CRM1和SOCS1在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用及與預(yù)后的關(guān)系

劉王靜,孫端陽,王興枝子,龍喜帶,趙志文,黃炳臣

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,廣西 百色 533000)

胃癌是起源于黏膜上皮或腺上皮的具有高度異質(zhì)性的消化道常見惡性腫瘤之一,在我國胃癌的發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌[1-2]。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活或抑制與胃癌細(xì)胞的惡性增殖密切相關(guān)。出核因子(chromosome maintenance region1,CRM1),也稱輸出蛋白1(XPO1),是多種腫瘤抑制蛋白和致癌蛋白進(jìn)行核輸出載體蛋白,其異?？梢鸺?xì)胞失去正常功能并與腫瘤性轉(zhuǎn)化相關(guān)。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子1(SOCS1),參與JAK/STAT信號通路發(fā)揮抑制作用,JAK/STAT信號通路可以被多種細(xì)胞因子、激素及生長因子刺激誘導(dǎo),刺激SOCS1的表達(dá),繼而又對細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行反饋抑制,SOCS1也可直接抑制STAT的受體與相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究以免疫組織化學(xué)方法檢測低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、進(jìn)展期胃癌及對應(yīng)癌旁組織中CRM1、SOCS1的表達(dá)變化,分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系及預(yù)后。

1 資料與方法

1.1病例 選擇右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2019年4月至2020年8月期間胃鏡下活檢取材低級別上皮內(nèi)瘤變胃組織標(biāo)本27例、高級別上皮內(nèi)瘤變組織標(biāo)本26例、胃癌組織標(biāo)本67例及對應(yīng)癌旁胃黏膜組織標(biāo)本67例( 距胃癌組織≥5cm)。67例胃癌患者中,男性44例,女性23例,年齡范圍29～79歲,平均年齡(55.67±11.92)歲,<60歲44例,≥60歲23例;腫瘤最大直徑≥5 cm有40例,<5 cm有27例;T分期:T1期12例,T2期14例,T3期29例,T4期12例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例;HP感染陽性12例,陰性55例;Laurén分型:腸型22例,彌漫型40例,混合型5例。所有病例術(shù)前均未接受放化療、生物治療或靶向治療,不伴有其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病或惡性腫瘤,研究經(jīng)倫理委員會(huì)審查。

1.2隨訪 所有患者均通過電話進(jìn)行術(shù)后總生存時(shí)間(overall survival,OS)隨訪,以月為單位并記錄相應(yīng)的生存時(shí)間。以胃癌確診時(shí)間為起點(diǎn),觀察終止時(shí)間為患者死亡日期或腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或失訪,隨訪時(shí)間范圍為0.36～37.98個(gè)月,中位生存11.96個(gè)月,失訪患者有19例,11例死亡,37例存活。

1.3方法 內(nèi)鏡小活檢標(biāo)本離體30 min內(nèi)經(jīng)10%中性福爾馬林固定6～12 h,手術(shù)切除標(biāo)本離體30 min內(nèi)切開固定24～36 h,常規(guī)石蠟包埋,3 μm連續(xù)切片,HE染色后于鏡下觀察;免疫組織化學(xué)染色采用EnVision法,鼠抗人CRM1和SOCS1單克隆抗體、免疫組化顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司,具體操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4結(jié)果判讀 CRM1和SOCS1陽性為腫瘤細(xì)胞胞核和/或胞漿著色。以腫瘤細(xì)胞胞漿或胞核染色強(qiáng)度計(jì)分: 0分不著色;1分淡黃色;2分棕黃色;3分棕褐色。任取10個(gè)高倍視野(HPF),按陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞百分比計(jì)分: 0分為陰性;1分為陽性細(xì)胞數(shù)≤25%;2分為26%～50%;3分為51%～75%;4分為陽性腫瘤細(xì)胞≥76%。最后兩項(xiàng)記分相乘得分≤3分為低表達(dá),>3分為高表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。癌組織與癌旁組織間CRM1、SOCS1表達(dá)情況的比較使用配對χ2檢驗(yàn),CRM1、SOCS1表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier Plotter繪制生存曲線圖,多因素Cox分析胃癌CRM1及SOCS1表達(dá)與患者生存期之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1CRM1在癌旁組織、低級別瘤變、高級別瘤變和胃癌中的表達(dá) 細(xì)胞核和/或胞漿著色呈淡黃、棕黃及棕褐色為CRM1陽性表達(dá),見圖1。CRM1在癌旁組織、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變及胃癌組織中的高表達(dá)率分別為7.46%(5/67)、62.96%(17/27)、73.08%(19/26)和64.18%(43/67),CRM1在低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變及胃癌組織中的高表達(dá)率均明顯高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為χ2=33.068,P<0.001;χ2=42.118,P<0.001;χ2=46.874,P<0.001),而在低級別、高級別上皮內(nèi)瘤變和癌組織中的高表達(dá)率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

