lncRNA RMST靶向miR-224-3p調(diào)控缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷

李 悅,郝艷麗,吳 濤

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是一種常見的心血管疾病,其特征為心肌組織血液供應減少,血液供應恢復導致缺血組織的繼發(fā)性損傷[1]。目前,I/R損傷是導致缺血性心臟病病人高死亡率的重要原因。I/R損傷機制復雜,其中細胞內(nèi)過度的氧化應激反應與細胞凋亡相關,對心肌組織損傷細胞的結(jié)構(gòu)和功能有直接影響[2]。因此,提高心肌細胞抗氧化反應能力、減輕細胞凋亡可能是預防I/R損傷的有效方法。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類長度超過200個核苷酸的新型非編碼RNA,其通過在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,參與自噬、氧化應激損傷、凋亡等多種病理過程[3-5]。研究表明,神經(jīng)元細胞HT-22糖氧剝奪損傷模型中l(wèi)ncRNA橫紋肌肉瘤相關轉(zhuǎn)錄物-2(rhabdomyosarcoma 2-associated transcript,RMST)表達上調(diào),抑制lncRNA RMST表達可提高HT-22細胞存活率,減輕糖氧剝奪誘導的細胞凋亡[6]。lncRNA RMST表達下調(diào)還可抑制小膠質(zhì)細胞活化,降低炎癥反應,減輕神經(jīng)元細胞損傷[7]。序列分析發(fā)現(xiàn),miR-224-3p含有l(wèi)ncRNA RMST結(jié)合位點,miR-224-3p可抑制糖氧剝奪誘導的原代神經(jīng)元細胞氧化應激損傷和凋亡,對腦I/R損傷具有保護作用[8]。然而lncRNA RMST、miR-224-3p在心肌細胞I/R損傷中的作用機制尚不明確。因此,本研究建立缺氧復氧(H/R)細胞模型,探討lncRNA RMST和miR-224-3p在心肌損傷中的作用,以期為防治心肌I/R損傷提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人心肌細胞株(HCM)購于中國科學院上海細胞庫;DMEM培養(yǎng)液、Lipofectamine 3000、TRizol試劑、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司;胎牛血清購于杭州四季青公司;青鏈霉素雙抗溶液、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)活性檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司;miR-224-3p模擬物(miR-224-3p mimics)、模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-224-3p抑制物(anti-miR-224-3p)、抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、RMST小干擾RNA(si-RMST)、陰性對照序列(si-NC)以及雙熒光素酶報告載體均由上海吉瑪制藥公司提供;逆轉(zhuǎn)錄酶、2×SYBR Green master mix購于大連Takara生物公司;膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)購于上海鈺博生物公司;兔B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma -2,Bcl-2)多克隆抗體、兔Bcl相關X蛋白(Bcl associated X protein,Bax)單克隆抗體、兔磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購于上海碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建心肌細胞H/R模型 HCM細胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中,當細胞融合度為80%時,0.25%的胰酶消化后進行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)期心肌細胞用于后續(xù)實驗。參照梁冰等[9]的方法構(gòu)建H/R模型。缺氧處理前將細胞培養(yǎng)液中通入5%CO2、95%N2使其成為缺氧培養(yǎng)液。將細胞置于缺氧培養(yǎng)箱(含5%CO2、95%N2)中37 ℃培養(yǎng)3 h,然后更換為新鮮培養(yǎng)液,置于常規(guī)細胞培養(yǎng)箱(含5%CO2、95%空氣)中37 ℃培養(yǎng)3 h。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組 轉(zhuǎn)染前1 d,取2×105個對數(shù)期HCM細胞接種于24孔板;轉(zhuǎn)染當天,用50 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋待轉(zhuǎn)染的序列片段,并輕輕混勻,室溫靜置5 min;用50 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000,室溫靜置5 min;將Lipofectamine 3000和待轉(zhuǎn)染序列片段的稀釋液混合,室溫靜置20 min。將上述混合液加到培養(yǎng)板各孔內(nèi),培養(yǎng)6～8 h后更換為新鮮培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)染48 h時收集細胞進行H/R處理。根據(jù)轉(zhuǎn)染序列片段不同分為H/R+si-NC組、H/R+si-RMST組、H/R+miR-NC組、H/R+miR-224-3p mimics組、H/R+si-RMST+anti-miR-NC組、H/R+si-RMST+anti-miR-224-3p組。正常培養(yǎng)的HCM細胞作為對照組,H/R模型細胞作為H/R模型組。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNA RMST和miR-224-3p相對表達量 使用TRizol試劑從各組細胞中分離總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄酶、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將cDNA稀釋20倍作為擴增模板。配制20 μL反應體系,包括2×SYBR Green master mix 10 μL、cDNA模板2 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL,補加雙蒸水至20 μL。擴增條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共循環(huán)40次。RMST正向引物5′-AGCAATGCATTCTTTCACATGG-3′,反向引物5′-ATGCAATTTCGGTGGTTGGC-3′;GAPDH正向引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′,反向引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′;miR-224-3p正向引物5′-AGTCTCTGGCTGAC TACATCACAG-3′,反向引物5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′;U6正向引物5′-CCCTGGCACCCAGCAC-3′,反向引物5′-GCCGATCCACACGGAGTAC-3′。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 胰蛋白酶消化各組細胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次后,用1×結(jié)合緩沖液重懸細胞獲得細胞密度為1×106個/mL的細胞懸液。取100 μL細胞懸液,分別加入5 μL Annexin V-FITC,充分混勻,避光孵育15 min,再加入5 μL PI,室溫避光孵育5 min,補加1×結(jié)合緩沖液390 μL?；靹蚝?立即上機檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)法檢測細胞活力 每組取5×106個HCM細胞接種于96孔板,培養(yǎng)48 h后向各孔內(nèi)加入CCK-8溶液10 μL,室溫反應2 h,酶標儀檢測450 nm處各孔的光密度值(OD)。存活率=實驗組OD/對照組OD。

