甘薯離體誘變與抗鹽突變體鑒定

韓婷婷 呂運韜 石源睿 劉世芳 唐銳敏 張紅梅 賈小云

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam］是我國重要的糧食作物之一，富含糖類、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素C和D 等多種成分，有較高的營養(yǎng)價值［1］。甘薯耐旱耐瘠薄，在保障國家糧食安全方面具有重要作用［2］。鹽脅迫是影響作物產(chǎn)量的非生物脅迫之一，目前全世界約有9.6 億公頃鹽堿地，大約有20%的耕地受到土壤鹽漬化危害［3-4］。土壤中鹽分過多，使作物不能正常生長，進而導(dǎo)致產(chǎn)量降低，嚴重制約了農(nóng)業(yè)發(fā)展［5-6］。因此，甘薯抗鹽新品種的創(chuàng)制與培育，對于利用鹽堿地土壤進行作物生產(chǎn)具有重要意義。

化學(xué)誘變劑主要可分為三種：第一種為堿基類似物誘變劑，主要通過取代核酸中堿基使DNA 復(fù)制發(fā)生錯配，如5-溴尿嘧啶；第二種為烷化劑，通過烷基化DNA 分子上的堿基及磷酸，導(dǎo)致堿基錯配引起突變，如甲基磺酸乙酯；第三種為移碼誘變劑，與DNA 相互結(jié)合通過引起堿基缺失或增加導(dǎo)致突變，如吖啶類［7］。平陽霉素（Ping yang mycin，PYM）屬于新型誘變劑，是輪枝鏈霉菌平陽變種產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素，可引起以染色體斷裂為主的高頻率的染色體畸變，從而使細胞發(fā)生變異［8］。與其他誘變劑相比，PYM 具有誘變頻率高、誘變范圍大、安全性高、對人體毒性小等優(yōu)點［9］。

目前已有很多有關(guān)PYM 離體誘變篩選作物優(yōu)質(zhì)突變體的研究。Sui 等［10］和Zhao 等［11］以PYM 為誘變劑，分別獲得了耐旱、抗鹽花生突變體。劉文林等［12］通過將PYM 注入小麥葉鞘和穎殼，獲得的突變株的小穗數(shù)顯著高于對照。Gao 等［13］以甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）與PYM 為誘變劑，體外誘變大麥小孢子，獲得了氮吸收利用效率提高的大麥突變體。張丹丹等［14］以煙薯25 的莖尖為外植體，利用PYM 誘變獲得了單株鮮薯重量顯著高于誘變親本的突變體。張希太［15-16］以PYM 誘變不同小麥品種，獲得了株高、芒型、穗型等表型發(fā)生變異的突變體，并在這些變異種質(zhì)的基因組中發(fā)現(xiàn)了大量的變異位點。黃麗華等［17］發(fā)現(xiàn)PYM 對煙草出苗率、苗高、主根長、根數(shù)、葉綠素含量等指標有較強的誘變效應(yīng)。然而目前PYM 在甘薯化學(xué)誘變中的相關(guān)研究較少，因此，本研究以徐薯18為誘變親本，結(jié)合PYM 化學(xué)誘變和組織培養(yǎng)技術(shù)定向篩選性狀優(yōu)良的抗鹽突變體，以期為選育抗鹽性強的甘薯新品種提供育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的甘薯栽培品種徐薯18（XS-18）由國家種質(zhì)徐州甘薯試管苗庫提供，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類作物研究室種植并保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 試驗所用培養(yǎng)基均以MS 為基本培養(yǎng)基，添加3%蔗糖和0.3%瓊脂，pH 值5.9。誘變培養(yǎng)基為添加PYM 的MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件均為25～27 ℃，光照時間13 h，光照強度為70～90 μmol·m-2·s-1。