注:A.CRM1在癌旁組織中的上皮細(xì)胞核及胞漿未見表達(dá);B.CRM1在低級別上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞核及胞漿呈淡黃色表達(dá);C.CRM1在高級別上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞核及胞漿黃色表達(dá);D.CRM1在胃癌組織中細(xì)胞核及細(xì)胞漿棕黃色表達(dá)。

表1 胃癌不同演進(jìn)階段的CRM1、SOCS1表達(dá)情況

2.2SOCS1在癌旁組織、低級別瘤變、高級別瘤變和胃癌中的表達(dá) 細(xì)胞核和/或胞漿著色呈淡黃、棕黃及棕褐色為SOCS1陽性表達(dá),見圖2。SOCS1在癌旁組織、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變及胃癌組織中的高表達(dá)率分別為68.66%(46/67)、59.26%(16/27)、50.00%(13/26)和29.85%(20/67),SOCS1在癌組織中的高表達(dá)明顯低于在癌旁組織和低級別瘤變中的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為χ2=20.184,P<0.001;χ2=7.043,P=0.008),見表1。

注:E.SOCS1在癌旁組織中細(xì)胞核及細(xì)胞漿棕褐色表達(dá);F.SOCS1在低級別上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞核及細(xì)胞漿呈黃色表達(dá);G.SOCS1在高級別上皮內(nèi)瘤變中部分細(xì)胞核及細(xì)胞漿淡黃色表達(dá);H.SOCS1在胃癌組織中細(xì)胞核及細(xì)胞漿表達(dá)極低或不表達(dá)。

2.3胃癌組織中CRM1及SOCS1的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果顯示,T1+T2期和T3+T4期的高表達(dá)率分別為42.31%(11/26)和78.05%(32/41),CRM1在T3+T4期組的高表達(dá)率明顯高于T1+T2組的高表達(dá)率(χ2=8.841,P=0.003),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高表達(dá)率分別為76.47%(39/51)和25.00%(4/16),CRM1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=14.035,P<0.001)。與患者年齡、性別、腫瘤大小、是否HP感染及Laurén分型臨床病理參數(shù)無關(guān)(P>0.05),見表2。

2.4胃癌組織中CRM1表達(dá)與SOCS1表達(dá)的相關(guān)性 胃癌組織中CRM1與SOCS1共同低表達(dá)22例、共同高表達(dá)3例、CRM1高表達(dá)而SOCS1低表達(dá)40例、SOCS1高表達(dá)而CRM1低表達(dá)2例,Spearman相關(guān)分析顯示,CRM1與SOCS1表達(dá)無相關(guān)性(R=-0.025,P=0.842)。

