基于形態(tài)標(biāo)記和AFLP標(biāo)記的山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

趙 圓, 張艷芳, 楊 帆, 趙令敏, 陳 妍, 霍秀文

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

山藥(DioscoreaoppositaThunb.)為合目薯蕷科薯蕷屬,具備雙子葉特征特性的單子葉纏繞草質(zhì)藤本植物,無性繁殖。山藥的主要產(chǎn)品器官為子葉下胚軸膨大形成的地下塊莖,其地下塊莖形狀呈長(zhǎng)圓柱形,垂直生長(zhǎng)[1]。山藥是純天然的滋補(bǔ)保健食物,含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可食用,也可藥用,有調(diào)節(jié)脾胃、增強(qiáng)免疫、延緩衰老等效果,是世界上重要的十大食用塊莖類植物之一[2]。我國(guó)是山藥重要的原產(chǎn)地之一,在長(zhǎng)期栽培過程中,因其適應(yīng)性強(qiáng)、種植范圍廣,使得地區(qū)間相互引種,但山藥的體外培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方案尚未建立,導(dǎo)致山藥原有遺傳基礎(chǔ)已無法準(zhǔn)確溯源,種質(zhì)資源混亂,僅通過簡(jiǎn)單形態(tài)學(xué)標(biāo)記很難真實(shí)反映品種間的遺傳背景和親緣關(guān)系,分類鑒定難度大,不利于山藥產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展[3]。

以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記是鑒定種質(zhì)資源差異性最直接有效的遺傳分析方法,不受基因表達(dá)和地理環(huán)境的影響。其中,AFLP是基于PCR開發(fā)且效率很高的標(biāo)記技術(shù),只需少量純化的DNA,具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),極大地加快了育種進(jìn)程[4]。許云等通過AFLP分子標(biāo)記分析了111份大薯材料的遺傳多樣性,8對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1 286個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),占總位點(diǎn)數(shù)的99.61%,表明AFLP標(biāo)記可以檢測(cè)出大薯較高的多態(tài)性,有效地分析材料間的遺傳關(guān)系[5]。Mengesha等采用AFLP基因指紋圖譜對(duì)43株不同群體的幾內(nèi)亞山藥進(jìn)行鑒定,分析發(fā)現(xiàn),幾內(nèi)亞山藥栽培品種間存在種內(nèi)高度變異和種間低程度變異[6]。王丹等對(duì)21份馬鈴薯材料進(jìn)行AFLP分析,并構(gòu)建了能區(qū)分所有材料的指紋圖譜[7]。本研究通過AFLP分子標(biāo)記結(jié)合形態(tài)標(biāo)記的方式,對(duì)60份山藥種質(zhì)資源進(jìn)行聚類及遺傳多樣性分析,以進(jìn)一步揭示山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系,以期為今后山藥種質(zhì)資源的分類及優(yōu)良品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與來源

供試材料為筆者所在課題組近年從河南省、河北省、山東省等山藥主產(chǎn)區(qū)收集到的60份山藥種質(zhì)資源,均種植于內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)種質(zhì)資源圃,土質(zhì)疏松,無石塊,肥力適中,無連作。山藥種質(zhì)基本信息見表1。

表1 供試山藥材料編號(hào)及來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要形態(tài)指標(biāo)調(diào)查 按照山藥的生物學(xué)特性,在山藥生長(zhǎng)發(fā)育旺盛期和收獲期,分別觀察、計(jì)算山藥植株的地上部和地下部形態(tài)特征指標(biāo),具體參照許念芳等的測(cè)定方法[8]。形態(tài)多樣性調(diào)查的主要指標(biāo)及賦值標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 形態(tài)多樣性指標(biāo)及賦值標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 DNA提取 2020年8月采集生長(zhǎng)旺盛期健康、無病蟲害的山藥幼嫩葉片,裝入事先準(zhǔn)備好的凍存管,迅速放入裝有液氮的采樣盒中,保持葉片新鮮,采集后立即進(jìn)行DNA提取。山藥DNA的提取和濃度檢測(cè)詳見張佳佳等的方法[9]。

1.2.3 主要試劑及引物 參考孫瑞芬等的方法[10]設(shè)計(jì)接頭和引物序列(表3)。選擇性擴(kuò)增引物由預(yù)擴(kuò)增引物EcoRⅠ和MseⅠ序列末端加任意的3個(gè)堿基組成,各設(shè)計(jì)16個(gè),共組合256對(duì)。

