茶樹CsPHT1;3基因特性及其對硒的響應研究

郭麗娜，郝心愿，王璐，祁蒙，李曉嫚，任恒澤，鄭青華，王新超，曾建明*

茶樹基因特性及其對硒的響應研究

郭麗娜1,2，郝心愿2，王璐2，祁蒙1，李曉嫚2，任恒澤2，鄭青華2，王新超2，曾建明1,2*

1. 安康市富硒產品研發(fā)中心，陜西 安康 726000；2. 中國農業(yè)科學院茶葉研究所/農業(yè)農村部茶樹生物學與資源利用特種經濟動植物生物學與遺傳育種重點實驗室，浙江 杭州 310008

茶樹具有較強的富硒能力，有關磷酸鹽轉運體參與硒吸收的分子機理研究較少。克隆茶樹基因，并探究該基因的特性及對硒濃度和價態(tài)、pH、時間的響應，以及在不同聚硒茶樹品系中的表達情況?；蛱匦苑治霰砻?，屬于磷酸鹽轉運蛋白PHT1亞家族成員，定位于質膜且具有PHT1蛋白保守結構域GGDYPLSATIxSE。在不同器官中表達模式分析表明，在成熟葉和根中表達量顯著高于其他器官。不同濃度和價態(tài)硒誘導結果表明，在茶樹根系中于1?d和7?d顯著受低濃度Se4+誘導表達；除處理后3?d外，茶樹根系中顯著受Se6+誘導上調表達且基本不受Se6+濃度影響。不同pH處理茶樹結果表明，茶樹根系中在pH=5時對Se4+響應于24?h達最高；在pH=3時對Se4+響應于48?h達最高；而在pH=7時，對Se4+響應于72?h達最高。硒酸鈉處理不同聚硒茶樹品系結果表明，在不同品系的葉和根中的表達均不響應硒酸鈉處理；而亞硒酸鈉處理不同聚硒茶樹品系結果表明，在高聚硒品種葉中顯著上調表達。以上研究結果表明，可能參與茶樹根系對亞硒酸鹽的吸收和再分配，其對富硒茶樹品系的選育具有重要意義。

茶樹；硒吸收；亞硒酸鹽；硒；pH

硒是人體必需的微量元素，適量攝入硒有益于人體健康，而缺硒或過量攝入硒則會引起一些疾病[1]。在植物體內，適量的硒具有提高植物抗氧化作用，有利于植物的生長，而過量的硒會導致植物受到毒害，這可能由于硒參與植物細胞體內的氧化應激反應或硒代氨基酸非特異性結合到蛋白質中影響蛋白質的折疊和功能[2]。富硒植物作為人體重要補硒來源之一，主要利用根系從土壤中吸收硒元素。在我國，土壤中的硒資源分布極不均勻，有51%的土壤處于缺硒狀態(tài)[3]，而在缺硒地區(qū)生活的人們僅依靠食物補硒無法滿足人體對于硒的需求。茶樹具有較強的富硒能力，茶葉中硒主要以有益于人體健康的有機硒形態(tài)存在[4]。因此，通過合理的開發(fā)富硒茶樹品種對人們補充硒元素具有重要意義。

植物根部組織主要攝取以SeO32-和SeO42-形態(tài)為主的硒元素。硒元素在堿性土壤中主要以硒酸鹽形態(tài)存在，而在酸性土壤中主要以亞硒酸鹽形態(tài)存在。植物根系主要利用硫酸鹽轉運體吸收硒酸鹽[5-6]；而植物對于亞硒酸鹽的吸收機制尚不清楚。Shrift等[7]研究發(fā)現，亞硒酸鹽主要通過被動擴散的方式進入植物體內，而Broyer等[8]研究發(fā)現磷酸鹽濃度的增加會抑制植物根系對亞硒酸鹽的吸收。水稻PHT1家族成員相關研究表明，OsPHT1;2和OsPHT1;8磷酸鹽轉運蛋白均參與根系對磷酸鹽和亞硒酸鹽的吸收和轉運[9-10]，和在維持根系中磷酸鹽濃度平衡時功能冗余[11]。然而目前關于參與植物根系吸收和轉運亞硒酸鹽的相關研究較少。

