miR-499a-5p靶向調(diào)控CDKN1A基因在心肌細(xì)胞肥大中的作用機(jī)制研究

牟寒霜,黃 震,郭 婧

心肌肥大主要是心臟對(duì)各種應(yīng)激的生理代償性反應(yīng),表現(xiàn)為收縮蛋白表達(dá)增加和心肌細(xì)胞體積增大。盡管近年來(lái)在心肌肥大功能方面的研究取得了較大進(jìn)展,但潛在的分子機(jī)制仍不明確[1]。越來(lái)越多的研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)在很大程度上與多種人類(lèi)疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),包括心肌肥大[2-3]。miRNA是一類(lèi)非編碼RNA,長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸,其主要在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮翻譯抑制作用或使mRNA降解以調(diào)節(jié)基因表達(dá)并影響多種病理生理過(guò)程。有研究顯示,miR-499a-5p在心肌缺血再灌注損傷和急性心肌梗死中發(fā)揮重要作用[4-5]。miR-499a-5p可能是介導(dǎo)心臟功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[6]。然而,miR-499a-5p在心肌肥大中的作用尚不明確。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)屬于Cip/Kip家族,在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道,CDKN1A的過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞逃避細(xì)胞周期阻滯、衰老和凋亡[7];且CDKN1A與病毒性心肌炎、心肌發(fā)育以及肥厚型心肌病相關(guān)[8]。本研究探討miR-499a-5p在心肌肥大中的作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9c2(美國(guó)HyClone公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)(美國(guó)Sigma公司);CDKN1A、Cleaved Caspase-3、心鈉肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)單抗及二抗(美國(guó)CST公司);AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(大連寶生物工程有限公司);TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒(賽默飛世爾);miR-499a-5p mimics和mimics control(上海吉瑪制藥)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson);熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(北京全式金生物)。

1.2 H9c2細(xì)胞培養(yǎng) 心肌細(xì)胞H9c2培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中,于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1～2 d更換1次新的培養(yǎng)液。待H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)到80%以上時(shí)加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞,采用胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。

1.3 H9c2細(xì)胞分組和處理 H9c2細(xì)胞以胰蛋白酶消化后接種到24孔板中,加入新的培養(yǎng)液,于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),24 h后更換含1%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞同步化處理。將H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照(Con)組、細(xì)胞肥大模型(AngⅡ)組、轉(zhuǎn)染對(duì)照(AngⅡ+miR-NC)組和轉(zhuǎn)染(AngⅡ+miR-499a-5p)組。其中,AngⅡ組H9c2細(xì)胞經(jīng)1 μmol/L的AngⅡ刺激48 h構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型[9];AngⅡ+miR-NC組和AngⅡ+miR-499a-5p組H9c2細(xì)胞分別經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染mimics control或miR-499a-5p mimics,具體操作參照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,轉(zhuǎn)染后采用1 μmol/L的AngⅡ刺激48 h。Con組H9c2細(xì)胞未行任何處理。

