不同種植方式對玉米內生菌的影響

滕青華

摘要：【目的】本試驗通過研究玉米單作和間作對內生菌的影響，為進一步探明玉米黃草烏間作優(yōu)勢奠定基礎?！痉椒ā坎捎门柙栽囼灒OA為玉米間作黃草烏根部尼龍網分隔（1株玉米+1株黃草烏）、B為玉米單作根部尼龍網分隔（1株玉米+1株玉米）及C為玉米與空白根部尼龍網分隔（CK，1株玉米+空白）?！窘Y果】玉米內生細菌和真菌，A處理分別有12屬22株、11屬18株，B處理分別有8屬12株、9屬12株，C處理（CK）分別有5屬7株、5屬7株，3個處理玉米根、莖、葉中，A處理分別分離出9屬15株、7屬12株、8屬13株，B處理分離出6屬10株、6屬7株、5屬7株，C處理分離出5屬7株、3屬4株、2屬3株，A處理的內生細菌和真菌均比B和C處理多；其中，有益內生菌，A處理有6屬9株，B處理有5屬6株，C處理有2屬2株；總體上，A處理內生菌數量最多、有益內生菌也最多?！窘Y論】玉米與黃草烏間作增加了玉米內生細菌和真菌的數量。

關鍵詞：玉米；黃草烏；間作；細菌和真菌

1 前言

植物內生菌是重要的微生物資源，根莖葉等器官和組織細胞中都存在豐富的內生菌[1]。內生菌對宿主植物抵御病害有重要的作用[2]，因此，開發(fā)植物內生菌生物防治的潛能已經成為一項研究熱點，很多學者熱衷于分離對玉米常見病害有防控作用的菌株[3]，為開發(fā)生物農藥等研究奠定基礎；內生菌還可以促進植物的養(yǎng)分吸收及生長，傅曉方等人從玉米植株中篩選出固氮酶活性的內生菌接種到小麥后，與未接種的比較，其小麥苗高、鮮質量、干質量等都顯著提高[4]，韓曉日等人從玉米中分離出兩株具有固氮能力的菌株，能夠顯著地促進幼苗期玉米的生長[5-6]。但我們不清楚玉米與黃草烏間作根際互作對微生物群集有什么影響。為此，本文利用玉米與黃草烏間作，開展根際互作對玉米微生物內生菌的研究，以期為更好地開發(fā)利用玉米促生菌及玉米黃草烏間作提高一定的依據。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 供試品種

玉米（Zea mays L.）：RD 26

黃草烏（Aconitum vilmorinianum Kom）：“滇草烏1號”。

2.1.2 實驗試劑

酒精、PCR試劑盒、1×TAE緩沖溶液、瓊脂糖、甘油、氯化鈉、酵母浸粉、胰蛋白胨、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂。

2.2 試驗設計

試驗采用單因素設計。設：A玉米間作黃草烏根部尼龍網分隔（1株黃草烏+1株玉米，種間）、B玉米單作根部尼龍網分隔（1株玉米+1株玉米，種內）、C玉米根部與空白根部尼龍網分隔（1株玉米，CK）3個處理（見圖1），每盆為1次重復，重復16次，3（處理）×16（重復）=48盆；塑料盆大小為36 cm×30 cm，采用30μm網孔的尼龍網從上口徑到底部用對稱分為兩邊，以防止兩邊根系相互滲透。種植區(qū)域為方形，面積為5.5m×7.8m。

2.3 田間種植及管理

玉米：玉米種子用0.5%次氯酸鈉消毒10min，然后用無菌水沖洗2～3次。

黃草烏：黃草烏塊根用多菌靈粉末殺菌消毒后直接種植。

土肥基質質量比例：土：蛭石：基質：鋸木：有機肥=4：3：2：1：1

將經過消毒殺菌處理的玉米種子與黃草烏塊根于2020年6月16日種下。在玉米與黃草烏生長的每個階段都保證水肥充足，黃草烏對水分的需求要比玉米少，在保證水分充足的前提下，還要防止黃草烏滲水過多而造成根部腐爛，預防常見病蟲害，除雜草，測量生理指標。