亞硒酸鹽是茶樹根系主要吸收的無機鹽形式之一。其中，亞硒酸鹽被吸收后大部分累積于根部組織，而少部分轉運并積累在葉片中[12]。Cao等[13]研究發(fā)現，茶樹中PHT1家族成員主要與根部亞硒酸鹽的吸收或者轉運相關，其中在茶樹根和莖中高表達，且在根部組織的表達量隨亞硒酸鈉處理濃度的升高顯著降低。辛華洪[14]研究了茶樹中的PHT1家族同源基因和在不同器官中表達以及對磷脅迫的響應，并驗證體外轉運磷的功能。Ren等[12]利用茶樹根部組織的轉錄組與蛋白組聯(lián)合分析發(fā)現，在亞硒酸鈉處理后表達量顯著上調。而關于基因特性以及對硒的響應研究鮮有報道。

本研究主要對基因特性進行分析，并探究基因在不同濃度硒、價態(tài)硒、pH、時間以及不同茶樹聚硒能力條件下的響應模式，旨在為今后開展磷酸鹽轉運家族基因參與亞硒酸鈉吸收和轉運研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以中國農業(yè)科學院茶葉研究所（浙江杭州）試驗基地的中茶108茶樹品種，以及經過2019—2022年在杭州、恩施兩地3年重復選育的高（CT2009-0028、中茶硒茶4號、硒茶1號）、低（CT2009-0025）聚硒品系為試驗材料。取種植于試驗基地的中茶108的芽、一葉、二葉、三葉、成熟葉、莖和根部組織樣本，立即置于液氮中速凍，保存在–80?℃超低溫冰箱中備用。

硒酸鈉（Na2SeO4）和亞硒酸鈉（Na2SeO3）分別購自于山東西亞化學工業(yè)有限公司和Sigma有限公司，茶樹木本植物營養(yǎng)液購自于北京酷來博科技有限公司。

1.2 試驗處理

1.2.1 不同濃度硒酸鈉和亞硒酸鈉處理

選取長勢一致的一年生中茶108茶樹，于pH 5.0的1/4營養(yǎng)液中培養(yǎng)，營養(yǎng)液的配方參照文獻[15]，于22?℃、光照12?h，全天通氣條件下培養(yǎng)。每隔1周更換1次營養(yǎng)液，待茶苗長出新根，置于空白對照及分別含Na2SeO4（0.6、3?mg·kg-1）和Na2SeO3（0.6、3?mg·kg-1）的1/4茶樹木本植物營養(yǎng)液中處理，分別于1、3、5?d和7?d取根部組織，立即放于液氮中，保存于–80?℃超低溫冰箱中備用，每個處理設置4個生物學重復。

1.2.2 不同培養(yǎng)時間和pH處理

選取長勢一致的一年生中茶108，其培養(yǎng)方式同1.2.1章節(jié)，將長出新根且長勢健康一致的中茶108植株置于空白對照及分別含Na2SeO4（5?μmol·L-1）和Na2SeO3（5?μmol·L-1）的1/4茶樹木本植物營養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別調節(jié)pH至3、5和7，分別在24、48、72?h取根部組織，立即放于液氮中，保存于–80℃超低溫冰箱中備用，每個處理設置4個生物學重復。

1.2.3 不同價態(tài)硒對不同茶樹品系的處理

選取長勢一致的一年生CT2009-0028、中茶硒茶4號、硒茶1號和CT2009-0025，其培養(yǎng)方式同1.2.1章節(jié)，將長出新根的不同高低聚硒茶樹品種置于空白對照及分別含5?μmol·L-1Na2SeO4和5?μmol·L-1Na2SeO3的溶液中，14?d后，分別取成熟葉和根部組織，立即放于液氮中，保存于–80?℃超低溫冰箱中備用，每個處理設置4個生物學重復。

1.3 CsPHT1;3的生物信息學分析

基于茶樹基因組數據和硒響應的轉錄組數據庫[12,16]篩選出PHT1;3的同源序列。通過ORF Finder（http://www.bioinformatics.org/ sms2/ orf_find.html）查找基因的開放閱讀框信息，并使用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BlastX和BlastN分別對其氨基酸序列和核酸序列查找同源序列。利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（NJ）設置Bootstrap值為1?000，構建關于PHT1家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用MEME網站（https://meme-suite. org/meme/tools/meme）構建PHT1家族的蛋白保守結構域，使用TBtools軟件將進化樹和蛋白保守結構域整合作圖。利用ExPASy軟件（https://web.expasy.org/protparam）預測的分子量和等電點信息。