表2 胃癌組織CRM1及SOCS1的表達(dá)患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5胃癌組織中CRM1及SOCS1表達(dá)與患者生存預(yù)后相關(guān) 對67例胃癌患者進(jìn)行隨訪,CRM1低表達(dá)患者中位生存期為21.31個(gè)月,高表達(dá)患者中位生存期為8.31個(gè)月,Kaplan-Meier Plotter生存分析結(jié)果表明CRM1高表達(dá)胃癌患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)胃癌患者(χ2=4.198,P=0.040),說明CRM1高表達(dá)意味預(yù)后不良,見圖3。SOCS1低表達(dá)患者中位生存期為13.73個(gè)月,高表達(dá)患者中位生存期為7.62個(gè)月,SOCS1高表達(dá)胃癌患者與低表達(dá)胃癌患者生存時(shí)間無明顯差異(χ2=1.042,P=0.307),見圖4。以預(yù)后狀態(tài)為因變量,賦值0=生存,1=死亡,將各項(xiàng)臨床病理特征、CRM1表達(dá)及SOCS1表達(dá)納入單因素Cox分析,賦值情況:性別:0=男性,1=女性;年齡:0=≤60歲,1=>60歲;腫瘤大小:0=≤5 cm,1=>5 cm;浸潤深度:0=T1～T2期,1=T3～T4期;HP感染:0=否,1=是;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:0=無,1=有;CRM1:0=低表達(dá),1=高表達(dá);SOCS1:0=低表達(dá),1=高表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)性別(P=0.044,HR=0.123,95%CI:0.016～0.948)、腫瘤大小(P=0.005,HR=6.044,95%CI:1.701～21.470)、浸潤深度(P=0.009,HR=7.794,95%CI:1.667～36.434)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將以上P<0.05的變量納入多因素Cox回歸分析,得出腫瘤大小具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),是影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素,見表3。

3 討論

多數(shù)胃癌伴有上皮內(nèi)瘤變的異常增生階段,從低級別到高級別瘤變和癌形成伴隨眾多基因的參與并表現(xiàn)為形態(tài)、功能的一系列改變,分子表型和生物學(xué)行為均具有明顯異質(zhì)性。CRM1也稱為核輸出蛋白1(XPO1),是由XPO1基因編碼的染色體區(qū)域維持蛋白1,其主要功能是促進(jìn)包括腫瘤抑制蛋白在內(nèi)的分子從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)從而使其失活的主要蛋白體。在真核細(xì)胞中介導(dǎo)特定蛋白質(zhì)從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn),細(xì)胞內(nèi)的核蛋白運(yùn)輸對于引導(dǎo)重要蛋白質(zhì)和RNA在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸至關(guān)重要,蛋白質(zhì)從細(xì)胞核的輸出主要受CRM1基因調(diào)控,由于旺盛的代謝需求,惡性腫瘤細(xì)胞對蛋白質(zhì)的核質(zhì)運(yùn)輸具有更高的依賴性,在腫瘤中CRM1活性增高,CRM1對關(guān)鍵抑制因子和致癌蛋白細(xì)胞內(nèi)定位的失調(diào)有利于腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展。文獻(xiàn)報(bào)道[3-7],CRM1在多種人類腫瘤如膠質(zhì)瘤、胰腺癌、卵巢癌及大細(xì)胞淋巴瘤中均表達(dá)上調(diào),且CRM1高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān),CRM1突變可能是B細(xì)胞淋巴瘤和B細(xì)胞白血病的驅(qū)動(dòng)因子[8]。

圖3 CRM1表達(dá)與術(shù)后總生存期的關(guān)系 圖4 SOCS1表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系

