三株新型海參致病菌的分離鑒定及特性分析

許瀟冉，葛長字，張玉群，劉洪展

（1.昌吉州市場監(jiān)督管理局產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，新疆 昌吉 831100；2.山東大學(xué)海洋學(xué)院近海生態(tài)動力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 威海 264209）

仿刺參（Apostichopus japonicus）屬于棘皮動物門（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea）仿刺參屬（Apostichopus），是世界各地海底常見的海洋無脊椎動物。海參作為傳統(tǒng)滋補(bǔ)類海產(chǎn)品，由于其含有大量的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、提高免疫力等多種醫(yī)療保健功能［1，2］，在亞洲受到消費(fèi)者的青睞。仿刺參作為重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在中國、日本、俄羅斯和韓國等亞洲地區(qū)廣泛養(yǎng)殖［3］。自20 世紀(jì)80 年代以來，仿刺參已成為中國海水養(yǎng)殖業(yè)中最大的養(yǎng)殖品種［4］，然而腐皮病的頻發(fā)嚴(yán)重制約了海參健康養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

仿刺參于2017 年7 月購自山東省威海市世昌大道水產(chǎn)批發(fā)市場，在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)過程中，皮膚出現(xiàn)潰爛，引發(fā)較嚴(yán)重的死亡現(xiàn)象?；疾》麓虆⒈憩F(xiàn)出皮膚呈現(xiàn)白色、點(diǎn)狀潰爛、吸附力下降、停止進(jìn)食等現(xiàn)象。本研究將病原菌從仿刺參皮膚潰爛組織分離純化，通過人工回接感染試驗(yàn)驗(yàn)證其致病性，并通過形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16S rRNA 分子鑒定、藥物敏感性分析、生長特性分析等方法對分離菌株進(jìn)行鑒定，以期為仿刺參腐皮病的預(yù)防和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

活體仿刺參購自山東省威海市世昌大道水產(chǎn)批發(fā)市場，體長（6±0.32）cm，重（25±0.60）g，病原菌分離自養(yǎng)殖過程中仿刺參皮膚潰爛病灶組織。實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖仿刺參所用海水取自威海海水浴場，用靜置沉淀48 h 后的天然陳海水養(yǎng)殖仿刺參。暫養(yǎng)條件為溫度（14±2）℃，連續(xù)充氧，每天換海水。

1.2 試驗(yàn)試劑

藥敏片、葡萄球菌生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司，革蘭氏染色試劑盒購自珠海貝索生物有限公司，PCR MasterMix 購自青島派森諾生物科技有限公司，16S rDNA 通用引物27F 和1492R 由青島派森諾生物科技股份有限公司合成。2216E 培養(yǎng)基購自威海新月化玻儀器技術(shù)有限公司。

1.3 病原菌分離純化

取仿刺參腐皮病病灶組織，剪碎后用滅菌磷酸緩沖液懸浮，將懸浮液分別稀釋1、10、100倍，分別涂布于2216E 固體培養(yǎng)平板上。28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取不同形態(tài)的單菌落分別劃線，直到獲得純化的細(xì)菌后挑單菌落于LB 液體培養(yǎng)基搖菌，加50%甘油保菌，存于-20 ℃冰箱中。最后得到3 株優(yōu)勢致病菌，分別命名為WY-8、LY-2 和WY-1。

1.4 人工回接感染試驗(yàn)

富集3種菌液各200 mL，離心棄上清，PBS重懸，得到重懸菌液，測定540 nm 處吸光度，調(diào)整稀釋后注射，注射攻毒數(shù)量級（濃度）為6.72×107CFU/mL，注射后觀察仿刺參未出現(xiàn)吐腸等應(yīng)激行為。

1.5 病原菌種屬特征鑒定

將純化后的單菌落轉(zhuǎn)移至裝有20 μL 去離子水的PCR 小管中，99 ℃破壁20 min。反應(yīng)體系為H2O，21 μL；模板DNA，3 μL；正向引物，3 μL；反向引物，3 μL；Long mix（2×），30 μL。引物序列1492R 為CTACGGCTACCTTGTTACGA 3′，27F 為5′ AGAGTT TGATCCTGGCTCAG 3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃變性，5 min；94 ℃變性，30 s；58 ℃復(fù)性，70 s；72 ℃延伸，45 s；72 ℃延伸，10 min；-20 ℃保存。PCR 結(jié)束后取5 μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，檢測是否有條帶。若有條帶出現(xiàn)，將剩余55 μL PCR產(chǎn)物遞交青島派森諾生物公司進(jìn)行16S rRNA 測序［5，6］。將16S rRNA 測序結(jié)果在NCBI 和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，在EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)序列，用Mega7.0 構(gòu)建Neighnor-joining 系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過Bootstrap 法（1 000 次重復(fù)）檢驗(yàn)［7］。在Genbank中利用Bankit 在線注冊提交，按照提示，獲得3 株致病菌Genbank 序列號。生化鑒定和革蘭氏染色嚴(yán)格按照試劑盒中說明書要求操作。

