香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備、表征及對(duì)硫色鐮刀菌的抑制作用

許奕雯 徐 瑞 田甲春 田世龍，* 葛 霞，*

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅，蘭州 730000；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅，蘭州 730000；3甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，甘肅，蘭州 730000）

馬鈴薯種植廣泛、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價(jià)值豐富，是四大糧食作物之一［1］。馬鈴薯貯藏病害主要有干腐病、軟腐病［2］和瘡痂?。?］等。其中，干腐病發(fā)病率最高也最為嚴(yán)重，主要是由病原菌硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）所引起，在貯藏期間侵染塊莖，造成塊莖內(nèi)外部病變［4］，使得淀粉含量顯著降低［5］，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。運(yùn)用抑菌劑防治干腐病是目前應(yīng)用最廣泛、效果最為明顯的防治方法［6］。

植物源抑菌劑具有安全性高、抑菌效果明顯、低殘留或無殘留、抗氧化能力強(qiáng)及保鮮效果好等優(yōu)點(diǎn)［7］，但其水溶性差、揮發(fā)性強(qiáng)、不穩(wěn)定，導(dǎo)致使用時(shí)生物利用率低和藥效時(shí)效性短［8］。天然環(huán)糊精及其衍生物具有外親水、內(nèi)疏水的剛性空腔結(jié)構(gòu)，可使小分子物質(zhì)進(jìn)入空腔內(nèi)形成主客體包合物，從而提高客體分子的穩(wěn)定性和水溶性，并控制客體小分子的釋放量，在食品、藥品及化妝品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［9-10］。將植物源抗菌劑制成環(huán)糊精包合物不僅可達(dá)到增穩(wěn)緩釋作用，還可以充分發(fā)揮其抑菌作用［11］。已有研究表明，將β-環(huán)糊精與精油及其提取物制備成包合物，應(yīng)用于各種果蔬的抑菌與保鮮上，均可得到顯著的抑菌與緩釋效果［12-15］。

香芹酮是從植物葛縷子種子精油中提取出來的單萜類物質(zhì)，是一種天然綠色的抗菌劑，在鮮花保鮮及芒果采后腐敗病防治中已有較多研究［16-17］。此外，香芹酮對(duì)馬鈴薯貯藏期間常見的硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）具有良好的抗菌活性，可抑制馬鈴薯貯藏期間干腐病等病害發(fā)生［18］。然而香芹酮也具有天然產(chǎn)物易揮發(fā)、穩(wěn)定性差等共性問題，限制了其在實(shí)際應(yīng)用中的可能性［19-20］。羥丙基-β-環(huán)糊精（chydroxypropylβ-cyclodextrin，HP-β-CD）是β-環(huán)糊精的醚化衍生物，與β-環(huán)糊精相比，其水溶性顯著提高，包合能力提升的同時(shí)安全性更高［21］。因此，本研究將香芹酮與羥丙基-β-環(huán)糊精通過共蒸發(fā)-冷凍干燥法制備成包合物，對(duì)其進(jìn)行一系列表征，證實(shí)包合物的生成，并研究其對(duì)馬鈴薯貯藏病害干腐病病原菌硫色鐮刀菌的抗菌效果，為其應(yīng)用于抑制馬鈴薯貯藏期間干腐病的發(fā)生提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羥丙基-β-環(huán)糊精（相對(duì)分子質(zhì)量1 495），江蘇泰興新鑫醫(yī)藥輔料有限公司；香芹酮（含量大于96%），阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司；香芹酮標(biāo)準(zhǔn)品（用于氣相色譜，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N 氣相色譜儀，美國Agilent公司，并配備HP-5MS 色譜柱（30 m×0.32 mm i.d.×0.25 μm）；UV-1900紫外可見分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司；AVANCE III 400 核磁共振光譜儀，德國Bruker 公司；TGA2 熱重分析儀，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；JSM-7800F 超高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日本電子株式會(huì)社；Ultima IV X射線粉末衍射儀，日本理學(xué)株式會(huì)社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的合成 采用共蒸發(fā)-冷凍干燥法制備香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。準(zhǔn)確稱取羥丙基-β-環(huán)糊精276 g，香芹酮32.6 mL，二者物料摩爾比為1∶1，共同溶于25 L 5%的乙醇水溶液中，在80 ℃下持續(xù)攪拌4 h，隨后移至室溫持續(xù)攪拌2 h 后，將乙醇溶劑蒸除，靜置，過濾，真空冷凍干燥，得到香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，包合物的產(chǎn)率為93.6%。