1.4 H9c2細(xì)胞表面積的測(cè)定 采用熒光顯微鏡觀察測(cè)定各組H9c2細(xì)胞的橫截面,使用Image J軟件分析細(xì)胞橫截面積,計(jì)算心肌細(xì)胞表面積[9]。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-499a-5p的表達(dá)水平 H9c2細(xì)胞經(jīng)分組處理后,使用TRIzol試劑分別抽提各組H9c2細(xì)胞中總RNA,分析RNA的濃度和純度,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA,調(diào)整cDNA的濃度,并以其為模板,使用qRT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min,隨后循環(huán)40次,95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s。反應(yīng)結(jié)束后分析曲線,以U6為內(nèi)參,采用2-△△Ct法分析各組H9c2細(xì)胞中miR-499a-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 CCK-8檢測(cè)H9c2細(xì)胞活力 H9c2細(xì)胞以6×103個(gè)/孔種植到96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng),按照上述1.3的方法分組處理,同時(shí)設(shè)置不加細(xì)胞的空白調(diào)零孔組,向每孔中添加CCK-8溶液,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450 nm處吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白調(diào)零組OD值)×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡率 H9c2細(xì)胞以1×106個(gè)/孔種植到6孔板中,按照上述1.3的方法分組處理后,除去細(xì)胞培養(yǎng)液,以PBS洗滌,收集各組H9c2細(xì)胞,使用AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒添加檢測(cè)試劑,使用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組H9c2細(xì)胞凋亡率。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 分別收集處理后各組H9c2細(xì)胞,加入適量裂解液,于冰上裂解后提取蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。蛋白與上樣緩沖液混勻并于沸水至加熱使蛋白變性,將等量蛋白上樣行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),隨后電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,將膜置于5%脫脂奶粉中封阻2 h,洗膜后加入1∶800稀釋的一抗,于4 ℃過(guò)夜,次日再加入1∶3 000稀釋的二抗,在室溫下孵育2 h,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行顯影,使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,以GAPDH作內(nèi)參,使用Image J軟件分析灰度值,分別計(jì)算H9c2細(xì)胞中CDKN1A、Cleaved Caspase-3、ANP、BNP和β-MHC蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 靶基因預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 使用TargetScan預(yù)測(cè)和分析miR-499a-5p與CDKN1A的結(jié)合位點(diǎn)。將含有與miR-499a-5p互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT)CDKN1A序列和突變型(MUT)CDKN1A序列構(gòu)建至pmirGLO載體上,形成CDKN1A的野生型和突變型報(bào)告載體。將H9c2細(xì)胞(4×105個(gè)/孔)接種至6孔板上,使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將CDKN1A-WT和CDKN1A-MUT分別與mimics control或miR-499a-5p mimics共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,并分為mimics control和CDKN1A-WT共轉(zhuǎn)染組、miR-499a-5p mimics和CDKN1A-WT共轉(zhuǎn)染組、mimics control和CDKN1A-MUT共轉(zhuǎn)染組、miR-499a-5p mimics和CDKN1A-MUT共轉(zhuǎn)染組,48 h后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 各組H9c2細(xì)胞中miR-499a-5p和CDKN1A蛋白表達(dá)水平比較 與Con 組比較,AngⅡ組H9c2細(xì)胞中miR-499a-5p的表達(dá)水平明顯降低,而CDKN1A蛋白的表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組比較,AngⅡ+miR-499a-5p組H9c2細(xì)胞中miR-499a-5p的表達(dá)水平明顯升高,而CDKN1A蛋白的表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組比較,miR-499a-5p和CDKN1A蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。

圖1 H9c2細(xì)胞中CDKN1A蛋白表達(dá)條帶圖

表1 各組H9c2細(xì)胞中miR-499a-5p和CDKN1A蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.2 各組H9c2細(xì)胞肥大相關(guān)指標(biāo)比較 與Con組比較,AngⅡ組細(xì)胞表面積及ANP、BNP和β-MHC蛋白表達(dá)水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組比較,AngⅡ+miR-499a-5p組細(xì)胞表面積及ANP、BNP、β-MHC蛋白表達(dá)水平均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組比較,細(xì)胞表面積及ANP、BNP、β-MHC表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組H9c2細(xì)胞中ANP、BNP和β-MHC蛋白表達(dá)條帶圖

表2 各組細(xì)胞表面積及ANP、BNP、β-MHC蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.3 各組H9c2細(xì)胞活力比較 與Con 組比較,AngⅡ組H9c2細(xì)胞活力明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組比較,AngⅡ+miR-499a-5p組H9c2細(xì)胞活力明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組H9c2細(xì)胞活力比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組H9c2細(xì)胞活力比較(±s) 單位:%

2.4 各組H9c2細(xì)胞凋亡情況比較 與Con 組比較,AngⅡ組H9c2細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組比較,AngⅡ+miR-499a-5p組H9c2細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AngⅡ組和AngⅡ+miR-NC組比較,H9c2細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4、表4。

圖3 各組H9c2細(xì)胞凋亡流式圖

圖4 各組H9c2細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組H9c2細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.5 miR-499a-5p靶基因檢測(cè) 生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miR-499a-5p和CDKN1A存在特異性結(jié)合位點(diǎn),提示CDKN1A可能是miR-499a-5p的一個(gè)靶基因。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與mimics control+CDKN1A-WT組比較,miR-499a-5p mimics+CDKN1A-WT組H9c2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性降低了約78%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與mimics control+CDKN1A-MUT組比較,miR-499a-5p mimics+CDKN1A-MUT組H9c2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。詳見(jiàn)圖5、表5。

圖5 TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-499a-5p和CDKN1A結(jié)合位點(diǎn)示意圖

表5 各組H9c2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性比較(±s)

