茶黃素（TF1）對人肝癌Bel-7402細(xì)胞的抑制作用及機制研究

王專，韋武均，任珍珍，何志龍，范玉純，周潔，郭桂義，蔣利和,,*

茶黃素（TF1）對人肝癌Bel-7402細(xì)胞的抑制作用及機制研究

王專1，韋武均2，任珍珍2，何志龍1，范玉純3，周潔3，郭桂義4，蔣利和1,2,3*

1. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；3.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004；4.信陽農(nóng)林學(xué)院河南茶葉綜合利用重點實驗室，河南 信陽 464000

探究茶黃素（TF1）對人肝癌Bel-7402細(xì)胞的影響，并闡明其作用機制。通過CCK-8檢測細(xì)胞活力，用平板克隆形成試驗檢測細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞劃痕愈合試驗和Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Bcl-2、PARP）、遷移相關(guān)蛋白（E-cad、N-cad、Vimentin、MMP9）和信號通路相關(guān)蛋白（TGF-、smad3、p-smad3）表達(dá)水平。結(jié)果表明，不同劑量TF1均可抑制Bel-7402細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡，并且存在劑量依賴性，劑量越大，抑制作用越強（<0.05）。與對照組相比，試驗組Bax、E-cad蛋白表達(dá)水平較高，Bcl-2、PARP，N-cad、Vimentin、MMP9、TGF-、smad3、p-smad3表達(dá)水平較低（<0.05）。茶黃素可能通過TGF-信號通路抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖、遷移，且促進(jìn)其凋亡。

茶黃素；人肝癌細(xì)胞；機制研究

惡性腫瘤是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的難題[1]，肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一[2]。肝癌復(fù)發(fā)率和病死率高，已嚴(yán)重威脅著人類健康[3]。目前的治療方案有手術(shù)切除、常規(guī)化療等，但這些治療方案有預(yù)后不良和耐藥性等缺陷[4-5]。因此，識別具有潛在治療效果的天然產(chǎn)物或新藥物對治療肝癌具有重要意義。

茶黃素類物質(zhì)于1957年被Roberts[6]發(fā)現(xiàn)以來，迄今已在紅茶中發(fā)現(xiàn)25種茶黃素組分，其中含量最多的是茶黃素（Theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF2a）、茶黃素-3′-沒食子酸酯（Theaflavin-3′- gallate，TF2b）和茶黃素雙沒食子酸酯（Theaflavin-3,3′-digallate，TF3）。茶黃素是紅茶中的一種次生多酚，廣泛存在于發(fā)酵茶中，具有抗菌、降脂、抗炎、抗突變和抗腫瘤作用，被認(rèn)為是從茶中分離出來的“黃金分子”[7]。有研究報道，TF1對不同的腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性，包括乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、肺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]、卵巢癌[12]、宮頸癌[13]等。2006年，屠幼英等[14]報道了TFs對人肝癌Bel-7402細(xì)胞的生長有抑制作用。然而，TF1是否能抑制Bel-7402細(xì)胞的遷移并促進(jìn)其凋亡，其作用機制尚不清楚。

因此，本研究將通過細(xì)胞試驗，探討TF1在體外對Bel-7402增殖、遷移和凋亡的影響，旨在明確這些過程的相關(guān)機制，為TF1抑制肝細(xì)胞癌的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TF1（純度≥98%）購自成都普瑞法生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自美國MCE公司，E-cad、N-cad、Vimentin、MMP9、Bax、Bcl-2、-actin、PARP、TGF-1、smad3、p-smad3均購自affinity抗體公司，Trizol購自日本TaKaRa公司，流式凋亡試劑盒購自美國ATT公司，Hoechst33258購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌Bel-7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞LO2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，在RPMI 1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100?U·mL-1青霉素和100?mg·mL-1鏈霉素在37?℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8試驗檢測細(xì)胞活力

將人肝癌Bel-7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞LO2以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，以濃度為120?μmol·L-1的順鉑作為陽性對照，用不同濃度（0、20、40、80、100、120?μmol·L-1）的TF1處理后，分別培養(yǎng)24、48、72?h。然后每孔加入CCK-8溶液10?μL，在37?℃孵育1?h。最后，在450?nm處測定吸光度，并計算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=（試驗組/對照組）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡

將Bel-7402細(xì)胞接種于6孔板（每孔5×104個細(xì)胞）中，培養(yǎng)過夜。用不同濃度（0、50、100?μmol·L-1和150?μmol·L-1）的TF1處理24?h，使用不含EDTA的胰蛋白酶收集細(xì)胞，然后用AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒按照說明書進(jìn)行細(xì)胞染色，用流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst33258染色則是將細(xì)胞用不同濃度（0、50、100?μmol·L-1和150?μmol·L-1）TF1處理24?h后，棄廢液，用4%細(xì)胞固定液固定20?min，使用Hoechst33258染色15～20?min，最后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞變化。

