CMKLR1 三種檢測(cè)方法在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

孫海芹，程?；?，王彥紅

（1.鶴壁市婦幼保健院婦女保健科；2.婦產(chǎn)科；3.檢驗(yàn)科，河南 鶴壁 458030）

宮頸癌是全球女性最常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高，且具有一定地域差異性，以發(fā)展中國(guó)家最為多見，而我國(guó)是一個(gè)人口大國(guó)，占比較大[1]。隨著科技不斷進(jìn)步，宮頸癌早期篩查、診斷及預(yù)防不斷普及，大部分國(guó)家死亡率整體下降，而我國(guó)則未見明顯改善，甚至有上升趨勢(shì)，認(rèn)為與宮頸癌危險(xiǎn)暴露因素增加有關(guān)[2]。個(gè)體性行為是其關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，女性首次性行為年齡提前，性行為次數(shù)及伴侶增加，越來(lái)越多年輕女性存在慢性宮頸炎和宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變，最終部分可發(fā)展為宮頸癌，影響生活質(zhì)量，威脅其生命[3]。目前，腫瘤研究多涉及微觀領(lǐng)域，科研工作者力求從分子水平完成腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估；近年研究發(fā)現(xiàn)趨化因子及趨化因子受體不僅可在大部分腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，還可參與其增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲等[4-5]。但關(guān)于趨化因子受體1(Chemokine receptor-like 1，CMKLR1)與宮頸癌的研究報(bào)道較少。本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR （Real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-FPCR）、免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）和酶聯(lián)免疫吸附法（EnzymeLinked Immunosor-bent Assay,ELISA）檢測(cè)CMKLR1 在宮頸癌、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和慢性宮頸炎中的表達(dá)差異，并分析其與宮頸癌臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015 年2 月至2018 年2 月鶴壁市婦幼保健院收治的125 例宮頸癌患者、92例宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者和66 例慢性宮頸炎患者作為研究對(duì)象，分別命名為宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組和宮頸炎組，同期選取40 例健康女性作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):宮頸癌（1）臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室及病理結(jié)果均證實(shí)為宮頸癌者，且FIGO 分期在I-III 間者；（2）均行手術(shù)治療且預(yù)期生存期>3月者；（3）臨床及隨訪資料完整者；（4）排除合并其它惡性腫瘤者；（5）排除非腫瘤原因死亡者；宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（1）陰道鏡及病理結(jié)果提示為宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變者；（2）排除合并其它惡性腫瘤者；慢性宮頸炎（1）臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及陰道鏡檢查均提示為慢性宮頸炎者；（2）排除合并宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和或?qū)m頸癌者。4 組受試者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，且通過(guò)鶴壁市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 采用RT-FPCR 檢測(cè)CMKLR1 mRNA 手術(shù)切下癌組織和癌旁正常組織于30 min 內(nèi)置于RNA 保存液中，-80℃冰箱保存待檢測(cè)：待集齊后進(jìn)行RT-FPCR 檢測(cè)。第一，總RNA 提取和cDNA制備，參照CMKLR1 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書完成檢測(cè)；第二，RT-FPCR 檢測(cè)，用Pubmed中BLAST 軟件設(shè)計(jì)CMKLR1 引物，其中內(nèi)參基因是GAPDH，配置PCR 擴(kuò)增體系（20 μL），設(shè)置擴(kuò)增條件后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算CMKLR1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。其中QuantStudio5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2.2 采用IHC 檢測(cè)組織CMKLR1 蛋白 取病理科石蠟塊進(jìn)行切片、脫蠟及抗原修復(fù)后加入CMKLR1 單克隆抗體（1:300），4℃過(guò)夜，第2 d，緩沖液洗3 次，后加入二抗，室溫孵育30 min （避光）；后經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明及封片后閱片。本研究采用雙盲閱片法，統(tǒng)一閱片標(biāo)準(zhǔn)后由兩位高年資質(zhì)病理醫(yī)師完成。其中CMKLR1 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，產(chǎn)品批號(hào)為201905。

結(jié)果判定：CMKLR1 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒則認(rèn)定為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率不同記為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0 分；≤10% 1 分；11%～49% 2 分；≥50% 3 分。根據(jù)著色強(qiáng)度不同記為：無(wú)著色0 分；淡黃色1分；黃色2 分；棕褐色3 分。兩者乘積計(jì)分：陽(yáng)性為≥4 分者；陰性為0～3 分者。

1.2.3 采用ELISA 檢測(cè)血清CMKLR1 收集所有研究對(duì)象入組第1 d 空腹外周血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清于液氮快速凍存后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待用；待所有標(biāo)本集齊后參照血清CMKLR1-ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書完成檢測(cè)，于波長(zhǎng)450 nm 酶標(biāo)儀上讀取OD 值，繪制曲線獲取CMKLR1 濃度。其中試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)免疫生物有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為201912。

1.3 隨訪 對(duì)宮頸癌患者隨訪3 年，截止日期為2021 年2 月1 日，無(wú)因其它原因中途退出者，記錄其總生存期 (Overall Survival,OS) 和無(wú)病生存期(Disease-free survival,DFS)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，其中計(jì)量資料用（±s）描述，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，2 組以上比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比描述，用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較；采用Kaplan-Meier 法和Logrank 法進(jìn)行生存分析；用Pearson 相關(guān)分析血清CMKLR1 與組織CMKLR1 mRNA 和CMKLR1 蛋白的關(guān)系；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組CMKLR1 mRNA 比較 宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組和宮頸炎組3 組組織中CMKLR1 mRNA 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且表現(xiàn)為宮頸癌組＞宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組＞宮頸炎組。見表1。