1.2.2 徐薯18 莖段組織的PYM 誘變 以不含PYM的MS 培養(yǎng)基為對照，分別在MS 培養(yǎng)基中添加低濃度的PYM（0.25、0.50、0.75 mg·L-1）與高濃度的PYM（1.00、3.00、5.00 mg·L-1）。徐薯18 組培苗切成1 cm保留1個葉芽的莖段后扦插于含有不同濃度PYM的誘變培養(yǎng)基中，每組接種50 個莖段，重復(fù)3 次，誘變處理14 d后統(tǒng)計存活數(shù)，并計算存活率與致死率，確定50%致死率的PYM 誘變濃度。將1.00 mg·L-1PYM 處理后的株系用于抗鹽突變體篩選，然后在1.00 mg·L-1PYM半致死濃度下繼續(xù)誘變徐薯18，擴大誘變株系至4 855株，并用于抗鹽突變體的篩選。

1.2.3 NaCl 篩選臨界濃度的確定及甘薯抗鹽植株篩選 將未經(jīng)誘變處理的徐薯18 莖段接種至含不同濃度 NaCl（0、25、50、75、100、125 mmol·L-1）的MS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)21 d 后根據(jù)植株的生長情況和生根率確定NaCl 的篩選濃度。然后將經(jīng)過PYM 誘變處理的甘薯突變體莖段接種到含125 mmol·L-1NaCl 的篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)21 d后觀察突變體表型，根據(jù)生根率初步篩選抗鹽植株。

1.2.4 甘薯抗鹽突變體生理指標的測定 對初步篩選得到的生根率排前三的3株P(guān)YM誘變株系進行形態(tài)指標的測定，包括根長、株高、根重、地上部鮮重和總鮮重；鹽脅迫相關(guān)生理指標的測定，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。SOD 測定試劑盒、POD測試盒、CAT 測定試劑盒、MDA 測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2.5 甘薯抗鹽突變體中鹽脅迫相關(guān)基因的表達分析 將甘薯抗鹽突變植株與對照徐薯18 在含180 mmol·L-1NaCl 的霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h 后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析鹽脅迫相關(guān)基因的表達情況，包括超氧化物歧化酶基因（IbSOD）、過氧化物酶基因（IbPOD）、抗壞血酸過氧化物酶基因（IbAPX）和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（IbSOS）。利用Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計甘薯鹽脅迫相關(guān)基因的定量引物。以IbActin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析試驗數(shù)據(jù)。引物（3＇→5＇）分別為IbActin-F：AGCAG CATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC/IbActin-R：TGGAAA ATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC；IbSOD-F：TCCTGGA CCTCATGGATTTC/IbSOD-R：GCCACTATGTTTCCCAG GTC；IbPOD-F：ACAGCAAGACGGGTGGCTTA/IbPOD-R：GTAGGCGGGAGTTCCTGGTT；IbAPX-F：CCTGCTGGTC ATTTACGTGA/IbAPX-R：CTGGCCCATCTTTGGTGTAT；IbSOS-F：TGATGAACGATGGGACGGCAA/IbSOS-R：AT GCCACTCCAAAGGCAAGAC。植物RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物公司，Prime ScriptTMRT reagent Kit和SYBR ScriptTMRT reagent Kit Ⅱ購自日本TaKaRa公司。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 每個試驗設(shè)置3 次重復(fù)，用Excel 2016和SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PYM誘變處理徐薯18莖段半致死濃度的確定

用不同濃度PYM 處理14 d 后甘薯莖段的生長狀況如圖1。隨著PYM 誘變濃度的升高，PYM 對莖段生長的抑制作用增加。當PYM 誘變濃度為0.25～1.00 mg·L-1時，PYM 對莖段生長的抑制作用較弱，甘薯莖段均可生根并長出新的葉芽（圖1-A）；當PYM 濃度超過1.00 mg·L-1時，甘薯莖段的生長受到強烈的抑制作用，莖段不生根且褐化現(xiàn)象加?。▓D1-B）。當PYM 濃度為1.00 mg·L-1時，徐薯18 莖段存活率為56%，當PYM 濃度為5.00 mg·L-1濃度時，莖段全部死亡。因此，確定1.00 mg·L-1PYM為甘薯莖段誘變14 d的半致死濃度。