1.2.4 細(xì)胞劃痕試驗

將Bel-7402細(xì)胞接種于6孔板（每孔2×105個細(xì)胞）中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h，用移液管尖端刮傷單層細(xì)胞，用PBS洗滌1次。顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度，加入含有不同濃度TF1（0、50、100?μmol·L-1和150?μmol·L-1）的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24?h，再次顯微鏡下記錄劃痕寬度，計算每組的遷移率。遷移率的計算計算公式為：遷移率=（遷移面積/劃痕面積）×100%。

1.2.5 Transwell小室試驗檢測細(xì)胞的遷移

無血清培養(yǎng)基中的Bel-7402細(xì)胞接種到插入的過濾器中（每孔2×105個細(xì)胞）。用含血清的完全培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)劑，用不同濃度（0、50、100?μmol·L-1和150?μmol·L-1）處理Bel-7402細(xì)胞。37?℃孵育24?h后，棄去transwell小室中的培養(yǎng)液，用棉簽擦去上層多余未遷移的細(xì)胞，并用PBS沖洗2次，用4%多聚甲醛和甲醇固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測序探索其潛在的作用機制

將Bel-7402細(xì)胞分成2組接種于6孔板（每孔5×105個細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁且狀態(tài)良好之后，對照組不做處理，試驗組用濃度為100?μmol·L-1的TF1處理24?h，棄廢液，用PBS清洗2次，用TRizol裂解細(xì)胞，提取總RNA。Bel-7402細(xì)胞的RNA序列，包含3個生物重復(fù)，由IlluminaNovaSeq測序系統(tǒng)（上海美吉生物技術(shù)公司）進(jìn)行測序。采用R軟件中的DESeq軟件包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，根據(jù)log|FC|≥1和調(diào)整后的<0.05認(rèn)定為差異基因。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的Bel-7402細(xì)胞，分別用不同濃度（0、50、100、150?μmol·L-1）的TF1處理Bel-7402細(xì)胞24?h。RIPA裂解緩沖液與蛋白酶抑制劑按照100∶1的體積比混合，在冰上裂解30?min，以12?000?r·min-1離心10?min，獲得細(xì)胞總蛋白。采用BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，再用新鮮的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2?h。將膜與一抗在推薦稀釋比例下4?℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10?min，室溫下進(jìn)行二抗孵育2?h。采用增強型化學(xué)發(fā)光檢測試劑（北京索萊寶科技有限公司）進(jìn)行顯影。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TF1對人肝癌Bel-7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞LO2增殖的影響

CCK-8細(xì)胞毒性試驗檢測結(jié)果顯示（圖1A），隨著TF1濃度的升高，Bel-7402細(xì)胞的增殖能力相應(yīng)地降低，其中24?h的IC50為(101.057±5.648)?μmol·L-1，48?h的IC50為(92.649±3.044)?μmol·L-1，72?h的IC50為(70.614±8.586)?μmol·L-1，結(jié)果表明，TF1能顯著抑制Bel-7402細(xì)胞的增殖能力。TF1對人正常細(xì)胞LO2的檢測結(jié)果表明（圖1B），TF1對人正常肝細(xì)胞LO2的影響可以忽略不計。陽性對照順鉑對人肝癌Bel-7402細(xì)胞和正常肝細(xì)胞LO2的活力均具有較強的抑制作用，表明順鉑對人體可能具有較強副作用。

2.2 TF1對人肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖能力的影響

圖2結(jié)果顯示，對照組人肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖能力未受到影響，隨著TF1濃度的增加，試驗組Bel-7402克隆形成能力明顯減弱，TF1濃度為30?μmol·L-1和45?μmol·L-1時，具有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05，<0.001）。

2.3 TF1對人肝癌Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示（圖3A），隨著TF1濃度的增加，Bel-7402細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，并且呈濃度依賴性變化，表明TF1可以顯著促進(jìn)Bel-7402細(xì)胞的凋亡。Hoechst33258細(xì)胞染色結(jié)果顯示，隨著TF1濃度的加大，細(xì)胞核呈亮藍(lán)色熒光越強，表明Bel-7402細(xì)胞凋亡數(shù)量越多（圖3B）。Western blot結(jié)果顯示，隨著TF1濃度的升高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，DNA修復(fù)酶PARP蛋白表達(dá)降低（圖3C）。