表3 接頭和引物序列

1.2.4 AFLP擴(kuò)增及檢測(cè) 首先選用3個(gè)山藥品種(?？谏剿?、日本山藥-2、河南山藥-1)進(jìn)行引物篩選,從256對(duì)引物中篩選出多態(tài)性較好的引物組合,然后進(jìn)行60份材料的整體試驗(yàn)。

1.2.4.1 酶切與連接 選用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ對(duì)植物組DNA進(jìn)行雙酶切,酶切體系為:10×NEB Buffer 5 μL,EcoRⅠ/MseⅠ 2 μL,模板DNA1 μg,補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR程序?yàn)?7 ℃溫育 10 min,65 ℃溫育20 min。

分別制備EcoRⅠ接頭和MseⅠ接頭:將E1(10 μmol/L)和E2(10 μmol/L)各10 μL于微量離心管中混勻,取另一離心管將M1(10 μmol/L)和M2(10 μmol/L)各10 μL混勻。PCR程序均為 95 ℃ 5 min,65 ℃ 10 min,37 ℃ 10 min,25 ℃ 10 min,4 ℃ 20 min。

連接體系為20 μL:T4DNA Ligation Buffer 2 μL,T4DNA Ligase(3 U/μL)0.5 μL,EcoRⅠ接頭/MseⅠ接頭 2 μL,酶切產(chǎn)物10 μL,ddH2O 5.5 μL。16 ℃連接過夜。

1.2.4.2 預(yù)擴(kuò)增 將連接產(chǎn)物稀釋10倍作為預(yù)擴(kuò)增模板,預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL:rTaq酶10 μL,M0/E0 2 μL,10×連接產(chǎn)物2 μL,ddH2O 6 μL。PCR程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火 60 s,72 ℃延伸60 s,30 次循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.4.3 選擇性擴(kuò)增 參照王志敏等對(duì)山藥塊莖不同發(fā)育時(shí)期相關(guān)差異基因的cDNA-AFLP分析中的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件[11]進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。

1.2.4.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物95 ℃變性后經(jīng)過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳,強(qiáng)堿法銀染顯色至出現(xiàn)清晰條帶,拍照保存,統(tǒng)計(jì)條帶。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 利用SPSS 25.0軟件計(jì)算15個(gè)質(zhì)量性狀的分布頻率;6個(gè)數(shù)量性狀的最小值、最大值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù);參照吳金平等的方法[12]計(jì)算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)。采用DPS分析軟件中非加權(quán)類平均法對(duì)60份山藥種質(zhì)進(jìn)行Q型聚類分析,從中分析各材料的親緣關(guān)系。根據(jù)AFLP擴(kuò)增條帶,構(gòu)建“0、1”矩陣(有帶為1,無帶為0),利用POPGEN 32軟件統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶數(shù)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon信息指數(shù)(I)等遺傳多樣性指數(shù)。使用NTSYS 2.1軟件計(jì)算不同材料間的遺傳相似性系數(shù),并根據(jù)遺傳相似系數(shù)用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥種質(zhì)資源形態(tài)性狀多樣性

對(duì)60份山藥種質(zhì)資源的21個(gè)性狀進(jìn)行分析,不同性狀在不同材料間表現(xiàn)出不同的多樣性。由表4可知,在15個(gè)質(zhì)量性狀中,除葉的缺裂均為淺裂外,其他14個(gè)質(zhì)量性狀在不同級(jí)別上分布不均勻,遺傳多樣性指數(shù)最高的是葉形,為1.273 9,其次為葉色(1.000 0)。由表4可知,莖蔓以右旋為主;莖蔓顏色以紫色為主;莖蔓截面形狀以圓形為主;葉形多為戟形、心形;植株長(zhǎng)勢(shì)中等;大多數(shù)無零余子;塊莖形狀以棍狀為主;塊莖表皮顏色以黃褐色為主;塊莖肉色多為白色;塊莖龍頭多為細(xì)長(zhǎng)型;塊莖須根數(shù)100以上。由表5可知,6個(gè)數(shù)量性狀具有不同差異,塊莖質(zhì)量的變異系數(shù)最大,達(dá)到75.88%,葉長(zhǎng)變異系數(shù)最小,為12.43%。各數(shù)量性狀變異程度為塊莖質(zhì)量>塊莖直徑>葉炳長(zhǎng)>塊莖長(zhǎng)>葉寬>葉長(zhǎng)。

表4 15個(gè)質(zhì)量性狀的分布及多樣性指數(shù)

