多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓活檢塑料包埋切片中血管內(nèi)皮生長因子表達情況

謝訓(xùn)祿

贛州市人民醫(yī)院 （江西贛州 341000）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為血液科常見疾病，屬惡性漿細(xì)胞病，起病緩慢，早期無明顯臨床癥狀，隨病情進展，逐漸出現(xiàn)多樣化臨床癥狀，包括腎功能不全、貧血、感染、骨痛、神經(jīng)癥狀、淀粉樣變等，威脅患者生命安全，需盡早診斷治療，以延長患者生存期[1]。近年來臨床對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展研究增加，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）逐漸成為研究熱點[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，MM 發(fā)生發(fā)展過程與VEGF 誘發(fā)的血管新生有關(guān)，即VEGF 水平升高會提升腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD），進而增加腫瘤細(xì)胞增殖速度及臨床治療難度，因此，MM 患者VEGF 水平可為評估患者疾病程度及預(yù)后提供更全面參考依據(jù)[3]。在VEGF 檢測樣本選擇中，骨髓塑料包埋切片能夠保證組織結(jié)構(gòu)完整，以及VEGF 和MVD 檢測的準(zhǔn)確性。為此，選取我院2020 年1 月至2021 年12 月期間收治的37 例MM 患者作為研究對象，分析不同分期、不同治療效果MM 患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF、MVD 水平，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2020 年1 月至2021 年12 月期間收治的37 例MM 患者，將其設(shè)為觀察組，另選取我院同期收治的40 例骨外科（非惡性腫瘤疾?。┗蜓翰』颊?，將其設(shè)為對照組。觀察組男20 例，女17 例；年齡45～76 歲，平均（62.31±3.15）歲。對照組男22 例，女18 例；年齡42～75 歲，平均（63.02±4.28）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（審批號：195132）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組均符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2015 年修訂）》[4]中MM 診斷標(biāo)準(zhǔn)；所取骨髓樣本理想，可完成骨髓活檢塑料包埋切片；無精神性疾病，可配合完成本研究；對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他血液系統(tǒng)疾病；合并其他惡性腫瘤、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移；觀察組預(yù)期生存期＜4 個月；觀察組治療期間失訪。

1.2 方法

取兩組骨髓樣本，均進行骨髓活檢塑料包埋切片：局部麻醉，以B65-01 型骨髓活檢穿刺針，在髂后或髂前上棘以二步法取骨髓樣本；將骨髓樣本放在Bouin 液（5 ml 冰醋酸、20 ml 40%甲醛、75 ml 飽和苦味酸水溶液混合后避光保存）中，在快速組織處理儀（瑞沃德，型號：DSC-400）中處理5 min（處理溫度為30 ℃）；取出骨髓樣本，以30 ℃自來水浸泡、沖洗至水無色；以乙醇梯度（75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇）脫水，將骨髓樣本放在快速組織處理儀中處理5 min（處理溫度為56 ℃）；將骨髓樣本依次放入塑料包埋劑甲液（7.2 g 聚乙二醇、100 ml 甲基丙烯酸羥乙基酯單體、0.72 g 過氧化苯甲?；旌虾? ℃保存，2 ～4 h）；將裝有骨髓樣本的塑料包埋劑甲液放在包埋盒中，包埋盒中加入1/40 塑料包埋劑乙液（1 ml N，N二甲基苯甲胺、15 ml PEG-400混合后4 ℃保存），充分混勻，4 ℃保存，自然聚合后取出；常規(guī)切片、裱片、烤片，制成2 μm厚切片，實施H-Giemas-E染色。

觀察組實施化療：給予100 mg/d 沙利度胺（常州制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H32026130，50 mg/片）+0.5 mg/d 長春新堿（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44021772，規(guī)格：1 mg/支）（d1～d4）+10 mg/（m2·d）阿霉素（Pharmacia Italia S.p.A.，H20030674，規(guī)格：10 mg/支）（d1～d4）+40 mg/d地塞米松（成都天臺山制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H5102-0513，規(guī)格：0.5 ml∶2.5 mg）（d1～d4、d8～d11），4 周為1 個療程，持續(xù)治療4 個療程。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平，VEGF，存在玫紅色顆粒樣著色為陽性，染色均勻區(qū)域內(nèi)取10 個高倍鏡視野（400×），記錄100 個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量，即為VEGF 陽性在100 個細(xì)胞中所占百分比（正常值為0）；MVD，骨髓活檢塑料包埋切片在低倍鏡（100×）下掃視，被CD34 染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞簇即計為1 個微血管，在400×視野下選擇5 個視野（代表骨髓切片面積約1.0 mm2），統(tǒng)計微血管數(shù)，重復(fù)計數(shù)3 次后取平均值，即為MVD 水平。（2）以國際分期體系（International staging system，ISS）對觀察組分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期），比較不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平。（3）觀察組治療4 個療程后，以《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2015 年修訂）》[4]中療效標(biāo)準(zhǔn)評價治療效果，治療效果包括完全緩解（完全緩解患者、嚴(yán)格意義的完全緩解患者、免疫表型完全緩解患者、分子學(xué)完全緩解患者）、部分緩解（部分緩解患者、非常好的部分緩解患者、微小緩解患者）、疾病穩(wěn)定、疾病進展，根據(jù)治療效果計算治療有效率[治療有效率=（完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù)）/總例數(shù)×100%]，并以不同治療效果分組（完全緩解組、部分緩解組、疾病穩(wěn)定組、疾病進展組），均進行骨髓活檢塑料包埋切片，比較4 組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF陽性率、MVD水平。（4）分析骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期、預(yù)后相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較