1.3.2 香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精物理混合物的制備 在相關(guān)表征前，準(zhǔn)確稱取1.495 g 的羥丙基-β-環(huán)糊精、移取150.2 μL 的香芹酮于帶蓋樣品瓶中，迅速將兩者充分混勻，得到香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精物理混合物待測(cè)。

1.3.3 香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定采用相溶解度圖來測(cè)定穩(wěn)定常數(shù)［22-23］。將過量的香芹酮（0.50 mL）加入到含有不同濃度羥丙基-β-環(huán)糊精溶液的10 mL比色管中，其中羥丙基-β-環(huán)糊精濃度分別為0、10、20、30、40、50 mmol·L-1。在20 ℃條件下充分振蕩，達(dá)到平衡后取下層的水溶液適當(dāng)稀釋，用氣相色譜測(cè)定溶液中的香芹酮含量。試驗(yàn)重復(fù)3 次。色譜條件：取 1 μL 樣品按1∶5 分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃，起始溫度60 ℃，保持 3 min，以10 ℃·min-1升溫至200 ℃，再以20 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持2 min，以氮?dú)庾鳛檩d氣。按照Higuchi-Connors 方程（公式1），由相溶解度圖線性部分的斜率和截距計(jì)算得到穩(wěn)定常數(shù)Kc值：

式中，Kc為20 ℃時(shí)包合物的穩(wěn)定常數(shù)；S0為香芹酮在不含環(huán)糊精水中的溶解度。

1.3.4 包合物的表征

1.3.4 .1 紫外表征 分別配制1.0×10-2mol·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液儲(chǔ)備液和1.0×10-3mol·L-1香芹酮乙醇溶液儲(chǔ)備液。在7 支10 mL 比色管中分別轉(zhuǎn)移0.1 mL 香芹酮儲(chǔ)備液，0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 的羥丙基-β-環(huán)糊精儲(chǔ)備液（1→7），之后再分別加入2.0 mL pH值7.0的混合磷酸緩沖液，用去離子水稀釋至10 mL 刻度線，搖勻靜置30 min 后，在紫外可見分光光度計(jì)上于200～300 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。

1.3.4 .21H NMR光譜 以DMSO-d6與D2O（V/V=1∶1）的混合溶劑為核磁溶劑，以四甲基硅烷（tetra methyl silane，TMS）作為內(nèi)標(biāo)，使用核磁共振光譜儀分別對(duì)羥丙基-β-環(huán)糊精和香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物進(jìn)行樣品采集［24］。采集參數(shù)：譜寬4 000 Hz，采集時(shí)間3.98 s，掃描次數(shù)8，延遲時(shí)間1 s。

1.3.4 .3 熱重分析 分別取1～2 mg 香芹酮、羥丙基-β-環(huán)糊精及香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物樣品置于帶蓋的氧化鋁坩堝中進(jìn)行測(cè)定［25］。溫度范圍：25～500 ℃，升溫速率：10 ℃·min-1，N2流速：20 mL·min-1。

1.3.4 .4 掃描電鏡 將羥丙基-β-環(huán)糊精、香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精物理混合物和包合物樣品固定在樣品臺(tái)上，噴鍍鉑金后在2.00 kV 條件下進(jìn)行觀察并拍照，放大倍率分別為500和1 000倍。

1.3.4 .5 粉末X-衍射分析 分別對(duì)羥丙基-β-環(huán)糊精、物理混合物及其包合物進(jìn)行X-衍射測(cè)試［26］。測(cè)定條件為Cu Kα 射線、管電壓40 kV、管電流200 mA，掃描3～40°、掃描速率8°·min-1、步長0.02°。