表5 6個(gè)數(shù)量性狀的統(tǒng)計(jì)分析

2.2 山藥種質(zhì)資源形態(tài)性狀的聚類分析

對(duì)60份山藥種質(zhì)的田間形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果如圖1所示。60份山藥種質(zhì)的歐氏距離為1.081 6～11.425 9,說明所選材料的遺傳多樣性豐富。其中日本山藥-2(6)和日本山藥-3(31)之間遺傳距離最小,為1.081 6, 兩者間遺傳差異相對(duì)較小;大和長(zhǎng)芋(22)和得澤紅皮山藥(57)之間遺傳距離最大,為11.425 9,兩者間遺傳差異相對(duì)較大。當(dāng)遺傳距離為8.18時(shí)可將供試材料分為兩大類,河南焦作山藥(2)和沈陽草河口山藥(39)聚為一類,其他58份種質(zhì)聚為一類,這2份種質(zhì)的主要特征為莖蔓截面形狀為方形,而其他材料均為圓形。當(dāng)遺傳距離在7.36時(shí)可將供試材料分為3個(gè)類群和一個(gè)單獨(dú)分支,大和長(zhǎng)芋(22)單獨(dú)聚為一類,其主要特征為葉形較大、植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、有零余子、塊莖短粗產(chǎn)量高;云南品種曲靖山藥(29)、播樂賴皮山藥(49)、德澤紅皮山藥(57)聚為第一亞類,主要特征為莖蔓左旋、葉炳綠色、葉片為淺綠色心形、無零余子、塊莖表皮白色、薯肉白色、須根數(shù)100以上;其余材料聚為第二亞類。

2.3 AFLP擴(kuò)增結(jié)果分析

選用3個(gè)山藥品種從256對(duì)引物中篩選出26對(duì)清晰且多態(tài)性較好的引物組合(表6),分別對(duì)60份材料進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,共獲得多態(tài)性條帶580條,平均每對(duì)引物擴(kuò)增22條多態(tài)性條帶,片段大小主要集中在100～750 bp之間,平均多態(tài)率78.44%,其中擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物組合是E-GCT/M-GAC;擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物組合是E-GCT/M-TGC。擴(kuò)增多態(tài)率最高的是引物組合E-GCT/M-ACG,達(dá)到97.50%;擴(kuò)增多態(tài)率最低的是引物組合E-CAG/M-AGT,為62.96%。Nei’s基因多樣性指數(shù)在0.111 5～0.335 5之間,平均值為0.198 8;Shannon信息指數(shù)在0.188 7～0.503 9之間,平均值為0.314 9,表明供試山藥種質(zhì)具有較高的遺傳多樣性。圖2為引物組合E-GTT/M-TTC擴(kuò)增后的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)圖。

表6 26對(duì)引物組合擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

2.4 聚類分析

采用NTSYS2.1.0軟件計(jì)算60份山藥種質(zhì)的遺傳相似系數(shù),用UPGMA法進(jìn)行聚類分析(圖3)。60份山藥材料之間遺傳相似系數(shù)為0.619～0.922,表現(xiàn)出豐富的多樣性和相似性,其中溫縣鐵棒山藥(3)和細(xì)毛山藥(8)遺傳相似系數(shù)最大,為0.922,表明兩者間遺傳差異較小;廣淮(10)和德澤紅皮山藥(57)遺傳相似系數(shù)最小,為0.619,表明兩者間遺傳差異較大。

在遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí),60份山藥種質(zhì)除廣淮(10)外,其他聚為一大類群,表明廣淮與其他種質(zhì)間雖有共同的遺傳基因,但遺傳相似系數(shù)相對(duì)較小,存在較大的遺傳差異。在遺傳相似系數(shù)為0.74時(shí),可將第一大類群分為2個(gè)亞類群和一個(gè)單獨(dú)分支,淮山藥(33)較為特殊單獨(dú)聚為一類,來源于云南地區(qū)的會(huì)澤山藥(46)、云南富民山藥(37)、播樂賴皮山藥(49)、得澤紅皮山藥(57)聚為第一亞類,其他材料聚為第二大亞類。

