抗犬皮膚病主要病原菌細(xì)菌素的篩選及其生物學(xué)特性研究

孟雨晴，張 涵，徐菁岐，莊科勤，盧殿杰，董文龍

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 132109）

犬細(xì)菌性皮膚病又稱膿皮癥，常發(fā)生在頭部、面部和四肢等部位，患處皮膚常有發(fā)紅、脫毛、結(jié)痂等癥狀，并伴有膿性皰疹、表皮增厚等現(xiàn)象，主要由偽中間型葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）等病原菌引起[1-2]。大部分寵物的細(xì)菌性皮膚病是一種人畜共患病，易在社區(qū)內(nèi)傳播[3]。針對寵物犬細(xì)菌性皮膚病，臨床上多用抗生素進行治療，抗生素的濫用加速了犬源多重耐藥菌株的出現(xiàn)[4-5]。針對目前病原菌株耐藥水平不斷提升的情況，積極篩選新型替抗產(chǎn)品具有重要的意義。

細(xì)菌素是細(xì)菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的有抑菌能力的多肽或前體肽，通過抑制肽聚糖合成、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、與核糖體或tRNA相互作用抑制蛋白質(zhì)合成等方式起到抑菌效果[6]。研究表明，大多數(shù)細(xì)菌素只能作用于與細(xì)菌同種不同株的細(xì)菌以及與它同源性高的細(xì)菌[7]。本研究旨在篩選出能抗犬皮膚病主要病原菌的細(xì)菌素，并對其生物學(xué)特性進行研究，為開發(fā)新型替抗產(chǎn)品用于犬細(xì)菌性皮膚病的治療奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 供試泡菜購于吉林市某市場。

1.1.2 菌株來源 標(biāo)準(zhǔn)株：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922。臨床分離株：金黃色葡萄球菌S4（犬源）、金黃色葡萄球菌S5（犬源）、綠膿桿菌L1（犬源）、偽中間型葡萄球菌D1（犬源）、大腸桿菌E4（犬源）、大腸桿菌E5（犬源），以上臨床分離菌株均具有多重耐藥性。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化 取適量泡菜置于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。吸取0.1 mL渾濁菌液至MRS平板上，涂布均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取菌落形態(tài)不一的單菌落，接種于MRS平板劃線純化，直至鏡檢形態(tài)單一為止。將純化后的菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)24 h，甘油保菌，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌素乳酸菌的初篩 將分離純化得到的乳酸菌以1:300的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱增殖培養(yǎng)24 h，室溫下10 000 r/min離心15 min后收集上清液，使用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，4 ℃保藏。

采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗：將50 μL濃度調(diào)節(jié)至OD600 ≈0.5的指示菌金黃色葡萄球菌ATCC25923涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上，用牛津杯在固體培養(yǎng)基上打孔（孔徑≈8 mm），無菌發(fā)酵上清液作為試驗組（每孔加入200 μL），無菌MRS肉湯培養(yǎng)基作為對照組（每孔加入200 μL），靜止1 h后，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.3 酸性物質(zhì)抑菌活性排除試驗和過氧化氫排除試驗 為排除過氧化氫對LP-3發(fā)酵上清液抗菌活性的干擾，取1 mL發(fā)酵上清液，用乳酸、氫氧化鈉將其pH調(diào)至過氧化氫酶的最適pH（pH=7.0），以最終濃度為0.1 mg/mL的量加入過氧化氫酶，置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴2 h，再將其pH調(diào)至初始狀態(tài)，以未進行過氧化氫酶處理的上清液為對照組。以金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌，采用瓊脂擴散法對其抗菌活性進行檢測。

為排除有機酸對LP-3發(fā)酵上清液抗菌活性的干擾，取5 mL發(fā)酵上清液，用乳酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH至5.0，以無菌MRS液體培養(yǎng)基（調(diào)節(jié)pH至5.0）為對照組。以金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌，采用瓊脂擴散法對其抗菌活性進行檢測。