觀察組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平均較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

表1 兩組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

注：VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子，MVD 為腫瘤微血管密度

組別 例數(shù) VEGF（%）MVD（mm2）對照組 40 15.12±5.26 9.20±1.36觀察組 37 84.39±10.20 25.63±3.64 t 37.865 26.621 P＜0.001 ＜0.001

2.2 觀察組不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 觀察組不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

表2 觀察組不同分期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

注：VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子，MVD 為腫瘤微血管密度

分期 例數(shù) VEGF（%）MVD（mm2）Ⅰ期 15 37.84±6.96 15.69±3.31Ⅱ期 13 90.47±15.48 24.26±5.97Ⅲ期 9 136.25±24.71 41.76±4.51 F 113.947 87.658 P＜0.001 ＜0.001

2.3 觀察組治療有效率及不同治療效果組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較

治療4 個療程后，觀察組治療有效率為75.68%（28/37）。完全緩解組、部分緩解組、疾病穩(wěn)定組、疾病進展組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 觀察組不同治療效果組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

表3 觀察組不同治療效果組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平比較（±s）

注：VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子，MVD 為腫瘤微血管密度

組別 例數(shù) VEGF（%）MVD（mm2）完全緩解組 12 20.34±3.63 13.25±2.31部分緩解組 16 31.47±4.00 16.84±3.14疾病穩(wěn)定組 6 35.58±3.57 20.34±3.58疾病進展組 3 48.39±9.19 25.30±4.07 F 62.103 49.440 P＜0.001 ＜0.001

2.4 骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期、預(yù)后相關(guān)性分析

骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD水平與MM 患者疾病分期（Ⅰ～Ⅲ期）、預(yù)后（完全緩解及疾病進展）呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期、預(yù)后相關(guān)性分析

3 討論

MM 在臨床較為常見，早期疾病診斷中，其血清學(xué)指標(biāo)、病理組織改變不顯著，易與慢性結(jié)核感染、慢性肝病等慢性疾病及淋巴瘤等疾病混淆。腫瘤組織細(xì)胞增殖分裂速度快，對血運要求較高，會刺激病灶組織內(nèi)VEGF 水平快速升高，以促進腫瘤內(nèi)部快速形成大量新生血管，為腫瘤增殖分裂提供血運基礎(chǔ)[5]。同時在腫瘤細(xì)胞代謝、浸潤轉(zhuǎn)移過程中，同樣依賴新生的腫瘤血管網(wǎng)，促進贅生性漿細(xì)胞增殖及骨髓血管生成[6]。而VEGF 水平升高，會使腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)大量新生血管，因此MVD 水平隨之升高[7]。

與血清VEGF 水平相比，病灶內(nèi)VEGF 水平可更真實地反映病灶狀態(tài)。與傳統(tǒng)石蠟包埋相比，骨髓活檢塑料包埋的樣本無需經(jīng)過脫鈣處理，不易引發(fā)細(xì)胞收縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性良好，且對組織中酶活性保存良好，酶化學(xué)定位過程中可保證定位準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示，觀察組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平均較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；考慮原因為，MM 患者骨髓組織中惡性腫瘤生長、增殖、代謝過程中需要大量血運支持，會使血管生成水平上調(diào)，因此會出現(xiàn)VEGF 陽性率、MVD 水平升高情況。劉小敏等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MM 患者疾病發(fā)展過程中，miR-129-5p 可靶向負(fù)調(diào)控MM 患者BDNF、VEGF陽性率表達，而若miR-129-5p 調(diào)控能力下降，則會出現(xiàn)VEGF 表達水平上升情況，可能為MM 患者疾病進展主要原因之一。

本研究結(jié)果還顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；說明MM患者骨髓組織中VEGF 陽性率、MVD 水平升高，疾病分期隨之升高[9-10]。因此，在臨床評估MM 嚴(yán)重程度中，若骨髓組織中VEGF 呈現(xiàn)高表達水平，則提示患者病情相對嚴(yán)重。

本研究結(jié)果顯示，治療4 個療程后，觀察組治療有效率為75.68%，完全緩解組、部分緩解組、疾病穩(wěn)定組、疾病進展組骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平與MM 患者疾病分期（Ⅰ～Ⅲ期）、預(yù)后（完全緩解及疾病進展）呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其原因為，在對MM 患者臨床治療中，抑制VEGF 生成為主要治療方案，沙利度胺具抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制血管生成的作用，對VEGF 表達具有抑制作用；長春新堿、阿霉素均為作用于細(xì)胞周期的治療藥物，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖分裂，抑制對VEGF 需求，進而可抑制VEGF 表達，因此在治療后會出現(xiàn)VEGF 陽性率、MVD 水平下降情況；但部分患者在治療期間受自身免疫能力、化療耐藥等情況影響，可能會出現(xiàn)VEGF 抑制作用不足等情況，影響病情控制效果[11-12]。因此，在MM 患者化療過程中，若出現(xiàn)VEGF 下降速度緩慢或升高情況，則提示疾病控制不良，需積極開展相關(guān)檢查，并更換治療藥物，以提升治療效果、改善預(yù)后。

綜上所述，MM 患者骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平顯著提升，且疾病分期越高，骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD水平越高；MM 患者接受治療后，骨髓活檢塑料包埋切片中VEGF 陽性率、MVD 水平下降，提示預(yù)后良好，可用于輔助疾病診斷及治療效果評估。