3 討論與結(jié)論

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是通過觀察植株的表型性狀來區(qū)分品種間差異,是評(píng)價(jià)種質(zhì)遺傳多樣性最簡(jiǎn)單直觀的方法,但易受外界環(huán)境和內(nèi)在遺傳變異的影響[13]。本試驗(yàn)對(duì)60份山藥種質(zhì)21個(gè)表型性狀進(jìn)行分析,在15個(gè)質(zhì)量性狀中,除葉的缺裂均為淺裂外,其他14個(gè)質(zhì)量性狀存在不同程度差異,遺傳多樣性指數(shù)最高的是葉形,其次為葉色;6個(gè)數(shù)量性狀平均變異系數(shù)為30.07%,塊莖質(zhì)量的變異系數(shù)最大,葉長(zhǎng)變異系數(shù)最小。通過形態(tài)學(xué)聚類發(fā)現(xiàn)歐氏距離為1.081 6～11.425 9,說明試驗(yàn)所選材料表型差異大,遺傳多樣性豐富。楊明通過對(duì)30份山藥材料的13個(gè)形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行分析,表明塊莖長(zhǎng)、塊莖周長(zhǎng)和葉形3個(gè)形態(tài)指標(biāo)是彼此獨(dú)立的,對(duì)山藥的生長(zhǎng)進(jìn)化各有其重要意義,可以作為山藥形態(tài)學(xué)分類的標(biāo)準(zhǔn)[14]。李麗紅等對(duì)福建72個(gè)山藥地方品種資源的19個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析,其中12個(gè)質(zhì)量性狀遺傳多樣性指數(shù)均介于0.738 3和1.568 3之間,平均值為1.017 3,葉片質(zhì)地較高,零余子及是否開花較低,7個(gè)數(shù)量性狀的平均變異系數(shù)為33.17%[15],本試驗(yàn)結(jié)果與之相近,說明山藥群體中存在豐富的表型變異。覃維治等根據(jù)表型性狀的遺傳差異將44份淮山藥種質(zhì)分為4類,性狀相近且區(qū)域內(nèi)生態(tài)環(huán)境相似的材料聚為一類,各個(gè)類群都存在著相應(yīng)的形態(tài)學(xué)特征,12個(gè)質(zhì)量性狀中,葉形的遺傳多樣性指數(shù)最高[16],本試驗(yàn)結(jié)果與之一致,說明在通過表型性狀研究山藥遺傳多樣性時(shí),除塊莖粗、塊莖長(zhǎng)、塊莖質(zhì)量這些對(duì)山藥產(chǎn)量起決定作用的指標(biāo)外,葉形特點(diǎn)也具有重要的研究意義。參照《中國(guó)植物志》[17]有關(guān)山藥的信息及前人的一些研究,根據(jù)本試驗(yàn)所收集到的數(shù)據(jù),如葉片特點(diǎn)上可將本試驗(yàn)中所用到的材料區(qū)分為薯蕷、參薯、日本薯蕷這三大類,薯蕷的葉片小至中、綠色、葉形為戟形、心形或三角形;參薯的葉片中至大、淺綠色、葉形多為心形;日本薯蕷葉片較大、深綠色、心形或三角形。其中參薯包括廣淮、曲靖山藥、德澤紅皮山藥、播樂賴皮山藥、會(huì)澤山藥、云南富民山藥,日本薯蕷包括日本山藥-2和日本山藥-3,其他山藥材料為薯蕷。

分子標(biāo)記是從DNA水平直接反映品種間差異,普遍認(rèn)為是最有效的遺傳標(biāo)記方法[18-19]。本試驗(yàn)用篩選出多態(tài)性較好的26對(duì)引物組合擴(kuò)增出多態(tài)性條帶580條,平均每對(duì)引物擴(kuò)增出22條多態(tài)性條帶,平均多態(tài)率78.44%;Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon 信息指數(shù)平均值為0.198 8和0.314 9,遺傳相似系數(shù)在0.619～0.922之間,表現(xiàn)出材料間有豐富的多樣性和相似性。在遺傳相似系數(shù)為0.74時(shí),可將60份山藥種質(zhì)分為2個(gè)類群和2個(gè)單獨(dú)分支(廣淮、淮山藥),廣淮在聚類樹狀圖的根基處自成一類,根據(jù)形態(tài)特征和聚類分析應(yīng)屬于參薯,主要分布在廣東,與其他地區(qū)相比廣東地區(qū)長(zhǎng)夏無冬,降水充沛,農(nóng)作物的生育期較長(zhǎng),可能在長(zhǎng)期的生長(zhǎng)發(fā)育過程中為適應(yīng)環(huán)境產(chǎn)生了變異,易區(qū)別于其他品種;淮山藥在聚類中單獨(dú)分為一類可能由于其葉片較大、塊莖較小,與其他薯蕷種質(zhì)差別較大造成的。Wu等對(duì)21個(gè)山藥地方品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,ISSR和SRAP的多態(tài)性分別為95.3%和93.5%,表明這些地方品種間存在較高的多態(tài)性[20]。華樹妹等利用RAPD標(biāo)記方法對(duì)采集自福建各地的34份山藥資源進(jìn)行遺傳多樣性研究,24對(duì)引物多態(tài)性比例達(dá)88.5%,當(dāng)遺傳系數(shù)為0.66時(shí),將34種資源劃分為扁山藥、普通山藥、福建大薯和參薯4類[21]。