表3 67例GC患者單因素和多因素Cox分析

PIK3/AKT信號通路可提高腫瘤生長速度和侵襲能力[9],PAN L J等[10]應(yīng)用神經(jīng)母細(xì)胞瘤研究verdinexor(KPT-335)的體外抗腫瘤作用中發(fā)現(xiàn),verdinexor抑制劑抑制CRM1后,細(xì)胞P13K/AKT信號通路受到抑制,進(jìn)而抑制FOXO1和RB1在神經(jīng)母細(xì)胞核內(nèi)積累,抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并通過激活P53功能,誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯,高表達(dá)CRM1的神經(jīng)母細(xì)胞瘤與患者的惡性進(jìn)展有關(guān)。以上研究結(jié)果提示,CRM1可能參與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,在促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為發(fā)揮重要生物學(xué)作用。本研究結(jié)果顯示,在低級別、高級別上皮內(nèi)瘤變和胃癌組織中的CRM1的表達(dá)均顯著高于癌旁組織,提示CRM1蛋白高表達(dá)可能參與胃黏膜上皮瘤變和癌變過程,在對CRM1表達(dá)的觀察中,胃癌組織的染色陽性強(qiáng)度比低級別瘤變的腺體更強(qiáng)呈棕黃色,而在低級別瘤變和高級別瘤變普遍呈淡黃色或黃色,這種染色的增強(qiáng),說明CRM1基因表達(dá)增強(qiáng)和蛋白含量的增加,可能有助于病理醫(yī)師識別胃黏膜小活檢組織中對于上皮內(nèi)瘤變和胃癌識別。CRM1在胃癌組織中高表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯相關(guān),Kaplan-Meier Plotter生存分析顯示,高表達(dá)CRM1患者的中位生存期為8.31個(gè)月,低表達(dá)患者中位生存期為21.31個(gè)月,前者生存時(shí)間更短。單因素及多因素Cox回歸分析顯示腫瘤大小是影響胃癌患者預(yù)后的因素。

SOCS1是SOCS蛋白家族中的一員,具有N末端區(qū)域、SH2區(qū)和SOCS盒結(jié)構(gòu)域,參與信號蛋白的磷酸化和靶蛋白的泛素-蛋白酶體途徑,是細(xì)胞內(nèi)負(fù)性調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白之一,主要調(diào)控JAK /STAT和TLR信號傳導(dǎo)途徑,JAK-STAT途徑是調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞活化、增殖和分化的細(xì)胞因子的重要通路,SOCS1可以靶向結(jié)合未磷酸化的JAK,阻止JAK的磷酸化而抑制信號傳導(dǎo)[11]。甲基化、突變等各種原因?qū)е耂OCS1表達(dá)減少或抑制SOCS1可促進(jìn)JAK/STAT信號通路的持續(xù)激活,并啟動(dòng)與增殖和侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄;作為泛素化過程的參與蛋白,SOCS1介導(dǎo)泛素化底物的降解和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長,異常DNA甲基化造成的SOCS1沉默有助于各種腫瘤的發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道,SOCS1在子宮頸癌、卵巢癌、肝癌表達(dá)下調(diào)[12-14]。王興等[15]應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌中SOCS1的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜癌組中SOCS1陽性表達(dá)率較增生組和正常組降低,其表達(dá)的缺失與腫瘤肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高Ki67增殖指數(shù)相關(guān)。胃癌是與炎癥相關(guān)密切的腫瘤,有研究表明,幽門螺桿菌感染胃癌患者的SOCS1啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化顯著增高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,癌組織SOCS1陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織,在胃黏膜的低級別和高級別上皮內(nèi)瘤變向進(jìn)展期癌演進(jìn)過程中,SOCS1表達(dá)水平逐漸降低,提示其可能作為胃癌的抑癌基因,由于SOCS1是細(xì)胞因子和生長因子的重要調(diào)節(jié)因子,缺失會(huì)激活致癌信號通路[17]。體外研究證實(shí),沉默SOCS1基因后的食管癌細(xì)胞凋亡減少,而細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)SOCS1表達(dá)缺失與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后存在相關(guān)性,這可能與本組研究的病例較少和隨訪時(shí)間短有關(guān),需擴(kuò)大樣本量深入研究。

綜上所述,CRM1及SOCS1在胃癌組織及癌旁組織中表達(dá)具有顯著性差異,CRM1高表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有相關(guān)性,腫瘤大小是影響胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素;SOCS1在低級別上皮內(nèi)瘤變及胃癌組織中的表達(dá)有差異,本次研究表明二者對于胃癌的診斷有一定的臨床價(jià)值,CRM1與SOCS1的表達(dá)無相關(guān)性,提示兩者在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能不存在相互調(diào)控關(guān)系,其在胃癌進(jìn)展過程中的機(jī)制仍需進(jìn)深入研究。