3 討 論

雖然成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞已分化并停止增殖,但心肌組織仍具有可塑性,并可能發(fā)生重構(gòu)(如肥大)。肥大過(guò)程是心肌細(xì)胞對(duì)肥大刺激的適應(yīng)性反應(yīng),使心臟維持正常功能。生理性心肌肥大是可逆的,心臟表現(xiàn)為正常的形態(tài)即心肌細(xì)胞無(wú)纖維化或細(xì)胞凋亡。然而,持續(xù)的肥大刺激通常會(huì)導(dǎo)致不可逆的心肌肥大和心功能不全,被認(rèn)為是病理性心肌肥大。病理性心肌肥大發(fā)生在疾病(如高血壓、局部缺血和心肌炎等)的環(huán)境中,并與間質(zhì)纖維化、細(xì)胞死亡和心臟功能障礙增加有關(guān)[10]。病理性心肌肥大是心力衰竭的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[11]。研究表明,miRNA在心血管疾病(包括心肌肥大)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如,miR-26a-5p在體外抑制糖原合酶激酶3β(3GSK3β)表達(dá),促進(jìn)心肌肥大[12]。miRNA-26b通過(guò)靶向CDK6進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞肥大[13]。雖然miRNA參與了心肌肥大的發(fā)生,但大多數(shù)miRNA參與心肌肥大的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。miR-499a-5p可以抑制癌癥的進(jìn)展,例如miR-499a-5p通過(guò)靶向VAV鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子3(VAV3)抑制子宮內(nèi)膜癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[14];miR-499a-5p通過(guò)靶向真核細(xì)胞翻譯起始因子(eIF4E)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性[15]。此外,已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn),miR-499a-5p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)加重脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[16]。miR-499a-5p還與心血管疾病相關(guān),例如miR-499a-5p可通過(guò)下調(diào)Caspase-3并上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)抑制心肌細(xì)胞的凋亡[17]。一項(xiàng)研究表明,心肌梗死時(shí)釋放的miR-499通過(guò)靶向α7煙堿乙酰膽堿受體(α7-nAchR)引起內(nèi)皮損傷[18]。另一項(xiàng)研究顯示,miR-499通過(guò)SRY盒轉(zhuǎn)錄因子6(Sox6)和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)調(diào)節(jié)晚期心臟分化過(guò)程中的細(xì)胞增殖和凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,miR-499a-5p通過(guò)靶向Kirsten鼠肉瘤基因CDKN1A對(duì)心肌細(xì)胞肥大發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞表面積明顯增大,細(xì)胞肥大標(biāo)志蛋白ANP、BNP和β-MHC的表達(dá)明顯升高,細(xì)胞活力明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高,且與凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的表達(dá)亦明顯上調(diào),表明AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。而過(guò)表達(dá)miR-499a-5p能夠減少細(xì)胞表面積的增加,降低ANP、BNP和β-MHC蛋白的表達(dá),細(xì)胞活力升高,凋亡減少,這表明過(guò)表達(dá)miR-499a-5p能夠有效抑制心肌細(xì)胞肥大。此外,本研究發(fā)現(xiàn),CDKN1A是miR-499a-5p的直接靶基因。本研究使用在線工具TargetScan預(yù)測(cè)miR-29b-3p的潛在靶基因之一CDKN1A的結(jié)合位點(diǎn),并驗(yàn)證了二者之間的相互作用。CDKN1A在人類(lèi)多種癌癥中異常表達(dá),且有研究顯示其介導(dǎo)心血管疾病[20-22]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞源性外體microRNA-98-5p通過(guò)靶向CDKN1A促進(jìn)卵巢癌順鉑耐藥[23]。有研究數(shù)據(jù)表明,CDKN1A在晚期KRAS突變的非小細(xì)胞肺癌中對(duì)順鉑-培美曲塞聯(lián)合治療的反應(yīng)中起作用,因此其可作為一項(xiàng)預(yù)測(cè)標(biāo)志物[21]。全基因組關(guān)聯(lián)和孟德?tīng)栯S機(jī)分析發(fā)現(xiàn),CDKN1A參與心力衰竭的發(fā)病機(jī)制[24]。本研究發(fā)現(xiàn),在AngⅡ刺激下H9c2細(xì)胞中miR-499a-5p對(duì)CDKN1A的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用,提示miR-499a-5p通過(guò)調(diào)節(jié)CDKN1A參與心肌肥大。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,miR-499a-5p在AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中明顯下調(diào),而CDKN1A的表達(dá)明顯上調(diào)。過(guò)表達(dá)miR-499a-5p能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大,其作用機(jī)制與靶向抑制CDKN1A的表達(dá)有關(guān)。本研究揭示了miR-499a-5p與心肌肥大的關(guān)系,提示miR-499a-5p可能是治療心肌肥大的潛在有效靶點(diǎn)。