本試驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和AFLP分子標(biāo)記2種方法聚類分析了60份山藥種質(zhì)資源的遺傳多樣性。研究發(fā)現(xiàn),山藥種質(zhì)資源的形態(tài)聚類方式和AFLP標(biāo)記聚類方式存在一定差異,形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果顯示,當(dāng)遺傳距離為8.18時(shí)可將供試材料分為兩大類,莖蔓截面為方形的2份材料河南焦作山藥(2)和沈陽草河口山藥(39)與其他58份種質(zhì)分開,這兩者形態(tài)有相同特點(diǎn)但在基因水平不是特別相近,通過分子標(biāo)記可將這2類種質(zhì)區(qū)分開,表明DNA分子標(biāo)記更能直接、準(zhǔn)確地將山藥種質(zhì)資源分類。部分山藥種質(zhì)在2種聚類圖上都被聚到了一起,如日本山藥-2(6)和日本山藥-1(31)、河南山藥-2(32)和河南鐵棍-2(34)、太谷山藥-2(58)和山西山藥(59)相似系數(shù)都在0.800 0以上,表明它們之間可能是近緣關(guān)系或同一品種的不同品系經(jīng)過地區(qū)間引種、人為定向選擇產(chǎn)生了種內(nèi)變異,但遺傳相似度仍較高。當(dāng)形態(tài)聚類遺傳距離在7.36時(shí)可將云南薯蕷中曲靖山藥(29)、播樂賴皮山藥(49)、德澤紅皮山藥(57)從其他資源中分出,而當(dāng)分子聚類遺傳系數(shù)為0.716時(shí),將來源于云南地區(qū)的會(huì)澤山藥(46)、云南富民山藥(37)、播樂賴皮山藥(49)、得澤紅皮山藥(57)從其他材料中分出,其主要特征為莖左旋、葉片淺綠色心形、不著生零余子、薯塊表皮和肉色均為白色,說明這些云南薯蕷無論從形態(tài)還是分子水平都與其他材料有著明顯差異,但單獨(dú)用一種標(biāo)記方法很難將它們相互之間準(zhǔn)確分開,而使用形態(tài)和分子結(jié)合的方法則可以將它們更好地區(qū)分開。該分類也與劉向宇利用表型性狀和ISSR分子標(biāo)記方法對(duì)山藥種質(zhì)資源分析所得到的結(jié)果[22]相似。黃姍通過SRAP標(biāo)記聚類分析將94份山藥資源分為5類,其中前4類分別為薯蕷、褐苞薯蕷、山薯和參薯,與形態(tài)特征分類一致,而第5類的3份資源按形態(tài)分類屬于參薯類,在分子標(biāo)記聚類分析中則自成一類,與其他參薯相比較存在特殊形態(tài)特征,表明分子標(biāo)記研究種質(zhì)資源較高準(zhǔn)確性[23]。通過聚類分析發(fā)現(xiàn),本試驗(yàn)所選材料普遍為北方地區(qū)種植的薯蕷,缺少?gòu)V東、廣西主栽品種山薯和廣西、福建等地區(qū)的褐苞薯蕷,并不能代表我國(guó)所有山藥種質(zhì)的遺傳背景,今后應(yīng)多收集全國(guó)不同地區(qū)不同品種的山藥材料加以分析研究。形態(tài)學(xué)研究和分子研究結(jié)果存在差異在于它們?cè)诓煌瑢用嫔媳憩F(xiàn)植物的遺傳多樣性,形態(tài)學(xué)研究根據(jù)植物的表型性狀來區(qū)分遺傳變異和品系差異,而分子標(biāo)記直接體現(xiàn)了種質(zhì)之間的基因型差異,與基因表達(dá)和環(huán)境條件無關(guān),因此其親緣關(guān)系分析結(jié)果更準(zhǔn)確[24]。山藥具有很強(qiáng)的區(qū)域性,不同生態(tài)區(qū)域?qū)ν环N質(zhì)的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)特征有較大影響。因此,在遺傳多樣性研究中,選擇形態(tài)學(xué)標(biāo)記與分子標(biāo)記相結(jié)合,有助于更客觀、更準(zhǔn)確地確定種質(zhì)資源間的特異性。