的附著喪失距離（AL）［11］。測量M1 根間區(qū)域的骨表面積/總體積（BV/TV）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.4.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，各組之間的比較使用t檢驗(yàn)和方差分析。顯著性差異為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)分析葛根素對炎癥浸潤的影響

組織學(xué)觀察在L 組的M1 根分叉及遠(yuǎn)中鄰間隙區(qū)域觀察到明顯的炎性浸潤和牙槽骨損失（圖1B）。與L 組相比，PR 組（圖1C）的炎性浸潤明顯減少，牙槽骨損失顯著降低。

圖1 左上第一磨牙根分叉及遠(yuǎn)中鄰間區(qū)的炎癥細(xì)胞浸潤和骨吸收區(qū)（HE，100×，100 μm）Fig 1 Inflammatory cell infiltration and bone resorption areas in the root bifurcation and distal-middle inter-adjacent area of the left upper first molar（HE，100×，100 μm）

2.2 ELISA 分析葛根素對外周血中IL-4、IL-10、IL-6、IFN-γ 表達(dá)的影響

血清ELISA 檢測結(jié)果顯示：對比CON 組和L組中的IL-4 和IL-10，L 組濃 度降低，IL-6 和IFN-γ濃度則上升；經(jīng)葛根素治療后，IL-4、IL-10、IL-6、IFN-γ 表達(dá)量則相反，均逐漸接近CON 組，濃度差異均顯著（P均＜0.05）（圖2）。

圖2 ELISA 觀察大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況Fig 2 ELISA observation of inflammatory cytokine expression in rat serum

2.3 Micro-CT 分析葛根素對骨吸收的影響

大鼠左側(cè)上頜骨三維重建圖像結(jié)果（圖3 A～C）顯示：L 組在M1 周圍出現(xiàn)明顯且不規(guī)則的骨吸收。PR 組牙槽骨吸收較L 組有所減緩。AL 測量結(jié)果（圖3D）顯示：與CON 組相比，L 組和PR 組均顯示CEJABC 距離的增大，且距離差異顯著（P＜0.05）；相較L組，PR 組CEJ-ABC 距離有所降低（P＜0.05）。對3組大鼠進(jìn)行BV/TV 定量分析（圖3E）：與CON 組或PR 組相比，L 組的BV/TV 比率顯著降低。葛根素顯著減少了骨喪失的體積（P＜0.05）。

圖3 Micro-CT 觀察左側(cè)上頜第一磨牙牙槽骨吸收的情況（A-C），左側(cè)上頜第一磨牙附著喪失距離（mm）（D），左側(cè)上頜第一磨牙感興趣區(qū)骨體積分?jǐn)?shù)（%）（E）Fig 3 Micro-CT observation of alveolar bone resorption of the left maxillary first molar（A-C），loss of attachment distance of the left maxillary first molar （mm）（D），bone volume fraction （%）in the area of interest of the left maxillary first molar（E）

3 討論

炎癥和牙槽骨吸收是牙周炎的標(biāo)志癥狀。牙周病的治療側(cè)重于通過機(jī)械清創(chuàng)術(shù)減少牙周袋中的細(xì)菌負(fù)荷，但調(diào)節(jié)宿主免疫炎癥反應(yīng)可能在阻止疾病進(jìn)展和促進(jìn)愈合和修復(fù)方面發(fā)揮重要作用［12］?？梢砸种乒俏盏男滦退幬锏拈_發(fā)不僅提供了針對軟組織炎癥的機(jī)會(huì)，而且也提供了針對牙周炎中觀察到的破壞性骨吸收的機(jī)會(huì)。抑制炎性細(xì)胞募集和促炎性介質(zhì)的產(chǎn)生被認(rèn)為是牙周炎治療中的重要靶點(diǎn)。近來，葛根素被證明可以調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)，其低毒性引起了人們的廣泛關(guān)注，具有許多文獻(xiàn)證明的抗炎和抗破骨作用［13］。因此，本研究旨在確定葛根素是否能夠在結(jié)扎誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸种蒲装Y和骨喪失，保護(hù)牙周組織。