2.4 內生菌篩選鑒定技術

2.4.1 培養(yǎng)基的配制方法

Luria-Bertani固體培養(yǎng)基（1000ml）：瓊脂15g，氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g。pH：7.2±0.2

Luria-Bertani液體培養(yǎng)基（1000ml）：氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g。pH：7.2±0.2

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，簡稱PDA（1000ml）：稱取39g。pH：5.6±0.2

培養(yǎng)基于121℃下滅菌20min，備用。

2.4.2 樣品處理

于玉米的灌漿期分別取A、B及C三處理玉米的根、莖、葉各三份，將取好的鮮材料保鮮后及時送到實驗室進一步進行處理。用流動的自來水洗滌玉米的根、莖和葉，然后用無菌蒸餾水洗滌，在超凈工作臺中用75％的乙醇表面消毒1min，用5%次氯酸鈉表面消毒5min，再用75％的乙醇表面消毒30s，最后在無菌蒸餾水中洗滌10min，總共洗3次，將最后的洗滌水鋪在Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，表面消毒方法的成功是通過在培養(yǎng)基中未檢測到微生物生長來確認的。篩選細菌的鮮材料需充分研磨，在Luria-Bertani液體培養(yǎng)基上充分震蕩24h，得到原液備用。篩選真菌的鮮材料切成適當大小備用。

2.4.3 培養(yǎng)與純化

細菌培養(yǎng)需取上一步得到的原液500μL，加入4500μl的無菌水依次稀釋為10-2、10-3、10-4三個濃度，三個濃度分別涂布到Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，在恒溫箱中培養(yǎng)1～3d后，根據菌落的顏色、形態(tài)、黏稠度、粗糙度等將可鑒定為不同的菌株分別接種到新的Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，反復操作，直至分離出純化的菌株。真菌培養(yǎng)將切成適當大小的鮮材料直接接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫箱培養(yǎng)2～10d，根據菌落的顏色、形態(tài)、菌絲的有無、孢子的有無等將可鑒定為不同的菌株分別接種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，反復操作，直至分離出純化的菌株。

2.4.4 DNA提取

細菌DNA的提取步驟為從培養(yǎng)基上挑取1～2mg的菌落放入2.5ml的搖菌管，加入1000μl的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)24h備用，在PCR管中加入10μL的最佳伴侶和5μL菌液，95℃水浴裂解3min后12000rpm高速離心機上離心1～3min，吸取2μL上清液作為擴增模板。真菌提取DNA步驟為從馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上取0.5～2mg菌落，加入12μl的bufferA，95℃水浴裂解10min后，在12000rpm高速離心機上離心5min，取2μL上清液作為擴增模板。

2.4.5 PCR反應體系

細菌反應體系：酶（超光速mix）10μl，兩個引物1492R和27F各0.5μl，擴增模板2μl，加入dd水7μl至反應體系20μl。

真菌反應體系：T5 Plant DNA Polymerase酶12μl，擴增模板2μl，兩個引物ITS1、ITS4各0.5μl，加入dd水10μl至反應體系25μl。

細菌引物序列為：

1492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGA-3’）

27 F（5’-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3’）

真菌引物序列為：

ITS1（5’-G GAAGGTAAAAGTCAAGG-3’）

ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）

反應體系加完全后，進行振蕩混勻，12000rpm高速離心機上離心1min。

2.5 測定指標

生長指標：玉米株高、莖粗、葉長、葉寬、葉綠素含量、生物量、地上部分與地下部分重量。

產量指標：玉米穗長、穗粗以及籽粒干重。

3 結果與分析

3.1 玉米不同種植方式對其內生細菌的影響

不同處理情況下玉米根內生細菌數量統(tǒng)計結果顯示，A處理根內生細菌數最多，共有7株，屬于堿桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬及寡養(yǎng)單胞菌屬5個屬；B處理共有4株，屬于寡養(yǎng)單胞菌屬、不動桿菌屬及芽孢桿菌屬3個屬；C處理（CK）共4株，屬于寡養(yǎng)單胞菌屬、不動桿菌屬及腸桿菌屬3個屬。說明玉米間作黃草烏使玉米根內生細菌增多。