1.2.6 MDA含量、SOD和GSH-Px活性及LDH釋放量檢測 HCM細胞處理完畢后,分別收集細胞培養(yǎng)液上清和細胞。LDH檢測試劑盒分析培養(yǎng)液上清中LDH活性。取各組HCM細胞,采用細胞裂解液冰上裂解30 min,4 ℃離心機12 000 r/min離心15 min,收集上清液,按照試劑盒說明書檢測MDA含量、SOD和GSH-Px活性,嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)檢測Bcl-2和Bax蛋白相對表達量 RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白,隨后進行蛋白定量。取適量蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合均勻100 ℃煮5 min至蛋白變性。冷卻至室溫后,取30 μg蛋白上樣至各加樣孔進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。當溴酚藍移至凝膠底部時終止電泳。利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置進行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜。用1∶1 000稀釋的一抗溶液室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min;用1∶1 000稀釋的二抗溶液室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。用化學發(fā)光顯色試劑進行顯影,曝光后,圖像處理軟件進行灰度分析,結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將含有miR-224-3p結(jié)合位點的lncRNA RMST野生型(WT)序列或突變型(MUT)序列克隆到熒光素酶報告質(zhì)粒,獲得雙熒光素酶報告載體WT-RMST、MUT-RMST。參照1.2.2步驟將WT-RMST、MUT-RMST分別與miR-224-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染心肌細胞,48 h后收集細胞并測定相對熒光素酶活性。同時分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-RMST、si-NC、si-RMST至心肌細胞,48 h后按照RT-qPCR步驟測定miR-224-3p相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA RMST和miR-224-3p在H/R誘導的心肌細胞損傷中的表達 與對照組比較,H/R模型組心肌細胞中l(wèi)ncRNA RMST表達明顯升高,miR-224-3p表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 lncRNA RMST和miR-224-3p在H/R誘導的心肌細胞損傷中的表達(±s)

2.2 抑制lncRNA RMST表達對H/R誘導的心肌細胞氧化應激和細胞存活的影響 與對照組比較,H/R模型組心肌細胞RMST表達、MDA含量、LDH釋放量明顯升高,SOD、GSH-Px活性、細胞存活率明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與H/R+si-NC組比較,H/R+si-RMST組心肌細胞RMST表達、MDA含量、LDH釋放量明顯降低,SOD、GSH-Px活性、細胞存活率明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 抑制lncRNA RMST表達對H/R誘導的心肌細胞氧化應激和細胞存活的影響(±s)

2.3 抑制lncRNA RMST表達對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響 與對照組比較,H/R模型組心肌細胞凋亡率、Bax蛋白表達明顯升高,Bcl-2蛋白表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與H/R+si-NC組比較,H/R+si-RMST組心肌細胞凋亡率、Bax蛋白表達明顯降低,Bcl-2蛋白表達明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖1、圖2。

表3 抑制lncRNA RMST表達對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響(±s)

圖1 凋亡相關蛋白表達條帶圖

圖2 細胞凋亡流式圖

2.4 lncRNA RMST靶向調(diào)控miR-224-3p的表達 LncBase Predicted v.2數(shù)據(jù)庫在線分析顯示,lncRNA RMST含有與miR-224-3p互補的核苷酸序列(見圖3)。雙熒光素酶報告實驗顯示,miR-224-3p mimics和WT-RMST共轉(zhuǎn)染組心肌細胞的相對熒光素酶活性較miR-NC和WT-RMST共轉(zhuǎn)染組明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而miR-224-3p mimics和MUT-RMST共轉(zhuǎn)染組心肌細胞的相對熒光素酶活性與miR-NC和MUT-RMST共轉(zhuǎn)染組比較無明顯變化。RT-qPCR檢測顯示,pcDNA-RMST組心肌細胞miR-224-3p表達較pcDNA組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);si-RMST組心肌細胞miR-224-3p表達較si-NC組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4、表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果(±s)

表5 lncRNA RMST調(diào)控miR-224-3p的表達(±s)

2.5 miR-224-3p過表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的影響 與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-224-3p組miR-224-3p的表達水平明顯升高,細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量、LDH釋放量明顯降低,Bcl-2蛋白表達、SOD和GSH-Px活性、細胞存活率明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表6、圖4、圖5。