1.3.5 包合物對(duì)硫色鐮刀菌的抑制作用 使用PDA將香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物配置成7 個(gè)不同的濃度梯度：其中香芹酮有效濃度分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L-1，取高溫滅菌后的含藥PDA 培養(yǎng)基10 mL 倒入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，冷卻至室溫。用接種針將培養(yǎng)48 h 直徑為4 mm 的圓形菌餅正面向下分別移植貼合到帶藥的PDA 平板正中央，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)皿分別用直尺交叉法測(cè)定菌落直徑。按照公式（2）計(jì)算不同濃度下藥劑對(duì)真菌菌絲的生長抑制率：

將抑制率換算成幾率值，以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為自變量（x），以菌絲抑制幾率值為因變量（y），用最小二乘法得出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），根據(jù)回歸方程求出香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物對(duì)硫色鐮刀菌的半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maxmal effect，EC50）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，并用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)香芹酮的包合穩(wěn)定常數(shù)及水溶性的影響

從相溶解度圖（圖1）可以看出，香芹酮的濃度隨羥丙基-β-環(huán)糊精濃度的增加呈線性增加趨勢(shì)。根據(jù)Higuchi 和Connors 的理論［27］，此相溶解度圖可歸屬為AL型，說明生成了主客體比為1∶1 且易溶于水的包合物。按公式（1）計(jì)算出香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定常數(shù)為409.39 L·mol-1。且當(dāng)溶液中羥丙基-β-環(huán)糊精的濃度達(dá)到50 mmol·L-1時(shí)，香芹酮的水溶性增加了約10.12倍，說明與羥丙基-β-環(huán)糊精形成包合物后明顯改善了香芹酮的水溶性。

圖1 香芹酮在羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中的相溶解度圖Fig.1 Phase solubitity diagrams of carvone in the presence of HP-β-CD

2.2 包合物的表征

2.2.1 紫外光譜分析 圖2 為香芹酮在不同濃度羥丙基-β-環(huán)糊精中的吸收光譜。隨著羥丙基-β-環(huán)糊精濃度的增加，香芹酮的最大吸收波長由241 nm 藍(lán)移至239 nm，且香芹酮的吸光度值逐漸增強(qiáng)，光譜變化主要是環(huán)糊精空腔內(nèi)高電子密度誘導(dǎo)客體分子電子發(fā)生移動(dòng)的結(jié)果［28］，由此證實(shí)，香芹酮分子進(jìn)入了羥丙基β-環(huán)糊精的空腔并形成了超分子包合物。

圖2 香芹酮在不同濃度羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中的紫外光譜Fig.2 UV spectra of carvone with various concentrations of HP-β-CD

2.2.21H NMR光譜分析 主客體包合物的形成將引起環(huán)糊精空腔內(nèi)環(huán)境的變化，導(dǎo)致環(huán)糊精非極性空腔內(nèi)的H-3（近大口端）和H-5（近小口端）質(zhì)子發(fā)生高場(chǎng)位移，而環(huán)糊精空腔外的質(zhì)子（H-1，H-2 和H-4）在包合前后無明顯變化［29］。由表1 可知，羥丙基-β-環(huán)糊精在與香芹酮生成主客體包合物后，其H-3 和H-5 的化學(xué)位移變化值（Δδ）分別為-0.004 和-0.063，說明香芹酮分子從羥丙基-β-環(huán)糊精的大口端深深地進(jìn)入了環(huán)糊精的空腔內(nèi)，生成了主客體包合物。

表1 羥丙基-β-環(huán)糊精的質(zhì)子生成包合物前后的化學(xué)位移值（δ）及其變化值（Δδ）Table 1 Chemical shift values（δ）and variation values（Δδ）of HP -β-CD before and after proton formation of inclusion complex

