兩種新冠核酸檢測試劑盒診斷性能評估

楊曉玉，陳恩，李通，程豐，龔國富，雷文波

（1.鄂州市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 鄂州 436000；2.南華大學衡陽醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，湖南 衡陽 421001；3.南華大學附屬第一醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，湖南 衡陽 421001）

2019 年底爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的一種嚴重急性呼吸道傳染病。2020 年新冠肺炎在全球程爆發(fā)性擴散，目前已有5 900 余萬人確診，死亡人數(shù)達140 多萬，且還呈增長之勢，全世界均面臨著嚴峻的疫情挑戰(zhàn)。

SARS-CoV-2 是β 屬的冠狀病毒，有包膜，直徑為60～140 nm[1]，主要傳染源是新冠肺炎患者及無癥狀感染者，其傳播途徑主要是通過呼吸道飛沫和密切接觸傳播，長時間暴露于高濃度氣溶膠也有感染的可能[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，糞便和尿液中也可以分離到新冠病毒[3]。根據(jù)流行病學統(tǒng)計，目前新冠肺炎的易感人群較廣，部分研究顯示男性的病例數(shù)比女性多[4]，且年齡較大的患者，特別是自身具有基礎(chǔ)性疾病的患者預(yù)后更差，比如高血壓、糖尿病等[5-6]。新冠肺炎患者早期的臨床癥狀以發(fā)熱、干咳、乏力為主，少數(shù)患者伴有鼻塞、咽痛、流涕、腹瀉、肌痛等癥狀[7]。重癥患者可出現(xiàn)呼吸困難或者低氧血癥，進而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙及多器官衰竭等[8]。

新冠病毒檢測方法多種多樣，有高通量測序檢測、病原核酸檢測、血清抗體檢測等方法。病原核酸檢測方法具有成本相對較低、特異性和敏感性相對較高[9]，且其檢測條件與檢測人員技術(shù)水平等要求相對容易滿足等特點，符合目前大樣本量的篩查及診斷的客觀需要。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》，實時熒光RT-PCR 已成為檢測新型冠狀病毒的常規(guī)檢測方法[10]，主要針對新型冠狀病毒兩段主要的保守基因序列：開放讀碼框1ab （Open Reading Frame1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（Nucleocapsid Protein，N）[11-12,1]。隨著國內(nèi)外疫情的發(fā)展，為滿足國內(nèi)外疫情防控的需要，各大體外診斷生物試劑公司推出了各種核酸檢測試劑盒。但因各試劑廠家研發(fā)團隊水平不一，技術(shù)參差不齊，檢測試劑盒性能也各有優(yōu)劣，其靈敏性、特異性等方面可能會有所差異。本研究就國內(nèi)常用的兩種核酸檢測試劑盒進行比較與評估，旨在為臨床實驗室遴選核酸檢測試劑選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 湖北省鄂州市中心醫(yī)院2020 年2 月17 日至24 日確診的COVID -19（經(jīng)核酸檢測檢測陽性及胸片CT 影像學檢查有新冠肺炎典型性改變及臨床癥狀者）咽拭子樣本55 例，同時期經(jīng)新冠核酸檢測與影像學檢查排除的非新冠肺炎患者咽拭子樣本28 例。

1.1.2 檢測試劑盒 某核酸擴增試劑盒A （雙重熒光PCR 法，批號20200108）；某核酸擴增試劑盒B（雙重熒光PCR 法，批號：20200106）；天隆EXRNA/DNA 核酸提取試劑盒 （磁珠法，批號：E0120010221）。

1.1.3 儀器 核酸全自動提取儀 （Natch CS S12C）（圣湘生物），核酸提取儀 （天隆科技），Applied Biosystems QuantStudio 3＆5 實時熒光定量PCR 儀（Thermo）。

1.2 實驗方法 以下實驗的核酸提取均采用各試劑廠家推薦方法進行，并嚴格按照各試劑說明書操作。B 采用配套的一步法提??；A 采用其推薦之一的核酸提取試劑盒及相對應(yīng)的提取儀提取。

1.2.1 一致性檢測 選擇COVID-19 臨床確診病例55 例、非COVID-19 患者28 例，用A、B 兩種試劑進行檢測，分析兩種試劑的診斷效能。

1.2.2 分析靈敏度檢測 從55 例COVID-19 患者中選擇ORF1ab 基因和N 基因均強陽的樣本1例，經(jīng)過10×、100×、1 000×、10 000×、100 000×稀釋，每個濃度設(shè)3 個平行孔，用兩種試劑分別進行檢測；在最低檢測濃度基礎(chǔ)上再進行倍比稀釋，再用兩種試劑分別進行檢測。

1.2.3 精密度檢測 將1.2.2 步驟中兩種試劑均能100%檢測到的高中低濃度，每個濃度分裝成5 個樣本，分別用兩種試劑盒檢測，重復3 次，分析試劑的精密度。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計分析，采用一致性Kappa 檢驗，分析試劑的診斷效能。精密度的分析采用方差分析levene 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一致性實驗及準確性實驗結(jié)果 用兩種試劑盒檢測COVID-19 樣本55 例、非COVID-19 樣本28 例，試劑A 與B 均檢測ORF1a/b 和N 基因。試劑A 的檢出率、特異度、符合度、Kappa 值、雙靶標陽性率、單靶標陽性率、復檢率分別是100%、96.4%、98.8%、0.973、90.7%、9.3%、9.3%。試劑B 的檢出率、特異度、符合度、Kappa 值、雙靶標陽性率、單靶標陽性率、復檢率分別是98.2%、100%、98.8%、0.964、79.6%、20.4%、20.4%。經(jīng)分析，試劑A 與B的一致性及準確性相當。見表1-2。