牙周炎的發(fā)病機(jī)制不可避免地與炎癥細(xì)胞因子級聯(lián)以及免疫細(xì)胞與牙周細(xì)胞之間的串?dāng)_有關(guān)［4］。牙周病原體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子的過度表達(dá)對加重牙齦炎癥和激活骨破壞產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。牙周炎中涉及的細(xì)胞因子及其相關(guān)細(xì)胞形成了一個(gè)針對細(xì)菌的復(fù)雜且完整的宿主免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，包含公認(rèn)的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，密切相關(guān)的Th 細(xì)胞亞群（Th1、Th2、Th17 和Tregs），這些細(xì)胞最具代表性的細(xì)胞因子分別為IFN-γ、IL-4、IL-17 和IL-10［14］，在骨免疫系統(tǒng)中這些細(xì)胞因子對調(diào)節(jié)骨骼健康也起著重要作用［15］。IL-4對牙周炎具有保護(hù)作用，對破骨細(xì)胞有直接和間接作用［16］。IL-10 是一種強(qiáng)大的抗炎和免疫抑制因子，是Treg 反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物，減緩牙周疾病的進(jìn)展并抑制牙周炎癥［17］。IL-6 已被證明為慢性炎癥的主要參與者，并被證明在許多細(xì)胞中具有多種功能，是由病原體相關(guān)分子模式、刺激和促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥放大器，并且IL-6 對適應(yīng)性免疫反應(yīng)也具有促炎作用［14］。IFN-γ 可以增強(qiáng)體外破骨細(xì)胞生成，并在體內(nèi)加重牙齦炎癥和牙槽骨丟失［18］。因此，我們從這些細(xì)胞因子的角度來探討葛根素的抗炎及骨保護(hù)作用。

為了證實(shí)葛根素在實(shí)驗(yàn)性牙周炎中的抗炎作用，通過HE 染色對牙周組織行組織學(xué)觀察，其結(jié)果表明與牙周炎組相比，葛根素治療后炎癥細(xì)胞浸潤減少。對血清中的炎癥細(xì)胞因子也觀察到類似的結(jié)果，L 組中異常的炎性細(xì)胞因子（IL-4、IL-10、IL-6和IFN-γ）表達(dá)，經(jīng)葛根素治療后，在PR 組中被逆轉(zhuǎn)。Wang 等［19］的研究顯示在敗血癥小鼠模型中，葛根 素可抑制炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的轉(zhuǎn)錄，增加血清IL-10 水平，減少敗血癥小鼠的全身炎癥并保護(hù)器官損傷。Liang 等［20］的實(shí)驗(yàn)表明葛根素減輕先兆子癇的癥狀，并在體外和體內(nèi)抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，對異常的胎盤炎性細(xì)胞因子（TNF、IL-6、IFN-γ）表達(dá)降低，IL-4 表達(dá)升高。與這些研究結(jié)果相一致，本研究中葛根素對大鼠模型牙周炎組織損傷也起到保護(hù)作用，減少了浸潤的炎性細(xì)胞，并使血清中的炎癥細(xì)胞因子濃度逆轉(zhuǎn)，逐漸趨于正常值。這些數(shù)據(jù)表明，葛根素可能在抗炎作用中發(fā)揮重要作用。

接著，本課題組研究了葛根素對牙槽骨吸收的影響。通過Micro-CT 三維重建顯示，PR 組的牙槽骨吸收比L 組少，BV/TV 比更高。這與HE 染色中觀察到的PR 組牙槽骨吸收情況一致。這表明葛根素對牙槽骨吸收具有抑制作用，與以往對葛根素在骨保護(hù)方面的活性研究［9］是一致的，如葛根素在小鼠顱骨骨溶解模型中可減弱破骨細(xì)胞生成、骨溶解［21］，一項(xiàng)Meta 分析結(jié)果顯示葛根素對OVX 誘導(dǎo)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型的骨量有上調(diào)作用［22］。

宿主免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)細(xì)胞因子過量釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的放大，炎癥反應(yīng)的惡化隨著組織的破壞而發(fā)展，導(dǎo)致結(jié)締組織的破壞。這些細(xì)胞因子可直接或間接激活骨膜成骨細(xì)胞，改變成核因子κB 配體受體激活劑的蛋白的表達(dá)水平，觸發(fā)破骨細(xì)胞活性，從而引起牙槽骨的吸收［23］。葛根素抑制牙周炎炎癥和牙槽骨吸收其部分原因可能是其對IL-4 和IL-10 的促進(jìn)作用及對IL-6 和IFN-γ 的 抑制作用，通過調(diào)節(jié)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，改善牙齦炎癥和牙槽骨破壞，有助于牙周炎的治療和恢復(fù)。

綜上，研究證據(jù)表明，葛根素可以通過增加IL-4 和IL-10、降低IL-6 和IFN-γ 來緩解結(jié)扎誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠的牙齦炎癥反應(yīng)和牙槽骨吸收，保護(hù)牙周支持組織。然而，為了更好地了解葛根素在牙周病中的作用，以及確定葛根素是否可以直接作用于結(jié)扎誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎中的破骨細(xì)胞，進(jìn)一步闡明葛根素在牙周炎中抗炎和抑制牙槽骨喪失的機(jī)制，還需要進(jìn)行更多的研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

萬妮：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)實(shí)施，成文；張黎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，審校；莫禮文：實(shí)驗(yàn)實(shí)施，資料收集；詹樂、陳薈穎：資料收集。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。