2.2.3 熱重分析 由圖3 可知，羥丙基-β-環(huán)糊精在50～100 ℃間發(fā)生水分蒸發(fā)，在300～325 ℃時(shí)發(fā)生分解；香芹酮在室溫下就開始失重，且隨著溫度升高，在75～125 ℃時(shí)出現(xiàn)快速失重，表明香芹酮極易揮發(fā)且不穩(wěn)定；物理混合物在25～125 ℃出現(xiàn)的失重是羥丙基-β-環(huán)糊精水分蒸發(fā)與香芹酮揮發(fā)共同疊加的效果，說明主客體間未發(fā)生相互作用。香芹酮與羥丙基-β-環(huán)糊精形成包合物后，在25～300 ℃出現(xiàn)緩慢失重的現(xiàn)象，表明生成包合物后香芹酮的熱穩(wěn)定性增加，延緩了香芹酮的揮發(fā)與釋放。

圖3 羥丙基-β-環(huán)糊精（a），香芹酮（b）、香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精物理混合物（c）和包合物（d）的熱重曲線Fig.3 Thermogravimetry curves of HP -β-CD（a），carvone（b），physical mixture（c）and inclusion compound carvone/HP -β-CD（d）

2.2.4 掃描電鏡分析（scanning electron microscope，SEM）圖4 中SEM 分析顯示了羥丙基-β-環(huán)糊精、物理混合物以及包合物的表面形態(tài)。圖4-A、B 中的羥丙基-β-環(huán)糊精表面有小孔，具有空腔結(jié)構(gòu)大小不一的球形顆粒；圖4-C、D 為物理混合物，可以觀察到有小塊物質(zhì)混合或粘附在球形顆粒上，而圖4-E、F 的包合物呈現(xiàn)出不規(guī)則的塊狀，其物相結(jié)構(gòu)與主體環(huán)糊精及物理混合物明顯不同，說明香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制備成功，主客體之間發(fā)生相互作用，形成了新的物相。

圖4 羥丙基-β-環(huán)糊精（A、B）、 香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精物理混合物（C、D）和包合物（E、F）的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy（SEM）of HP -β-CD（A、 B），carvone/HP -β -CD physical mixture（C，D）and inclusion complex（E，F(xiàn)）

2.2.5 粉末X-射線衍射分析（powder X-ray diffraction，PXRD）粉末X-射線衍射分析是一種驗(yàn)證包合物是否形成的有效方法［30］。包合物的形成會(huì)使客體分子進(jìn)入羥丙基-β-環(huán)糊精空腔內(nèi)，導(dǎo)致晶格發(fā)生變化，進(jìn)而使衍射圖發(fā)生一定的變化［31］。香芹酮是一種液體物質(zhì)，因此無法用粉末X-射線衍射儀進(jìn)行分析。圖5分別為羥丙基-β-環(huán)糊精（A）、香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精物理混合物（B）、包合物（C）以及三者的疊加（D）衍射圖。羥丙基-β-環(huán)糊精是一種非晶態(tài)物質(zhì)，其衍射圖中顯示了非晶態(tài)相關(guān)的寬峰。物理混合物10.18°（2?）的峰值偏移了1.04°，18.8°（2?）的峰強(qiáng)度略有增強(qiáng)。在包合物衍射圖中，10.18°（2?）的峰值略微偏移0.72°，而18.8°（2?）的峰強(qiáng)度大幅增強(qiáng)，結(jié)合上述SEM圖可以看出，這是由包含物的表面形態(tài)與羥丙基-β-環(huán)糊精的球形顆粒狀不同所致，包合物相對(duì)較小的塊狀形態(tài)使其參與X 射線衍射的樣品比表面積增大，從而使得圖譜中衍射峰的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果表明香芹酮與羥丙基-β-環(huán)糊精之間發(fā)生相互作用并形成了主客體包合物。

圖5 羥丙基-β-環(huán)糊精（A）、物理混合物（B）、包合物香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精（C）以及三者疊加（D）的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction of HP -β -CD（A），physical mixture（B），inclusion compound carvone/HP -β -CD（C）and superposition of the three（D）

