阿拉伯木聚糖聯(lián)合美多芭對帕金森病大鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β及IFN-γ表達的影響

王功俊,包成政,羅雪蓮,王潔,黃曉華,黃小睿,張仕姣,李雪斌,,3

(1. 右江民族醫(yī)學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000;3. 廣西高校桂西地區(qū)高發(fā)病防治研究重點實驗室,廣西 百色 533000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二種常見的神經(jīng)退行性疾病,全球發(fā)病率估計為0.1%～0.2%[1]。其典型的病理特征是黑質(SN)中多巴胺能神經(jīng)元的逐漸喪失,以及α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的異常聚集導致路易小體(lewy body)的形成[2]。近年來關于Toll 樣受體/核轉錄因子-κB(TLR/NF-κB)信號通路與PD相關炎癥介質產(chǎn)生的研究越來越多[3]。簇集的α-突觸核蛋白與Toll樣受體結合并激活小膠質細胞,核因子-κB(NF-κB)活化,啟動腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細胞介素1(IL-1β)的表達,促炎細胞因子過度產(chǎn)生和分泌誘導細胞死亡并加速PD發(fā)病及病程進展[4]。γ干擾素(IFN-γ)是一種由I型輔助性T細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子[5]。目前的治療方法,如多巴胺能激動劑、抗膽堿能藥或單胺氧化酶抑制劑可以緩解PD癥狀,長期用藥副作用較大,急需研發(fā)新藥物,減緩或停止?jié)撛诘纳窠?jīng)變性過程。然而,目前的治療方法不足以根除或限制疾病的發(fā)展,它們只有助于癥狀的改善,且治療過程中常常出現(xiàn)“開關現(xiàn)象”、“劑末現(xiàn)象”、“晨僵現(xiàn)象”等,影響治療效果。阿拉伯木聚糖(araboxylan,AX)是一種多糖,由阿拉伯糖、木糖和少量其他碳水化合物組成。AX具有抗氧化抗炎、降血糖、抗腫瘤和腸道益生菌菌群的增殖能力[6]。本研究擬采用魚藤酮誘導PD大鼠模型,通過AX干預后觀察PD大鼠的運動癥狀改變情況,檢測炎性因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)分泌,了解各組大鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β及IFN-γ的變化與PD大鼠的神經(jīng)功能相關性,探討AX防治PD可能作用機制,為AX用于預防和/或治療PD臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 健康雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠42只,6～8周齡,體重160～180 g,購買于廣東維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(粵)2022-0063。大鼠飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學院SPF醫(yī)學實驗動物研究中心,大鼠自由攝食,并適應飼養(yǎng)環(huán)境1周。實驗中涉及的動物操作程序已得到右江民族醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑及儀器 魚藤酮及葵花油(美國Sigma公司),美多芭(上海羅氏制藥有限公司),阿拉伯木聚糖(AX)(賽普瑞特分子生物科技遼寧有限公司),兔抗IL-1β單克隆抗體及兔抗IFN-γ單克隆抗體(英國Abcam生物試劑公司),鼠抗β-actin單克隆抗體(中國武漢Protein公司),山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗(美國ThermoFisher公司),冰凍切片機(德國LEICA公司),光學顯微鏡(德國LEICA公司),ELISA試劑盒(中國武漢伊萊瑞特生物科技公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組 SD成年雄性大鼠42只,隨機選取28只進行PD造模,造模后并分為帕金森模型組(PD組)、美多芭組(M組)和阿拉伯木聚糖組(AX 組)、美多芭+阿拉伯木聚糖組(MX組)4個組,每組7只。其余14只隨機分為空白對照組和溶劑對照組,每組7只。

1.2.2造模 采用頸背部皮下注射魚藤酮法制備PD模型:魚藤酮(1.5 mg/kg)溶解于葵花油,濃度1.5 mg/mL,給予頸背部皮下注射[7],每連續(xù)給藥6 d后,停藥1次,連續(xù)28 d。按照YANG Y等[8]行為學標準評分,PD模型大鼠出現(xiàn)典型的毛色變黃變臟、弓背、拒捕減弱、震顫等表現(xiàn)則視為造模成功。溶劑對照組:連續(xù)頸背部皮下注射葵花油1.5 mg/(kg·d) ,每連續(xù)給藥6 d后,停藥1次,連續(xù)28 d。

1.2.3給藥方法 空白對照組、溶劑對照組及PD組:不予處理,正常飼養(yǎng)。 AX組、M組、MX組模型制備成功后,M組美多芭灌胃(50 mg/kg,每天1次)干預,AX組使用AX灌胃(0.8 g/kg,每天1次)干預,MX組使用AX(0.8 g/kg,每天1次)聯(lián)合美多芭(50 mg/kg,每天1次)灌胃,各組大鼠在喂養(yǎng)14 d,最后一次灌胃后24 h,應用懸掛試驗及爬桿進行行為學研究。