2.2 抗鹽突變體NaCl篩選臨界濃度的確定

由圖2可見，不同濃度的NaCl處理均抑制了徐薯18的生長，且隨著NaCl濃度的升高，抑制作用增強，生根率降低。當NaCl濃度為125 mmol·L-1時，地上部和地下部生長均受到嚴重抑制，生根率低于20%。因此，125 mmol·L-1NaCl為篩選徐薯18抗鹽突變體的臨界濃度。

圖2 不同濃度 NaCl 處理下徐薯 18 的生長情況Fig.2 The growth state of Xushu 18 under different NaCl concentration

2.3 甘薯抗鹽誘變材料的篩選

在1 mg·L-1PYM（半致死濃度）下誘變徐薯18，共獲得4 855 株誘變株系，將獲得的誘變株系接種到含125 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d，以生根率作為抗鹽篩選指標篩選抗鹽突變體。對鹽脅迫下的不同誘變株系的生根率進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)有43 株生根。生根率最高的3株突變體分別為75-2、52-1、33-1，生根率分別為100%、95%、95%，均高于徐薯18。植株生長狀況如圖3所示，正常生長條件下（0 mmol·L-1NaCl +MS 培養(yǎng)基），3 株突變體的根長、根鮮重與對照徐薯18 無明顯差異（圖3-A）；鹽脅迫下（125 mmol·L-1NaCl +MS 培養(yǎng)基），對照徐薯18 的生長受到明顯抑制（圖3-B），且在該處理下的突變體33-1、52-1、75-2 株高、根長、根鮮重、地下部鮮重、總鮮重均顯著高于對照徐薯18，3 株突變體鹽脅迫下的形態(tài)指標變化量均低于徐薯18，表明3株突變體耐鹽性高于徐薯18（表1）。

表1 正常生長和125 mmol·L-1 NaCl脅迫下徐薯18及其突變體的形態(tài)指標Table 1 Morphological index of the Xushu 18 and mutants under normal growth and 125 mmol·L-1 NaCl stress

圖3 正常處理和鹽脅迫下徐薯18及其突變體的生長狀況Fig.3 The growth of Xushu 18 and mutants under normal treatment and NaCl stress

2.4 鹽脅迫對徐薯18突變體抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、CAT 活性是評價植物抗逆性強弱的重要生理指標［18］。由圖4 可知，正常生長情況下，徐薯18 的保護酶活性與3 株突變體植株之間無顯著差異。在鹽脅迫下，突變體33-1、52-1、75-2的SOD、POD、CAT活性均升高，且顯著高于對照徐薯18（圖4-A～C）。3 株突變體中75-2 突變株的SOD 和CAT 活性最高，52-1突變株的POD 活性最高。MDA 是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，MDA過量積累會改變細胞膜的通透性，是膜系統(tǒng)受損害的重要標志之一［19］。鹽脅迫下，3株突變株系的MDA 含量均顯著低于徐薯18，其中75-2 突變體的MDA 含量最低（圖4-D），表明突變體植株的細胞膜系統(tǒng)受損傷較低或者細胞清除MDA能力較高。

圖4 鹽脅迫對徐薯 18 及其突變體抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of salt stress on antioxidant enzymes of the Xushu 18 and mutants

2.5 甘薯突變體抗鹽性隸屬函數(shù)分析

為了全面評價PYM 誘變后徐薯18 突變株的抗鹽性，采用Fuzzy 數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)，對鹽脅迫下各個性狀指標進行綜合評價來評定抗鹽性。隸屬函數(shù)值即其加權(quán)值，加權(quán)值越大，表示抗鹽性越好［20］。若生理指標與抗鹽性成正相關(guān)，隸屬函數(shù)X=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）；若生理指標與抗鹽性成負相關(guān)，隸屬函數(shù)X=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）。Xi代表生理指標測定值；Xmin代表對應(yīng)生理指標的最小值；Xmax代表對應(yīng)生理指標的最大值。由表2 可知，52-1、75-2、33-1 突變體加權(quán)值均大于徐薯18，表明這3 株突變株的抗鹽性高于徐薯18。