1.4 CsPHT1;3的克隆

依據開放閱讀框序列，利用Primer 5.0設計特異引物，引物序列如表1所示。采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶[寶生物工程（大連）有限公司]和RT-PCR體系擴增基因全長序列，PCR擴增程序為94?℃ 5?min；94?℃ 30?s，60?℃ 30?s，72?℃ 2?min，35個循環(huán)；72?℃ 10?min；4?℃保存。

1.5 CsPHT1;3的亞細胞定位

通過基因的ORF序列和pBWA(V)HS載體序列設計含酶切位點且去除原基因終止密碼子的引物序列（表1）。利用雙酶切酶連反應，將基因與含N端35?S-eGFP的pBWA(V)HS載體相連接。提取水稻原生質體，利用聚乙二醇4000（PEG4000）介導將融合表達載體質粒轉入水稻原生質體，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察亞細胞定位結果[17]。

表1 試驗所用引物

1.6 CsPHT1;3的qRT-PCR分析

1.7 數據分析

所有數據均用4次獨立測量數據的平均值±標準差表示。使用GraphPad Prism 8.0軟件進行圖形繪制。使用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，檢驗進行各組間的統(tǒng)計學差異分析。

2 結果與分析

2.1 CsPHT1;3的克隆和生物信息學分析

基于開放閱讀框信息，以中茶108根組織的cDNA為模板，利用特異性引物克隆獲得。（Genbank No. OP219455）的開放閱讀框包含1?620個堿基，編碼539個氨基酸，預測蛋白分子量為59.1?kDa，等電點為8.62。

為明確茶樹基因與其他物種基因之間的進化關系及序列特征，利用氨基酸序列構建進化樹和蛋白保守結構域（圖1A）。進化樹分析結果表明，屬于PHT1家族，與巴坦杏、大豆、擬南芥和水稻的親緣關系更近，而與擬南芥的和以及水稻的和親緣關系較遠。預測結果表明，包含12個保守結構域，且每個基因的保守結構域數量在4～12個，除了只包含4個基序，其他基因均含有基序1～基序7和基序9。將在NCBI中進行BlastP同源比對，結果表明，CsPHT1;3磷酸轉運蛋白的氨基酸序列與巴坦杏（，XP_034228833.1）PdPHT1;3的相似度最高，達79%；與大豆（，ACY74614.1）GmPHT1;3、擬南芥（，AT5G 43360.17）AtPHT1;3相似度分別為78%和77%。CsPHT1;3與其他物種中的PHT家族相似，均具有預測的12個跨膜固定結構域。利用DNAMAN多序列比對分析發(fā)現，CsPHT1;3中也鑒定出了Pht1的保守結構域GGDYPLSATIxSE（圖1B）。

2.2 CsPHT1;3的組織特異性及亞細胞定位

由圖2可知，隨葉片成熟度的增加，表達量顯著增加；在成熟葉和根中高表達且極顯著高于其他器官。

注：A，不同物種中的PHTs氨基酸序列構建進化樹；線性代表進化距離，CsPHT1;3用圓圈表示(●)。B，陰影表示相同氨基酸，點表示間隙，劃線標示Pht1的特征序列，虛線表示12個跨膜結構域

將重組質粒pBWA(V)HS-CsPHT1;3-GLosgfp與細胞膜marker共轉入水稻原生質體，24?h后在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。CsPHT1;3蛋白亞細胞定位結果表明（圖3），CsPH1;3-GFP融合蛋白在水稻原生質體中定位于細胞膜中。