表1 兩種核酸檢測試劑盒檢測結(jié)果分析

表2 兩種核酸檢測試劑盒的診斷效能評估

2.2 兩種試劑盒診斷靈敏度比較 從55 例COVID-19 樣本中取雙靶標陽樣本1 例進行10×梯度稀釋，每個濃度設(shè)3 個平行孔，用兩種試劑盒檢測。各擴增曲線均呈典型的“S”型，根據(jù)稀釋倍數(shù)做線性回歸方程，發(fā)現(xiàn)試劑A 的線性范圍最寬且線性關(guān)系良好見圖1。試劑B 可穩(wěn)定檢測到100×稀釋的樣本，而試劑A 可以檢測的最低濃度是1 000×稀釋的樣本。為進一步確認以上實驗結(jié)果，再將樣本稀釋200×、400×、800×、1 000×、2 000×，每個濃度設(shè)8 個孔，用兩種試劑檢測。結(jié)果顯示樣本經(jīng)200×、400×、800×、1 000×稀釋后，試劑A 的檢出率均是100%；試劑B 的檢出率分別是100%、100%、62.5%、25%，見表3。

圖1 10 倍梯度稀釋樣本后試劑A和B 的ORF1ab/N 基因擴增曲線圖

表3 倍比稀釋后兩種試劑檢測結(jié)果

2.3 兩種試劑精密度實驗比較 已知2.2 實驗中兩種試劑能共同檢出的最低濃度是100×稀釋后的樣本，則將2.2 實驗中的樣本原液及10×、100×稀釋后作為高、中、低3 個濃度，每個濃度每批重復測5次，連續(xù)測3 次，統(tǒng)計其Ct 值與CV%。兩種試劑檢測未稀釋的樣本各基因精密度之間差異無顯著意義（P>0.05）。樣本經(jīng)10×稀釋后，試劑A 與B 的N基因CV%值分別為0.7、2.1 （F=8.31，P<0.05），ORF1ab 基因CV%值分別為0.6、2.3（F=15.614，P<0.05）；樣本經(jīng)100 ×稀釋后，試劑A 與B 的N 基因CV%值分別為3.1、8.9 （F=5.684，P<0.05)，ORF1ab基因CV%值分別為1.9、6.0（F=5.846，P<0.05）。試劑B 的精密度均隨著樣本濃度的降低而降低，而試劑A 的高中低濃度精密度變化不明顯，說明試劑A 的精密度優(yōu)于試劑B。

3 討論

國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準的新型冠狀病毒檢測試劑中，大部分采用的方法為實時熒光PCR，它具有簡便快速、特異性強、靈敏度高等特點[9]。但不同廠家試劑成分不同或引物、探針設(shè)計策略不一而可能導致其檢測性能上有差異。本研究對不同公司生產(chǎn)的新冠病毒核酸檢測試劑A和B 進行了對比，發(fā)現(xiàn)試劑B 的雙陽率僅79.6%，明顯低于試劑A 的90.7%。根據(jù)指南要求，單靶標陽性患者需要用不同類型的標本如痰、肺泡灌洗液等進行復查或隔天重新采集同一類型樣本進行復查[1]。試劑B 的復檢率為20.4%，明顯高于試劑A的9.3%。

為避免所選新冠肺炎患者樣本中新冠病毒濃度覆蓋范圍不全而導致實驗出現(xiàn)誤差，從55 例新冠肺炎樣本中取雙靶標陽性1 例樣本進行10×梯度稀釋，用兩種試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)試劑A 的線性范圍更廣，靈敏度更高，它可以穩(wěn)定檢測到1 000×稀釋樣本，而試劑B 只能穩(wěn)定檢測到100×稀釋的樣本。進一步將樣本稀釋800×、1 000×，每個濃度分裝8 管，試劑A 的檢出率分別是100%、100%；試劑B 的檢出率分別是62.5%、25%。通過以上實驗發(fā)現(xiàn)，兩種試劑對高病毒載量的樣本檢出率一致，但對低病毒載量樣本，試劑A 的檢出率明顯高于試劑B，充分說明試劑A 的分析靈敏度高于后者。在精密度實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，兩種試劑檢測未稀釋的樣本（雙靶標陽性的樣本）ORF1ab 和N 基因檢出的精密度差異無顯著意義（P>0.05）。但樣本經(jīng)10×與100×稀釋后，試劑A 的N 基因(F=8.31，P<0.05,F=5.684，P<0.05)和ORF1ab 基因（F=15.614，P<0.05, F=5.846，P<0.05) 精密度均優(yōu)于試劑B，差異有統(tǒng)計學意義。試劑B 的精密度均隨著樣本濃度的降低而降低，而試劑A 精密度隨著濃度降低并無明顯趨勢，這可能因試劑A 靈敏度相對較高，所稀釋的樣本濃度不適合作為其弱陽性樣本。

表4 兩種試劑對不同濃度樣本檢測后的Ct 值與CV%結(jié)果

綜上所述，試劑A 的符合度高，靈敏度與重復性相對較好，且其復檢率相對試劑B 要低，整體性能相對占優(yōu)勢。因條件有限，暫無通用標準品進行最低檢測限的檢測，僅對本實驗室所采用過的試劑與耗材進行實驗，如陽性標本僅采用的是鄂州市中心醫(yī)院新冠確診患者的樣本，這可能會導致實驗有誤差。本研究僅對幾種試劑診斷性能進行初步的評估，其更深一層的性能驗證，需進一步研究。