1.2.4 16S rRNA基因序列測定 用基因組試劑盒提取DNA，PCR擴增引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物，引物序列為：

16S rRNA-F：5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

16S rRNA-R：5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'。

16S rRNA PCR產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，其切膠純化產(chǎn)物送往生工生物工程（長春）股份有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源比對[8]。

1.2.5 LP-3分泌細(xì)菌素的生物學(xué)特性測定 （1）酶對細(xì)菌素的影響：菌株發(fā)酵上清液的pH調(diào)至胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的最適pH（分別為7.4、7.4、6.0、2.0），加入1.0 mg/mL的酶37 ℃恒溫水浴4 h，沸水5 min使各酶的活性喪失，再將pH調(diào)回至5.0進行抑菌試驗，以未處理發(fā)酵液作對照[9]。（2）溫度對細(xì)菌素的影響：將菌株發(fā)酵上清液的pH調(diào)至5.0分為四組，分別在60、80、100 ℃條件下水浴30 min以及121 ℃條件下水浴15 min，同時以未經(jīng)溫度處理的菌株上清液作為對照組，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗[10]。（3）pH對細(xì)菌素的影響：用1 mol/L 氫氧化鈉和1 mol/L乳酸將菌株發(fā)酵上清液的pH調(diào)至4.0、6.0、7.0、9.0靜止1 h，再將其調(diào)回初始pH，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗。（4）抑菌譜的測定：取-80 ℃所儲存指示菌（8株）復(fù)蘇活化，接種到適宜液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，濃度調(diào)至OD600 ≈0.5，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，記錄抑菌圈直徑，以期確定菌株的抑菌譜。

以上所有抑菌試驗均重復(fù)3次，抑菌圈測量3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及其細(xì)菌素的初篩

從泡菜中分離出三種乳酸菌，通過抑菌試驗篩選出一株乳酸菌（LP-3）的無菌發(fā)酵上清液對犬細(xì)菌性皮膚病的主要病原菌具有抑菌作用。LP-3在MRS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后形成白色突起小型菌落，菌落邊緣整齊，表面光滑，不透明，見圖1。通過對菌株LP-3進行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，該菌株為革蘭氏陽性，菌體呈桿狀，無芽孢，見圖2。

圖1 LP-3菌落形態(tài)

圖2 LP-3的革蘭氏染色鏡檢圖（1 000×）

2.2 細(xì)菌素的酸性物質(zhì)排除試驗和過氧化氫排除試驗

經(jīng)試驗測定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=5.0時，菌株發(fā)酵上清液對指示菌金黃色葡萄球菌ATCC25923抑菌效果良好；用乳酸調(diào)節(jié)與發(fā)酵上清液pH相同的MRS肉湯，抑制金黃色葡萄球菌ATCC25923生長繁殖的效果不明顯。用過氧化氫酶處理后的上清液與對照組抑制效果相同。試驗結(jié)果表明，LP-3發(fā)酵上清液對指示菌所表現(xiàn)的抑菌作用，不是乳酸和過氧化氫作用的結(jié)果。

2.3 16S rRNA測序結(jié)果

用細(xì)菌16S rRNA的通用引物對此菌進行DNA擴增，獲得大小為1 474 bp左右的片段，見圖3，經(jīng)測序后分析比對，顯示LP-3與平房乳桿菌（Lactiplantibacillus pingfangensis）的同源性為97.98%。

圖3 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.4 細(xì)菌素穩(wěn)定性的測定

由表1可知，LP-3所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性，隨溫度的升高細(xì)菌素對指示菌的抑菌能力雖逐漸降低，但對指示菌仍有較強的抑菌活性。在pH＝4時，細(xì)菌素對指示菌均具有抑菌活性，隨pH的升高對指示菌的抑菌能力逐漸降低，表明細(xì)菌素在酸性環(huán)境中活性較強。LP-3的發(fā)酵上清液對蛋白酶K敏感，而細(xì)菌素為一類有抑菌能力的多肽或前體肽，說明LP-3發(fā)酵液中的抑菌成分是一種細(xì)菌素。