注：誤差線表示4個生物學重復的標準偏差，不同小寫字母代表在0.05水平上差異顯著

注：A1、B1、C1、D1為陽性對照，只含有35?S啟動子和綠色熒光蛋白（GFP）；A2、B2、C2、D2為CsPHT1;3蛋白的亞細胞定位

2.3 CsPHT1;3對不同濃度和價態(tài)硒的響應

不同濃度硒和價態(tài)硒對誘導表達結果表明，與對照相比，除3?d外，0.6?mg·kg-1和3?mg·kg-1硒酸鈉處理均極顯著誘導的上調表達，表達量在5?d時最高。0.6?mg·kg-1和3?mg·kg-1亞硒酸鈉處理茶樹時，表達量均于5?d達到最高，除3?d外，其余時間點均表現出低濃度的亞硒酸鈉處理更有利于上調表達，而高濃度亞硒酸鈉處理7?d時，顯著誘導下調表達（圖4）。

2.4 CsPHT1;3對不同pH、時間以及不同價態(tài)硒的響應

不同pH、時間以及不同價態(tài)硒處理茶樹時，在茶樹根系中的表達情況如圖5所示，在pH=3時，受硒酸鈉與亞硒酸鈉的誘導均于48?h達到最高；在pH=5時，于24?h時顯著受亞硒酸鈉的誘導且高于硒酸鈉，隨處理時間的增加，亞硒酸鈉對誘導表達減弱，而硒酸鈉對誘導表達增強，且在72?h時，硒酸鈉對基因的誘導顯著高于亞硒酸鈉；在pH=7時，亞硒酸鈉對的誘導隨處理時間的增加而增強，且在72?h時達到最高，上調水平約為對照的7倍。

注：誤差線表示4個生物學重復的標準偏差，*代表在0.05水平上差異顯著，**代表在0.01水平上差異極顯著

注：誤差線表示4個生物學重復的標準偏差，*代表在0.05水平上差異顯著，**代表在0.01水平上差異極顯著

2.5 不同聚硒能力茶樹品系中CsPHT1;3對硒的響應

以高低聚硒茶樹品系為研究對象，分別進行5?μmol·L-1的Na2SeO4和Na2SeO3處理，成熟葉和根中的定量結果如圖6所示。Na2SeO4處理茶樹時，各品種成熟葉和根中的表達量均無顯著變化；而Na2SeO3處理茶樹時，在3個高聚硒品種成熟葉中的表達量均顯著上調，且在硒茶1號高聚硒品種根中的表達量也顯著上調。

3 討論

在磷酸鹽轉運蛋白中，研究最廣泛的是PHT1亞家族成員。隨著擬南芥、水稻和茶樹植物全基因組分析的完成，通過比較基因組方法鑒定出更多具有同源性的PHT1亞家族成員，目前在擬南芥、水稻和茶樹中分別鑒定出9個、13個[19]和9個基因[13]。水稻和擬南芥中的PHT1亞家族成員均編碼H+/Pi共轉運體，具有高度序列相似度且包含12個可預測跨膜結構域[20]，主要定位于質膜上，這與研究結果相一致?；蚬δ芤话闩c蛋白定位以及基因表達模式密切相關[21]。本研究發(fā)現，CsPHT1;3蛋白定位于質膜上且在茶樹的芽、葉、莖、根等器官中均有表達，尤其在成熟葉和根中表達量較高。因此，推測可能參與元素的吸收和再分配。

硒酸鹽和亞硒酸鹽是土壤中硒主要存在的無機形態(tài)，也是植物硒吸收的主要來源。土壤中硒的賦存形態(tài)易受pH值等因素的影響[22]。在酸性土壤中，亞硒酸鈉主要以HSeO3-形式存在，而在堿性土壤中，主要以SeO32-形式存在[23]。茶樹適宜生長于pH為4.5～6.5的土壤中，主要吸收亞硒酸鹽[15]。本研究發(fā)現，pH能夠顯著誘導的表達。相比較于pH=7處理，茶樹根系中的表達更易受pH=5和pH=3處理的短時誘導。硒濃度也是影響硒賦存形態(tài)的主要因素之一，低濃度亞硒酸鹽主要以H2SeO3、HSeO3-和SeO32-形式存在，而高濃度亞硒酸鹽可能主要以(H2SeO3)2、H(HSeO3)2-和(HSeO3)22-的復雜形式存在[24]。其中，HSeO3-是由磷酸鹽轉運體吸收和轉運進入植物根系。Cao等[13]研究發(fā)現，在茶樹根中響應低濃度亞硒酸鹽處理。本研究發(fā)現，在適宜pH條件下（pH=5），在處理1?d和7?d時顯著受低濃度亞硒酸鈉誘導。以上研究結果表明，茶樹根系中的表達受pH和硒濃度的誘導，可能在參與吸收亞硒酸鹽的過程中發(fā)揮重要作用。