2.4 TF1對人肝癌Bel-7402細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果顯示（圖4A），與對照組細(xì)胞相比，試驗組遷移率降低（＜0.05），transwell細(xì)胞縱向遷移試驗也得到了同樣的結(jié)果（圖4B）。Western blot結(jié)果顯示，隨著TF1濃度的升高，N-cad、MMP9和Vimentin蛋白表達(dá)降低，而E-cad蛋白表達(dá)升高（圖4C）。

注：A，不同濃度的TF1對肝癌Bel-7402細(xì)胞活力的影響；B，不同濃度的TF1對人正常肝細(xì)胞LO2活力的影響；數(shù)據(jù)以表示，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001

注：數(shù)據(jù)以表示, *代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001

注：A，流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度TF1對人肝癌Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響；B，Hoechst 33258染色觀察不同濃度TF1處理Bel-7402細(xì)胞后的凋亡形態(tài)；C，Western blot檢測不同濃度TF1處理Bel-7402細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。數(shù)據(jù)以表示，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001

2.5 轉(zhuǎn)錄組測序揭示差異基因GO和KEGG富集結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示（圖5），對照組和試驗組測序共得到156個差異基因，其中上調(diào)基因108個，下調(diào)基因48個。如圖5A火山圖所示，紅色代表上調(diào)表達(dá)，藍(lán)色代表下調(diào)表達(dá)。對差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析（圖5B和圖5C），GO富集主要包括生物過程（Biological process，BP），細(xì)胞組分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）。BP富集結(jié)果顯示，差異基因與細(xì)胞進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)和代謝進(jìn)程等相關(guān)；CC富集結(jié)果顯示，主要與細(xì)胞組分和膜組分等相關(guān)；MF分析結(jié)果顯示，與細(xì)胞連接、催化活性、轉(zhuǎn)運活性等相關(guān)。KEGG富集結(jié)果顯示，主要與心肌細(xì)胞腎上腺素能信號傳導(dǎo)，刺激神經(jīng)組織中的交互，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-）信號通路，調(diào)控干細(xì)胞多能性的信號通路等相關(guān)，由于TGF-信號通路是與腫瘤密切相關(guān)的信號通路，與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡密切相關(guān)，因此對該信號通路進(jìn)行了進(jìn)一步地驗證。

2.6 Western blot檢測TGF-β通路部分蛋白變化

Western blot結(jié)果顯示（圖5D），隨著TF1濃度的升高，TGF-1蛋白及其下游分子smad表達(dá)降低，證明其可能與此信號通路相關(guān)聯(lián)。

3 討論

肝癌作為危害健康程度較高的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率高，五年生存率較低，開發(fā)治療效果更好的新化合物或藥物迫在眉睫。目前，多種天然抗腫瘤藥物在腫瘤治療中已取得了明顯的作用效果[15-16]，如姜黃素[17]、吉馬酮[18]、芝麻素[19]、淫羊藿素[20]和褐藻多糖硫酸酯等[21]，可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。茶黃素在食品、衛(wèi)生保健產(chǎn)品和天然藥物等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。茶黃素被報道具有多種藥理功能與保健功效，如降血壓、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)骨骼健康等[22]。

圖4 TF1對Bel-7402細(xì)胞遷移能力的影響

注：A，差異基因火山圖；B，差異表達(dá)基因GO功能注釋分析結(jié)果；C，差異表達(dá)基因KEGG通路富集結(jié)果；D，TGF-β信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)以表示，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001

本研究以肝癌Bel-7402細(xì)胞為研究對象，進(jìn)行CCK-8細(xì)胞毒性試驗。結(jié)果表明，在24、48、72?h的IC50分別為(101.057±5.648)、(92.649±3.044)、(70.614±8.586)?μmol·L-1，呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。平板克隆形成試驗中，當(dāng)TF1濃度為45?μmol·L-1時，細(xì)胞的增殖能力明顯下降。細(xì)胞劃痕試驗中，當(dāng)TF1濃度為150?μmol·L-1作用Bel-7402細(xì)胞24h后，相比對照組，細(xì)胞遷移率從32.12%下降為8.38%。流式細(xì)胞分析和Hoechst33258染色結(jié)果證明TF1濃度為150?μmol·L-1時，Bel-7402細(xì)胞早期凋亡數(shù)目增多，細(xì)胞凋亡率升高。Western blot結(jié)果顯示，隨著TF1濃度的升高，凋亡相關(guān)蛋白分子Bax表達(dá)升高，Bcl-2和PARP表達(dá)降低。遷移相關(guān)分子N-cad、MMP9和Vimentin表達(dá)降低，E-cad表達(dá)升高。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，試驗組和對照組差異基因主要富集在TGF-這一信號通路。