1.6 病原葡萄球菌特性分析

為研究3 株仿刺參病原葡萄球菌的生長特性，設(shè)置不同的溫度、鹽度、pH 梯度，初始菌液濃度相同的條件下，觀察葡萄球菌的生長狀況，設(shè)置溫度（14、18、21、24、27、30、33、36 ℃）、鹽度（3‰、11‰、19‰、25‰、35‰）、pH（4.5、6.0、6.5、9.0）。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

本研究中抗生素選用依據(jù)：土霉素和四環(huán)素為海洋水產(chǎn)疾病防治中的常用抗生素，配制0.2 mol/L土霉素溶液和0.1 mol/L 四環(huán)素溶液，用0.22 μm 濾器過濾除菌。在超凈工作臺內(nèi)，將菌液稀釋50 倍后分別涂布，再將滅菌的藥敏片分別置于菌液涂布后的2216E 平板上，每個平板4 個藥敏片，每個藥敏片上滴加7 μL 抗生素藥品溶液，使藥品完全浸透藥品片卻不溢出。48 h 后觀察測量抑菌圈直徑大小。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

利用SPSS19.0、MEGA7.0 和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工回接感染

人工回接感染仿刺參染病死亡率的統(tǒng)計情況見表1。由表1 可知，WY-8、LY-2、WY-1 三株菌對仿刺參的致死率分別為81%、63%、54%。再次回接感染后仿刺參染病癥狀與首次自然染病狀態(tài)高度相似，表現(xiàn)為斑點(diǎn)狀潰爛，WY-8 溶血葡萄球菌感染組潰爛較為嚴(yán)重，LY-2 表皮葡萄球菌和WY-1 腐生葡萄球菌感染組癥狀相似，發(fā)生輕微潰爛。將感染后的仿刺參皮膚潰爛組織進(jìn)行細(xì)菌再分離，經(jīng)16S rRNA 分子鑒定，病原與首次分離鑒定的結(jié)果相同，符合柯赫氏法則，因此WY-8、LY-2、WY-1 為仿刺參腐皮病致病菌。

表1 人工回接感染仿刺參染病死亡率

2.2 種屬鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果見表2。由表2 可知，LY-2 可利用蔗糖和尿素，WY-1 可利用果糖、麥芽糖和尿素，WY-8 可利用麥芽糖、甘露醇和尿素，3 株病原菌革蘭氏染色呈陽性。凝膠電泳檢測顯示16S rRNA PCR 產(chǎn)物條帶清晰，將PCR 產(chǎn)物送至青島派森諾生物公司測序，16S rRNA 基因測序質(zhì)量良好。將LY-2、WY-1 和WY-8 的測序序列在NCBI 中分別進(jìn)行比對，與已報道的某些表皮葡萄球菌（S.epidermidis）、腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）、溶血葡萄球菌（S.haemolyticus）的16S rRNA 基因核苷酸同源性≥99%。進(jìn)一步將WY-8、WY-1、LY-2的16S rRNA 測序結(jié)果在EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，分別與模式菌株為MTCC3383（S.haemolyticus）、ATCC15305（S.saprophyticus）、ATCC14990（S.epidermidis）的相似度依次為99.93%、100.00%、98.62%。在EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫 下載序列，用MEGA7.0 構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），由圖1 可知，LY-2與S.epidermidis（ATCC14990）聚為一支，置信度為96；WY-1與S.saprophyticus（ATCC15305）聚為一支，置信度 為100；WY-8與S.haemolyticus（MTCC3383）聚為一支，置信度為99。初步判斷WY-1、WY-8 和LY-2 分別為腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌。在Genbank 中利用Bankit注冊并在線提交序列后，獲得Genbank 注冊號分別 為WY-8，MH 930438；WY-1，MH 930439；LY-2，MH930441。

圖1 菌株WY-1、WY-8、LY-2 在葡萄球菌系統(tǒng)發(fā)育中的地位

表2 生化鑒定結(jié)果

2.3 生長特性分析

2.3.1 時間變化對細(xì)菌生長的影響 如圖2 所示，3株葡萄球菌在24 h 內(nèi)隨時間延長不斷增長，后達(dá)到平臺期，說明時間變化對3 株菌生長均有顯著影響（P＜0.05）。

2.3.2 不同鹽度對細(xì)菌生長的影響 由圖3 可知，鹽度變化對3株葡萄球菌生長有顯著影響（P＜0.05），溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌隨鹽度增長，生長曲線呈不斷下降的趨勢，腐生葡萄球菌隨鹽度增長呈先升高后下降的趨勢。表皮葡萄球菌最適鹽度為3‰；溶血葡萄球菌最適鹽度為3‰；腐生葡萄球菌最適鹽度為19‰。