表1 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

表1 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

注：與宮頸炎組比較，at=20.889,aP=0.000；與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組比較，bt=21.949,bP=0.000。

組別n宮頸癌組宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組宮頸炎組125 92 66 FP CMKLR1 mRNA 5.951.03b 3.340.57a 1.850.12 14.492 0.001

2.2 宮頸癌組癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 比較 與癌旁正常組織比較，宮頸癌組癌組織CMKLR1 mRNA 和CMKLR1 蛋白陽(yáng)性率均明顯升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 蛋白免疫組化圖

表2 宮頸癌組癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 比較（%,±s）

表2 宮頸癌組癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 比較（%,±s）

類別n CMKLR1 蛋白陽(yáng)性陰性癌組織癌旁正常組織125 125 80（64.00）24（19.20）45（36.00）101（80.80）trP CMKLR1 mRNA 5.951.03 1.240.22 44.998 0.000 51.633 0.000

2.3 CMKLR1 蛋白與宮頸癌臨床特征的相關(guān)性CMKLR1 蛋白在FIGO 分期、肌層浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移上差異表達(dá)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 CMKLR1 蛋白與宮頸癌臨床特征的相關(guān)性

2.4 CMKLR1 蛋白與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系 經(jīng)3 年隨訪，CMKLR1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者OS 生存率（29/80）和DFS 生存率（26/80）明顯低于陰性表達(dá)者[（30/45）和 （27/45）]（r=10.692，P=0.001；r=8.918，P=0.003）。見圖2。

圖2 CMKLR1 蛋白與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

2.5 4 組血清CMKLR1 比較 宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組、宮頸炎組和對(duì)照組4 組血清CMKLR1 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且表現(xiàn)為宮頸癌組>宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組>宮頸炎組>對(duì)照組。見表4。

表4 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

表4 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

注：對(duì)照組與宮頸炎組比較，aP<0.05；宮頸炎組與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組比較，bP<0.05；宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組與宮頸癌組比較，cP<0.05。

組別宮頸癌組宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組宮頸炎組對(duì)照組n 125 92 66 40 FP CMKLR1（μg/L）40.25±7.63c 33.59±6.11b 28.75±5.21a 26.49±4.88 70.452 0.000

2.6 Pearson 相關(guān)分析 經(jīng)Pearson 相關(guān)分析得知，血清 CMKLR1 與組織 CMKLR1 mRNA 及CMKLR1 蛋白均呈明顯正相關(guān)（P<0.05），其相關(guān)系數(shù)分別為0.471 和0.448。

3 討論

宮頸癌死亡率較高，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵因素，與腫瘤微環(huán)境狀態(tài)密切相關(guān)，而趨化因子及受體是腫瘤微環(huán)境重要組成成分之一，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已在肺癌及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中到證實(shí)[6-8]。CMKLR1 在1996 年被Gantz 等[9]報(bào)道，是新近重要的趨化因子受體，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），但未見其配體，在白色脂肪組織和巨噬細(xì)胞等中顯著表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[10]，CMKLR1 是Chemerin 發(fā)揮生物學(xué)功能的主要受體，后者可趨化高表達(dá)CMKLR1 的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，參與各類細(xì)胞代謝、增殖及免疫應(yīng)答等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年，越來(lái)越多研究表明[11-12]，Chemerin 可與內(nèi)皮細(xì)胞膜上CMKLR1 受體結(jié)合，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤新生血管叢形成，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖中占有一定地位，內(nèi)源性CMKLR1 可能參與子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，為子宮內(nèi)膜癌臨床治療提供新的途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1 mRNA 水平在宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組和宮頸炎組依次減少；宮頸癌組癌組織CMKLR1 蛋白陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織，證實(shí)CMKLR1 在宮頸癌中高表達(dá)，從基因和蛋白水平證明了CMKLR1 在宮頸癌中的“原癌基因”角色。本研究通過(guò)分析CMKLR1 蛋白與宮頸癌臨床特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)CMKLR1 蛋白在FIGO 分期、肌層浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移上差異表達(dá)，且FIGO 分期越高、肌層浸潤(rùn)越深及存在淋巴轉(zhuǎn)移者，CMKLR1 蛋白陽(yáng)性率越高，分析原因，CMKLR1 高表達(dá)可增加腫瘤新生血管叢形成速率，加快癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移速率。此外，本研究通過(guò)Kaplan-Meier法和Log-rank 法分析CMKLR1 蛋白與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)CMKLR1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者OS 生存率（29/80）和DFS 生存率（26/80）明顯低于陰性表達(dá)者，提示CMKLR1 對(duì)宮頸癌患者預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。盡管如此，無(wú)創(chuàng)檢查才是未來(lái)疾病診療的主流，血清學(xué)檢測(cè)占比較大，為此本研究還進(jìn)行了宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組、宮頸炎組和對(duì)照組的血清CMKLR1 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血清CMKLR1 在以上組別中逐漸降低，基本與組織CMKLR1-mRNA變化吻合，為驗(yàn)證此猜想本研究還進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)血清CMKLR1 與組織CMKLR1 mRNA 及CMKLR1 蛋白均呈明顯正相關(guān)，說(shuō)明血清CMKLR1 變化與病變組織CMKLR1 mRNA 及蛋白改變一致，提示血清CMKLR1 檢測(cè)有望替代侵入性檢查之組織mRNA+蛋白檢測(cè)，成為宮頸癌診療及預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)。

綜上，CMKLR1 在宮頸癌中高表達(dá)，且與FIGO 分期、肌層浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為宮頸癌患者預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)之一。