TGF-/Smad信號通路在細(xì)胞分化、分裂和凋亡中起著重要作用，廣泛參與多種惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移進(jìn)程[23]。TGF-1是多效的細(xì)胞因子，在腫瘤早期抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮抑癌作用，而在腫瘤晚期，發(fā)揮促癌作用。Smad家族蛋白是TGF-信號傳導(dǎo)的重要細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子，在從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[24-28]。TGF-/Smad途徑是在TGF-異常高表達(dá)之后，與其Ⅱ型受體在胞外結(jié)合并使Ⅰ型受體磷酸化，激活下游的Smad2/Smad3，從而誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)升高[29-30]。本研究揭示了TF1通過抑制TGF-/Smad信號通路，進(jìn)而抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖、遷移，作用機制可能是由于抑制TGF-1的激活和下調(diào)Smad3的磷酸化（圖6）。

圖6 TF1對人肝癌Bel-7402作用機制示意圖

從對肝癌Bel-7402細(xì)胞的抑制效果來看，順鉑作為一種在臨床廣泛使用的化療藥物，其抗腫瘤作用較明顯；TF1作為天然產(chǎn)物，其殺傷肝癌Bel-7402細(xì)胞的能力也較強。但順鉑會對人體產(chǎn)生較大副作用，而TF1的副作用則可以忽略不計，對病人損傷小，可減輕病人痛苦。順鉑價格較為便宜，TF1價格相對昂貴。在未來的研究中，可以利用基因編輯技術(shù)或生物傳感器以及現(xiàn)代分離純化技術(shù)相結(jié)合實現(xiàn)大規(guī)?，F(xiàn)代化工廠制備TF1，大大降低其提取成本，TF1將具有較好的發(fā)展前景。

綜上所述，TF1可以顯著抑制肝癌細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞的增殖、遷移，且促進(jìn)其凋亡，對正常肝細(xì)胞無影響。本研究將為茶黃素的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究證實了TF1在人肝癌Bel-7402細(xì)胞中可以抑制其增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡。TF1濃度為45?μmol·L-1時，可顯著抑制增殖；濃度為150?μmol·L-1時，可顯著抑制細(xì)胞遷移且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，證明了TF1可能通過TGF-信號通路來影響肝癌Bel-7402細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。然而，本研究只進(jìn)行了體外細(xì)胞試驗，需要進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)的動物試驗和臨床試驗來驗證TF1對Bel-7402細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的體內(nèi)作用。

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Inhibitory Effect and Mechanism of Theaflavin (TF1) on Hepatoma Carcinoma Bel-7402 Cells

WANG Zhuan1, WEI Wujun2, REN Zhenzhen2, HE Zhilong1, FAN Yuchun3, ZHOU Jie3, GUO Guiyi4, JIANG Lihe1,2,3*

1. College of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, China; 3. Medical College, Guangxi University, Nanning 530004, China; 4. Henan Key Laboratory of Tea Comprehensive Utilization in South Henan Xinyang Agriculture and Forestry University, Xinyang 464000, China

To explore the inhibitory effect and mechanism of theaflavin (TF1), human hepatoma carcinoma Bel-7402 cells were treated with different concentrations of TF1. Cell viability was detected by CCK8 and cell proliferation was detected by colony formation assay. Cell migration was detected by cell wound healing experiment and transwell chamber assay. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Apoptosis-related proteins (Bax, Bcl-2, PARP), migration related proteins (E-cad, N-cad, Vimentin, MMP9) and signaling pathway related proteins (TGF-, Smad3, p-smad3) were detected by western blot. The results show that different concentrations of TF1could inhibit the proliferation and migration of Bel-7402 cells and promote their apoptosis in a dose-dependent manner. The higher the dose, the stronger the inhibition effect (<0.05). Compared with the control group, the expression levels of Bax and E-cad proteins in the experimental group were higher, while the expression levels of Bcl-2, PARP, N-cad, Vimentin, MMP9, TGF-, Smad3 and p-smad3 were lower (<0.05). In conclusion, TF1could inhibit the proliferation and migration of Bel-7402 cells and promote their apoptosis through TGF-signaling pathway.

theaflavin,human hepatoma carcinoma cell,mechanism research

S517.1；R735.2

A

1000-369X（2023）02-287-10

2022-07-26

2022-11-18

南寧市青秀區(qū)重點研發(fā)項目（2020023）、右江民族醫(yī)學(xué)院高層次引進(jìn)人才項目（YY2021sk02）、河南豫南茶葉綜合利用重點實驗室開放基金（HNKLTOF2018005）、福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點實驗室開放資金（WYKF2020-5）

王專，男，碩士研究生，主要從事食品營養(yǎng)學(xué)的研究。*通信作者：jianglihe@gxu.edu.cn