不同處理玉米莖內生細菌數量統(tǒng)計顯示，A處理共6株，屬于自沙門氏菌屬、腸桿菌屬及芽孢桿菌屬3個屬；B處理共3株，屬于腸桿菌屬等兩個2屬；C處理（CK）共1株，屬于腸桿菌屬。說明單株種植使玉米莖內生細菌種類減少，玉米間作黃草烏使玉米莖內生細菌種類增多。

不同處理玉米葉內生細菌數量統(tǒng)計顯示，A處理共9株，屬于芽孢桿菌屬、勒克氏菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬5個屬；B處理共5株，屬于腸桿菌屬、假單胞菌屬及放射毛霉屬3個屬；C處理（CK）共2株，屬于副球菌屬。說明玉米單作減少了玉米葉內生細菌的種類，玉米間作黃草烏增加了玉米葉內生細菌的種類。

3.2 玉米不同種植方式對其內生真菌的影響

不同處理玉米根內生真菌數目統(tǒng)計，顯示，A處理共8株，屬于曲霉屬、木霉屬、鐮刀屬及擬莖點屬4個屬； B處理共6株，屬于鐮刀屬、木霉屬及曲霉屬3個屬；C處理（CK）共3株，屬于木霉屬和鐮刀屬2個屬。說明單株種植減少了玉米根內生真菌種類，玉米間作黃草烏使玉米根內生真菌種類增多。

不同處理玉米莖內生真菌數目統(tǒng)計顯示，A處理共6株，屬于木霉屬、鐮刀屬、赤霉菌屬、籃狀菌屬4個屬；B處理共4株，屬于木霉屬、鐮刀屬、曲霉屬及擬莖點屬4個屬；C處理（CK）共3株，屬于鐮刀屬、曲霉屬2個屬。說明單株種植減少了玉米莖內生真菌的種類，玉米間作黃草烏增多了玉米莖內生真菌種類。

不同處理玉米葉內生真菌數目統(tǒng)計顯示，A處理共4株，屬于擬莖點屬、鐮刀屬及曲霉屬3個屬；B處理共2株，屬于曲霉屬和木霉屬2個屬；C處理（CK）共1株，屬于赤霉菌屬。說明單株種植減少了玉米葉內生真菌種類，玉米間作黃草烏增加了玉米葉內生真菌種類。

4 討論

研究表明玉米本身在根莖葉等組織器官中含有豐富的內生菌，這些豐富的內生菌有特殊的化學結構或者會釋放一些特殊的化學物質[7]，是玉米抗病及增產的一個機制。內生菌伴隨著植物的一生，在植物的生長過程中，有益內生菌的種類越豐富，則越有利于植物的生長。因此，研究不同種植方式玉米內生菌多樣性的變化情況，有利于找到對玉米抗病及增產有利的菌株。關于玉米內生菌的研究已經有了一個比較完備的結果，但是即使是同一品種的玉米，內生菌的種類構成也不是一成不變的，因為不同種植方式會對內生菌的種類構成產生影響。由A、B及C處理（CK）三種試驗結果，玉米間作黃草烏與玉米單作及玉米單株種植相比增加了玉米內生菌的數目。這與楊建波等人利用甘蔗及大豆間作，結果甘蔗莖內生菌數量增加是一致的[8]。但有關玉米與黃草烏間作對內生菌影響的研究

鮮有，因此，本研究還需進行進一步驗證。由查閱文獻得，A處理中的促生菌及生防菌數量比B及C處理得都多，因此，本試驗可能找到對玉米抗病、增產有益的菌株。但是玉米間作黃草烏模式是否可以固定的產生有益內生菌株及是否有利于大田生產，還需要進行進一步及多次的試驗。

參考文獻

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[8] 楊建波.間作大豆對甘蔗生長及內生細菌、固氮細菌多樣性的效應[D].廣西大學，2014.