圖3 不同鹽度對細(xì)菌生長的影響

2.3.3 不同溫度對細(xì)菌生長的影響 由圖4 可知，溫度變化對3株葡萄球菌生長有顯著影響（P＜0.05），隨著溫度升高，3 株葡萄球菌的生長曲線均呈先升高后降低的變化趨勢。腐生葡萄球菌最適生長溫度為36 ℃；表皮葡萄球菌最適生長溫度為33 ℃；溶血葡萄球菌最適生長溫度為33 ℃。

圖4 不同溫度對細(xì)菌生長的影響

2.3.4 不同pH 對細(xì)菌生長的影響 由圖5 可知，pH變化對3 株葡萄球菌生長有顯著影響（P＜0.05），隨著pH 升高，3 株葡萄球菌的生長曲線都呈先升高后降低的趨勢，峰值即最適pH 均為6.0。

圖5 不同pH 對細(xì)菌生長的影響

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由圖6 可知，四環(huán)素處理下，3 株菌的抑菌圈半徑大小依次為溶血葡萄球菌＞腐生葡萄球菌＞表皮葡萄球菌；土霉素處理下，3 株菌的抑菌圈半徑大小依次為溶血葡萄球菌＞表皮葡萄球菌＞腐生葡萄球菌。如圖7 所示，藥敏片周圍的抑菌圈透明度較高，可以看出抗生素對細(xì)菌的生長具有有效的抑制作用。

圖6 不同抗生素對菌株的影響

圖7 四環(huán)素（左）和土霉素（右）對葡萄球菌生長的抑制作用

3 討論

仿刺參養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展引起人們的關(guān)注，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，仿刺參腐皮病現(xiàn)象頻發(fā)。研究報道可引起仿刺參腐皮病的主要致病微生物有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）［8］、燦爛弧菌（Vibrio splendidus）［9，10］、假互單胞菌（Pseudomonassp.）［11］、病毒（Viruses）［12］、希瓦氏菌（Shewanella）［13］和乳球菌（Lactococcus garviaeae）［14］。

本研究從仿刺參皮膚潰爛組織中分離得到的3株優(yōu)勢致病菌，通過人工回接感染試驗(yàn)，3 株菌確定為仿刺參腐皮病致病菌，具備較強(qiáng)的致病力。人工回接感染后染病癥狀與自然狀態(tài)相似。經(jīng)16S rRNA 測序及構(gòu)建Neighnor-joining 系統(tǒng)發(fā)育樹、生化鑒定等方法，將WY-8、WY-1、LY-2 三株病原菌鑒定為溶血葡萄球菌（MH930438）、腐生葡萄球菌（MH930439）和表皮葡萄球菌（MH930441）。Alonso等［15］研究表明，葡萄球菌具有高發(fā)病率和死亡率，是威脅很多水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的致病菌。Sugita等［16］首次從魚類中分離出葡萄球菌，此后有學(xué)者分別從籠養(yǎng)羅非魚和珊瑚病灶組織中分離得到葡萄球菌［17，18］。國內(nèi)研究報道，在草魚［19］、南美白對蝦［20］、血鸚鵡魚［21］等也發(fā)現(xiàn)了葡萄球菌。研究人員用魚源葡萄球菌感染的斑馬魚和金魚主要病癥是鰓充血出血、內(nèi)臟出血、腸潰爛、游泳異常等［19，22］?；疾⊙W鵡魚主要病癥為不游動，腹腔少量積液，肝臟發(fā)白，腮部發(fā)白［21］。

從生長特性分析結(jié)果和藥敏試驗(yàn)來看，3 株病原葡萄球菌在高溫33 ℃、pH 6.0、低鹽（鹽度3‰和19‰）的條件下更適宜生長，3 株致病菌不具備海洋細(xì)菌常見的噬鹽性［23-25］。海洋水產(chǎn)中常用的抗生素四環(huán)素和土霉素對3 株病原葡萄球菌均有一定的抑制作用。葡萄球菌感染多見于人類臨床醫(yī)學(xué)，國內(nèi)外已有研究中未見葡萄球菌引發(fā)仿刺參腐皮病的報道，本研究首次報道葡萄球菌可感染人工養(yǎng)殖的仿刺參。

本研究中病原葡萄球菌可能來自人工運(yùn)輸途中［26］、人工添加的餌料當(dāng)中［27］或是因?yàn)榭股氐倪^度使用破壞正常菌群從而導(dǎo)致機(jī)會性葡萄球菌的感染［17］。因此，對仿刺參腐皮病的防治可適當(dāng)減少抗生素的使用，更多關(guān)注益生菌［27，28］或者免疫活性物質(zhì)［29］的應(yīng)用。3 株新型葡萄球菌屬仿刺參腐皮病病原菌的分類鑒定及特性分析，可以為腐皮病發(fā)病機(jī)制的深入研究提供一定的理論支持，以期為養(yǎng)殖仿刺參腐皮病的防治提供新思路。