注：誤差線表示4個生物學重復的標準偏差，**代表在0.01水平上差異極顯著

富硒植物與非富硒植物對硒的富集存在顯著差異。研究發(fā)現，硫酸鹽轉運體基因的表達和序列差異可能是引起高低聚硒的一個內在關鍵基因。硒酸鈉處理黃芪時，富硒黃芪根系中的表達量高于在非富硒黃芪根系中的表達量[25]。在亞硒酸鹽處理時，和在富硒沙漠王羽地上組織中的表達量高于非聚硒白花槐地上組織[26]。目前，磷酸鹽轉運體基因在不同聚硒植物中的研究較少，主要集中于對亞硒酸鹽的吸收和轉運功能研究。在水稻中，過表達基因顯著受亞硒酸鈉的誘導且亞硒酸鈉處理會增加水稻根系對硒的吸收速率和累積量[9]。茶樹轉錄組分析發(fā)現，茶樹根系中磷酸鹽轉運體基因響應亞硒酸鈉的處理[12-13]。在本研究中，亞硒酸鈉處理茶樹時，在富硒茶樹品系葉片中的表達量高于在非富硒茶樹葉片中的表達量。此研究結果表明，可能參與葉片中硒元素的再分配。為進一步驗證的功能，今后需要開展的植物轉基因功能驗證。同時，為深入研究富硒和非富硒茶樹的基因調控網絡，需要開展更多關于富硒和非富硒茶樹品系的有關基因研究，以期更加明確硒酸鹽和亞硒酸鹽吸收和轉運的分子機制。

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Study on the Characteristics ofand Its Response to Selenium in Tea Plants

GUO Lina1,2, HAO Xinyuan2, WANG Lu2, QI Meng1, LI Xiaoman2, REN Hengze2, ZHENG Qinghua2, WANG Xinchao2, ZENG Jianming1,2*

1. Ankang Research Center of Se-enriched Product, Ankang 726000, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization Special Economic Animal and Plant Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

Selenium(Se) is an essential microelement for human, and Seenriched products are important sources for Se intakein human. Tea plants () have strong selenium enrichment ability.However, there is limited research on the molecular mechanism of phosphate transporters involved in Se absorption. In this study,gene was cloned and its characteristics and responses to Se concentrations, valence, pH, time and expression in various Se-enriched tea resources were investigated. Gene characteristicanalysis ofshows thatis grouped into phosphate transporter PHT1 subfamily and localized in the plasma membrane. ThePHT1;3 protein contains the conserved domain GGDYPLSATIxSE, which belongs to the PHT1 protein. Expression pattern analysis ofs that the expression levels ofs and valence states indicate that;was significantly induced by Se4+at 1?d and 7?dafter treatments. The expression ofCsPHT1;3 in roots was obviously induced by Se except for 3?d after treatment but largely unaffected by Se6+concentration. The results of different pH and Se4+treatments show that, at pH5, the highest expression ofin tea roots was observed at 24?h. While at pH3, the highest expression ofwas observed at 48?h. Moreover, at pH7, the highest expression ofThe results of sodium selenate treatment on different Se-enriched tea resources indicate that the expression ofdid not respond to sodium selenate treatment. However, the results of sodium selenite treatment on different Se-enriched tea resources suggest thatis significantly up-regulated in the leaves of Se-enriched tea resources. The above studies indicated thatmay participate in the absorption and redistribution of selenite by roots in tea plants, which is important for the breeding of Se-enriched tea cultivars.

tea plants, Se intake, selenite, selenium, pH

S517.1；Q786

A

1000-369X（2023）02-173-10

2022-11-01

2023-02-27

中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程協(xié)同任務（CAAS-XTCX20190025-7）、中國富硒產業(yè)研究院富硒專項“236”計劃項目（2019QCY-1.2）

郭麗娜，女，碩士研究生，主要從事茶樹育種、種植方面的研究。*通信作者：zengjm@tricaas.com