表6 miR-224-3p過表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的影響(±s)

圖4 凋亡相關蛋白表達條帶圖

圖5 細胞凋亡流式圖

2.6 干擾miR-224-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA RMST表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的作用 與H/R+si-RMST+anti-miR-NC組比較,H/R+si-RMST+anti-miR-224-3p組心肌細胞miR-224-3p表達水平明顯降低,細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量、LDH釋放量明顯升高,Bcl-2蛋白表達、SOD和GSH-Px活性、細胞存活率明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表7、圖6、圖7。

表7 干擾miR-224-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA RMST表達對H/R誘導的心肌細胞損傷的作用(±s)

圖6 凋亡相關蛋白表達條帶圖

圖7 細胞凋亡流式圖

3 討 論

心肌細胞I/R損傷可導致充血性心力衰竭、惡性心律失常,嚴重威脅人類生命健康[10]。因此,積極探索與心肌細胞I/R損傷有關的基因,分析其潛在作用和可能機制,對治療心肌I/R損傷有重要意義。lncRNA RMST在糖氧剝奪誘導神經(jīng)元細胞損傷、大腦中動脈閉塞誘導的腦損傷以及缺血性腦卒中病人血漿中表達明顯升高,抑制lncRNA RMST表達對神經(jīng)元損傷、缺血性腦損傷具有保護作用,腦內(nèi)注射RMST干擾載體還可減少小腦梗死面積和改善神經(jīng)功能[11-12]。lncRNA RMST高表達促進氧葡萄糖剝奪誘導的腦微血管內(nèi)皮細胞損傷,抑制lncRNA RMST可能是保護腦微血管內(nèi)皮細胞免受缺氧缺血損傷的相關機制[13-14]。本研究顯示,H/R誘導后HCM細胞中l(wèi)ncRNA RMST表達明顯升高、細胞凋亡率明顯升高、存活率下降。Bcl-2/Bax比值是參與細胞凋亡調(diào)控的重要因素,Bax表達增加、Bcl-2表達降低可促進線粒體膜通透性孔開放,并隨后釋放細胞色素C、凋亡誘導因子、Caspases激活因子,促進細胞凋亡的發(fā)生[15]。與功能分析結(jié)果一致,抑制lncRNA RMST表達可減輕H/R誘導對HCM細胞Bax蛋白表達的促進和Bcl-2蛋白表達的抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),H/R誘導后HCM細胞上清液中MDA含量明顯升高,SOD和GSH-Px活性降低。活性氧自由基攻擊體內(nèi)脂肪酸導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA積累,而MDA含量是氧化損傷程度的重要標志[16]。SOD和GSH-Px是體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì),其可對抗和阻斷活性氧自由基對細胞的損害,及時修復受損細胞[17]。抑制lncRNA RMST表達后,SOD和GSH-Px活力升高,MDA含量降低,LDH釋放量降低,說明抑制lncRNA RMST表達可提高HCM細胞抗氧化能力,減輕H/R誘導的HCM細胞氧化應激損傷和凋亡。

多項研究證實,lncRNA通過發(fā)揮miRNA分子海綿作用,進而參與心肌細胞凋亡和氧化應激損傷[18-19]。例如,lncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1,NEAT1)通過抑制miR-520a表達調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達,改變Caspase-3活化水平進而保護心肌細胞免于H/R誘導的凋亡[20]。丹參酮ⅡA能夠減輕H/R處理后心肌細胞的凋亡、氧化應激和線粒體膜電位改變,其機制與下調(diào)lncRNA AK003290/miR-124-5p分子軸有關[21]。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實lncRNA RMST對miR-224-3p具有靶向負調(diào)控作用。miR-224-3p位于染色體Xq28,研究顯示過表達miR-224-3p可降低骨肉瘤細胞活力和侵襲能力,具有抗腫瘤作用[22]。過表達miR-224-3p還可降低高糖誘導的大鼠腎小管上皮細胞炎性反應[23]。本研究結(jié)果顯示,H/R誘導可降低HCM細胞中miR-224-3p表達水平,過表達miR-224-3p可提高HCM細胞存活和抗氧化應激能力,減輕H/R誘導的凋亡和氧化應激損傷。此外,本研究證實,miR-224-3p是lncRNA RMST的直接靶點,且lncRNA RMST對miR-224-3p具有負調(diào)控作用。由于抑制lncRNA RMST表達與過表達miR-224-3p的抗凋亡、抗氧化應激損傷作用類似,本研究推測HCM細胞中存在lncRNA RMST/miR-224-3p通路。進一步研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-224-3p表達可部分逆轉(zhuǎn)抑制lncRNA RMST對H/R處理的HCM細胞凋亡、氧化應激損傷的影響,這進一步說明抑制lncRNA RMST通過靶向miR-224-3p對H/R誘導的心肌細胞損傷具有保護作用。

綜上所述,H/R誘導后心肌細胞中l(wèi)ncRNA RMST表達升高、miR-224-3p表達降低。抑制lncRNA RMST通過靶向上調(diào)miR-224-3p能夠減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷,為心肌I/R損傷治療提供了新的方向。