2.3 抗菌作用分析

由圖6 可知，香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物處理對(duì)硫色鐮刀菌菌落生長有明顯的抑制作用，不同濃度包合物處理對(duì)菌落生長的抑制效果存在差異，表現(xiàn)為濃度越高抑制效果越明顯。根據(jù)回歸方程y=0.787 6x+4.107 2（r=0.981 5），得到香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物抑菌的EC50值為3.11 mmol·L-1。表明香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物對(duì)硫色鐮刀菌具有較好的抑制效果。

3 討論

香芹酮作為馬鈴薯抑芽劑已被美國、荷蘭等國家廣泛應(yīng)用［20］，而其施用時(shí)有效藥效時(shí)間短，需要重復(fù)施藥等問題一直未得到有效解決。Silva 等［32］制備了香芹酮/β-環(huán)糊精包合物并探討其作為馬鈴薯抑芽劑的可能性，但僅研究了包合物的制備與抑芽效果，未對(duì)香芹酮與β-環(huán)糊精的包合機(jī)理進(jìn)行深入研究。許丹等［33］研究發(fā)現(xiàn)，相比β-環(huán)糊精，羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)客體的包合作用、增溶和穩(wěn)定效果更好。因此，本研究以羥丙基-β-環(huán)糊精作為主體，對(duì)客體香芹酮進(jìn)行分子識(shí)別形成主客體包合物，以期改善香芹酮的物理化學(xué)性質(zhì)。與薛碩等［34］研究中的香芹酮/β-環(huán)糊精包合物相比，本研究香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的失重溫度出現(xiàn)的更晚，說明羥丙基-β-環(huán)糊精與香芹酮形成包合物后，相比β-環(huán)糊精更大程度地改善了香芹酮的穩(wěn)定性和釋放性。

本研究通過抑菌試驗(yàn)明確了香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物對(duì)硫色鐮刀菌有抑制作用，且包合物濃度越大，抑菌作用越強(qiáng)。朱云潔［35］研究了沒食子酸辛酯/β-環(huán)糊精包合物對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性，并對(duì)抑菌機(jī)理做了初步探究，結(jié)果表明，沒食子酸辛酯與β-環(huán)糊精形成包合物后，抑菌活性顯著增強(qiáng)，并推斷包合物是通過破壞細(xì)菌膜的完整性和通透性而對(duì)細(xì)菌表面膜電位產(chǎn)生影響，使DNA 分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而抑制細(xì)菌生長。但本研究對(duì)于包合物對(duì)硫色鐮刀菌的抑菌機(jī)理尚不清楚，下一步應(yīng)從抑菌過程中菌的形態(tài)變化和分子生物學(xué)差異表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行深入研究，闡明包合物在實(shí)際使用過程中通過哪些方式抑制或干擾菌的生長，以達(dá)到明顯的抑菌效果，進(jìn)而指導(dǎo)香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物在馬鈴薯貯藏保鮮中的實(shí)際應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究采用共蒸發(fā)-冷凍干燥法成功制備出包合比為1∶1的香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，產(chǎn)率為93.6%，采用相溶解度法確定其穩(wěn)定常數(shù)為409.39 L·mol-1。紫外光譜中香芹酮的吸收峰出現(xiàn)明顯的藍(lán)移且吸光度值明顯增強(qiáng)，1H NMR 光譜中H-3 和H-5 發(fā)生明顯的化學(xué)位移變化，SEM 結(jié)果顯示包合物的晶體形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，X-射線衍射分析中包合物的吸收峰明顯增強(qiáng)，上述結(jié)果均證實(shí)了香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的生成。熱重分析結(jié)果表明，香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的熱穩(wěn)定性強(qiáng)于香芹酮單體，并且羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)香芹酮具有抑制揮發(fā)、緩慢釋放的作用。此外，香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物對(duì)硫色鐮刀菌的生長表現(xiàn)出較好的抑制作用。綜上，香芹酮/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物有望成為安全防控馬鈴薯干腐病的新型抑菌劑。