1.2.4行為學檢測方法 干預后每只大鼠進行懸掛爬桿和爬桿訓練3次,訓練完畢對其進行行為學測定。懸掛實驗:用于檢測大鼠肌張力,將大鼠兩前爪懸掛于水平放置的金屬絲(直徑 2 mm、長約30 cm) 上,金屬絲距地面1 m,記錄大鼠落地前的時間。對懸掛時間進行評分:0～4 s為0分,5～9 s為1分,10～14 s為2,15～19 s為3分,20～24 s為4分,25～29 s為5分,超過30 s為6分。每只大鼠重復測量3次,每次間隔5 min。爬桿實驗:評估大鼠四肢運動的協(xié)調性,木桿上頂端放置圓形球,桿(高60 cm、直徑0.7 cm)用醫(yī)用紗布纏好,保證有摩擦力;將大鼠頭向下放置在木桿的頂部,使大鼠沿桿自然爬下,觀察其下行過程中的行為并計分,每只鼠允許爬桿3次。評分標準如下:四肢并用,一次順利從桿上爬下為0分;螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行為的為0.5分;上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下,但可抱緊金屬桿為1分;滑行后掉落為1.5分;不能抓桿,直接掉落為2.0分。

1.2.5樣本提取 所有大鼠進行行為學測試完成后,次日每組隨機選取6只大鼠用異氟醚對大鼠進行深度麻醉后,開腹腔腹主動脈采血,常溫靜置1 h后,于4 ℃離心機1 000 r/min,離心20 min,取上清液,放-80 ℃存冰箱。 每組隨機選取6只大鼠,斷頭取腦,于冰盤上迅速開顱取腦,液氮急速冷凍,放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?用于WB檢測大鼠黑質紋狀體的IFN-γ蛋白表達;另外剩下每組1只大鼠進行心腔內(nèi)注射生理鹽水和4%多聚甲醛進行內(nèi)固定,迅速取腦,置于4%多聚甲醛室溫保存,應用免疫組化檢測IL-1β蛋白的表達。

1.2.6實驗方法

1.2.6.1ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β含量 從-80 ℃冰箱取出血清,靜置20 min。按照說明書給樣本及標準品稀釋,每孔100 μL加樣分別加入樣品稀釋液、不同濃度梯度的標準品、待測樣品,封板膜封板,37°孵育,加酶,顯色后加入終止液,用酶標儀檢測波長在450 nm處吸光度值。

1.2.6.2免疫組化 從4%多聚甲醛取出大腦,按照大鼠腦定位圖譜,切到大鼠黑質紋狀體層面,常規(guī)脫蠟至水,厚度為6 μm,切片用3%檸檬酸修復液高壓修復,打開頂閥后修復10 min。將壓力鍋自然冷卻至室溫,然后用蒸餾水洗滌5 min。加入3%甲醇過氧化氫20 min,用蒸餾水沖洗5 min,用PBS浸泡1 min,滴5%BSA,室溫孵育30 min棄去,滴一抗工作溶液在4 ℃過夜,滴二抗,在37 ℃孵育20 min,封片,顯微鏡觀察、圖像采集。

1.2.6.3WB檢測 從-80°冰箱取出樣本,隨機分離出一側中腦黑質放于離心管中,于研缽中磨碎黑質腦組織,蛋白提取試劑盒提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,依次進行12.5% SDS-PACE 電泳分離白,電泳至溴酚藍剛跑出即可終止,轉印至 PDDF膜上,快速封閉液封,一抗孵育過夜,TBST洗膜3遍,加入二抗,室溫孵育2 h,ECL法發(fā)光顯影,圖片保存,ImageJ軟件分析數(shù)據(jù),以β-actin為內(nèi)參,計算相對表達量。

2 結果

2.1行為學結果

2.1.1懸掛實驗 PD模型組與空白組、溶劑組懸掛時間明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);AX組、M組與PD模型組比較,懸掛時間延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);MX組與PD模型組比較,懸掛時間延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而且MX組較AX組、M組懸掛時間延長,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);說明各組大鼠給予干預后,明顯改善了大鼠的肌張力,而且聯(lián)合干預改善癥狀更明顯。見表1。

表1 各組大鼠懸掛實驗結果

2.1.2爬桿實驗 PD模型組與空白組、溶劑組,大鼠四肢協(xié)調能力明顯減弱,下滑加速,甚至不能抱桿、直接墜落,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。AX組、M組大鼠與PD組比較,四肢協(xié)調力顯著改善,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MX組較PD組明顯改善癥狀,爬桿過程中,四肢并用,動作協(xié)調,能一次性爬到桿底,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);說明各組大鼠給予干預后,明顯改善了大鼠的四肢協(xié)調力,而且聯(lián)合干預改善癥狀更明顯。見表2。