表1 溫度、pH、蛋白酶對細(xì)菌素活性的影響

2.5 抑菌譜

由表2可知，LP-3細(xì)菌素對犬皮膚病主要病原菌（金黃色葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌）均有不同程度的抗菌作用。LP-3細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株、犬皮膚病臨床分離株的抑菌效果最好，抑菌圈直徑≥30 mm。

表2 細(xì)菌素的抑菌譜

3 討 論

犬細(xì)菌性皮膚病的主要病原菌為金黃色葡萄球菌、偽中間葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌，此類致病菌在寵物源致病菌中耐藥水平不斷提升，給犬細(xì)菌性皮膚病的治療造成極大的困難。Chai等[11]從寵物及寵物主人身上分離出的金黃色葡萄球菌，其中39.4%的金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出多重耐藥的趨勢，對青霉素的耐藥率高達72.7%，對其他抗生素也表現(xiàn)出不同程度的耐藥。施永超[12]從患膿皮癥的犬中分離出18株偽中間型葡萄球菌進行藥物敏感性試驗與耐藥基因攜帶情況檢測發(fā)現(xiàn)，其中有55 %的分離株對青霉素高度耐藥，其次為四環(huán)素類與大環(huán)內(nèi)脂類藥物，耐藥率均在30 %以上，18株偽中間型葡萄球菌均攜帶耐藥基因，其中有10株分離株含有aacAaphD。何玉菲[13]分離出的偽中間葡萄球菌對氨芐西林和羅紅霉素的耐藥性較高，可達65.57 %和65.30%。Dégi等[14]在犬淺層表皮分離出58株綠膿桿菌，其中有31株對頭孢他啶耐藥，有30株對氨曲南耐藥。致病性大腸桿菌可通過呼吸道和消化道在狗群中傳播，造成犬大腸桿菌病。患病的犬糞便常為稀便，會污染肛門、尾巴及后腿部位[15]。臨床上多用抗生素治療犬細(xì)菌性皮膚病，犬源性致病菌的耐藥性逐年提升，為此尋找抗生素的替代品刻不容緩。

乳酸菌是一種普遍認(rèn)為安全的常見微生物，容易獲得且易于分離純化。乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性和對酸、鹽、酶的耐受性[16]。乳酸菌細(xì)菌素還具有高效、廣譜、安全等優(yōu)點，能有效抑制致病菌和腐敗菌[17]。目前國內(nèi)外對細(xì)菌素的研究尚處于初級階段，對寵物的致病菌進行細(xì)菌素抑菌試驗本試驗尚屬首次。本研究從吉林省的自制泡菜中分離出一株能產(chǎn)細(xì)菌素的平房乳桿菌（LP-3），研究發(fā)現(xiàn)LP-3抑菌譜較廣，對犬皮膚病主要病原菌（金黃色葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、綠膿桿菌）均有不同程度的抗菌作用。LP-3的抑菌物質(zhì)在酸性環(huán)境中活性較強，隨pH的升高對指示菌的抑菌能力逐漸降低，這與任世英等[18]的研究結(jié)果相似，說明在高pH值下抑菌活性丟失，可能是由于pH變化會使抑菌物質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起抑菌活性降低甚至消失；本研究中LP-3的抑菌物質(zhì)，與張君超等[19]對植物乳桿菌的研究結(jié)果相似，可見其乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素在蛋白酶K等作用后水解失去全部活性，表明其具有蛋白質(zhì)特性。根據(jù)排酸、排過氧化氫、蛋白酶實驗LP-3發(fā)酵上清除了酸和過氧化氫，還有其它抑菌物質(zhì)，并且具有蛋白特性，因此本研究中的抑菌物質(zhì)初步判定為細(xì)菌素。菌株LP-3豐富了產(chǎn)細(xì)菌素菌株資源，為研究防治犬細(xì)菌性皮膚病的新型藥物奠定基礎(chǔ)，并有著廣闊的應(yīng)用前景。