表2 各組大鼠爬桿實驗結果

2.2ELISA檢驗 與空白對照組、溶劑對照組比較,PD模型組血清TNF-α含量增高,差異有顯著意義(P<0.001);AX、M組、MX組與PD模型組比較血清TNF-α含量均降低,AX組與PD模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);M組與PD模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義P<0.05;MX組與PD模型組比較,差異有顯著意義(P<0.001)。MX組與M組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);MX組與AX組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白對照組、溶劑對照組比較,PD模型組血清IL-1β含量增高,差異有顯著意義(P<0.001);AX、M組、MX組與PD模型組比較血清IL-1β含量均降低,AX組與PD模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);M組、MX組與PD模型組比較,差異有顯著意義(P<0.001)。MX組與M組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);M組、MX組與AX組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠ELISA檢測TNF-α、IL-1β結果 單位:μg/μL

2.3WB檢測各組大鼠腦黑質紋狀體組織中IFN-γ蛋白相對表達量比較 與空白對照組、溶劑對照組比較,PD組黑質紋狀體IFN-γ的含量增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);與PD組比較,AX組、M組黑質紋狀體IFN-γ的含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與PD組比較,MX組黑質紋狀體IFN-γ的含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與AX組比較,MX組黑質紋狀體BDNF蛋白表達增加,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。M組與AX組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

注:IFN-γ(γ干擾素) ;β-actin內(nèi)參。

2.4免疫組化 與空白對照組、溶劑對照組比較,模型組黑質紋狀體IL-1β表達量明顯增加;與PD組比較,AX、M組、MX組黑質紋狀體IL-1β表達量減少。如圖3。

注:IFN-γ(γ干擾素);兩組比較,*P<0.001,**P<0.05。

注:細胞核為藍色,陽性表達為棕黃色。

3 討論

PD是一種進行性神經(jīng)退行性疾病,神經(jīng)炎癥反應是導致多巴胺能神經(jīng)元神經(jīng)變性的原因之一[9-10]。大量研究結果表明,炎癥和氧化應激與PD發(fā)病機制之間的聯(lián)系已被證實,大腦中促炎癥細胞因子的水平升高,如TNF-α、IL-1β和IFN-γ,是PD的主要病理特征之一[11]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞,如小膠質細胞和星形膠質細胞,通過釋放因子來調節(jié)炎癥,以及活性氧的形成[12]。這些因素的釋放導致炎癥反應,對神經(jīng)元有毒性作用。因此,過度和不規(guī)則的小膠質細胞激活在PD病理中起著重要作用,促炎癥細胞因子的釋放,導致細胞凋亡,以及多巴胺能神經(jīng)元的損失[4]。過去數(shù)年發(fā)表的大量關于炎癥在多巴胺能神經(jīng)元逐漸喪失中的作用的研究證實,神經(jīng)炎癥是PD致病的重要組成部分[13]。在動物模型中,已知農(nóng)藥魚藤酮能誘導多巴胺能神經(jīng)元的中度損傷,并再現(xiàn)PD的許多運動和非運動癥狀,包括周圍病變、神經(jīng)炎癥、睡眠障礙,目前已是造PD大鼠模型的經(jīng)典方法[14]。本研究采用連續(xù)頸背部皮下注射魚藤酮溶劑于葵花油1.5 mg/(kg·d) ,每連續(xù)給藥6 d后,停藥1次,連續(xù)28 d,PD模型大鼠出現(xiàn)典型的毛色變黃變臟、弓背、拒捕減弱、震顫等表現(xiàn)則視為造模成功[15]。研究表明,AX是較為有效的免疫調節(jié)劑,還具有抗炎、抗氧化、降血糖和抗腫瘤的特性[16-17]。AX干預大鼠后抑制了NF-κB的表達[18-19], NF-κB信號通路與氧化應激和炎癥反應密切相關[20],NF-κB可以改變炎癥細胞因子如TNF-α和IL-1β的表達[19]。本研究中探討了AX對PD動物模型腦內(nèi)神經(jīng)炎性損傷的保護作用,實驗結果表明,神經(jīng)毒性物質魚藤酮誘導的PD模型腦內(nèi)黑質紋狀體小膠質細胞和星形膠質細胞的激活,促進血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β的釋放,腦內(nèi)黑質紋狀體IL-1β和IFN-γ表達量增高。AX組、M組、MX組與PD組比較,血清中TNF-α、IL-1β的含量均降低,而且MX組與AX組、M組比較,其降低更為明顯;血清中TNF-α在MX組與AX組比較中,差異有統(tǒng)計學意義。大腦內(nèi)黑質紋狀體WB結果顯示,AX組、M組、MX組給予干預后IFN-γ蛋白相對的表達量均較低,而且MX組與AX組、M組比較,其降低較為明顯;在行為學懸掛實驗和爬桿實驗中發(fā)現(xiàn)各組大鼠給予干預后癥狀明顯改善,結果表明AX能有效地改善PD大鼠的運動癥狀及抑制炎癥因子的釋放。

本研究結果表明,AX聯(lián)合美多芭能有效的抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的釋放,減輕PD大鼠黑質紋狀體神經(jīng)元的損失,較好地改善PD的神經(jīng)功能,為AX聯(lián)合美多芭用于治療PD的臨床應用提供了新的靶點,同時為臨床用藥選擇提供了新的思路。