表2 鹽脅迫下徐薯18及突變體各指標的隸屬函數(shù)值Table 2 The membership function of Xushu 18 and mutants under NaCl stress

2.6 鹽脅迫下甘薯突變體抗性相關(guān)基因的表達分析

采用qRT-PCR 分析0和180 mmol·L-1NaCl脅迫下的徐薯18 和突變體鹽脅迫相關(guān)基因的表達水平，結(jié)果如圖5所示。鹽脅迫處理12 h 后，徐薯18 及突變體（75-2、52-1、33-1）中鹽脅迫相關(guān)基因IbSOD、IbPOD、IbAPX、IbSOS的表達量均提高，且均顯著高于對照徐薯18。其中，75-2 突變體中的IbSOD基因表達量最高，52-1突變株IbPOD與IbAPX基因表達量最高，33-1突變體中的IbSOS基因表達量最高。

圖5 鹽脅迫下徐薯18及其突變體抗性相關(guān)基因的表達Fig.5 Expression of salt-resistant genes in Xushu 18 and mutants

3 討論

甘薯是種植廣泛的塊根作物之一，而鹽脅迫往往會降低其產(chǎn)量，因此，培育抗鹽性高的甘薯新品種具有重要意義。化學(xué)誘變育種是作物遺傳改良、提高育種效率和新品種創(chuàng)新的重要途徑，而且通過化學(xué)誘變獲得的特異性突變體有利于闡明基因的功能與作用機理［21-22］。離體誘變已在多種植物，如東云、鳶尾、木薯等種質(zhì)資源的改良中取得成功［23-25］。PYM 作為一種安全、高效、誘變頻率高的化學(xué)誘變劑，已在多種作物中得到應(yīng)用［8］。本研究以PYM 誘變徐薯18莖段，確定PYM 誘變徐薯18 莖段的半致死濃度為1.00 mg·L-1，為甘薯的化學(xué)離體誘變提供了參考依據(jù)。

確定適宜的NaCl 濃度是篩選耐鹽突變體的關(guān)鍵，篩選濃度過低達不到區(qū)分親本和突變體的目的，篩選濃度過高則會嚴重影響突變體的生長狀態(tài)［26］。本研究確定甘薯（徐薯18）抗鹽突變體的NaCl 篩選濃度為125 mmol·L-1，這與黃瓜［27］、紫茉莉［28］抗鹽種質(zhì)的NaCl篩選濃度差異不大。本研究以甘薯植株的生根率為指標初步篩選突變體，對生根率最高的3 株突變體株系75-2、33-1、52-1 進行形態(tài)指標的測定，在鹽脅迫下3 株甘薯突變體根長、株高、根鮮重、地上部鮮重、總鮮重均顯著高于對照徐薯18。鹽脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡受到破壞，產(chǎn)生過量MDA，使細胞膜流動性下降，膜功能受到損傷［29-31］。SOD、POD、CAT 等保護酶可清除細胞中產(chǎn)生的過量活性氧［4］。因此，植物中保護酶活性和MDA 含量可直接反映植物的抗鹽性。本研究篩選到的3 株突變體在鹽脅迫下的SOD、POD、CAT 活性均顯著高于徐薯18，MDA含量顯著低于徐薯18。進一步對鹽脅迫相關(guān)基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，180 mmol·L-1NaCl脅迫下，突變體（75-2、52-1、33-1）中IbSOD、IbPOD、IbAPX、IbSOS的表達量均顯著高于誘變親本。綜上，推測這3 株突變體的抗鹽性優(yōu)于誘變親本，為進一步研究甘薯的耐鹽性提供了有價值的新材料。

本試驗獲得了3 株具有抗鹽性的徐薯18 突變株，其抗鹽性是否屬于基因變異以及能否在后代中穩(wěn)定遺傳，仍需進一步研究。為了確定徐薯18 抗鹽突變株與親本間的抗鹽性差異是否與基因突變有關(guān)，今后將進一步從全基因組水平分析和篩選抗鹽突變植株與徐薯18在鹽脅迫響應(yīng)中的差異基因。

4 結(jié)論

本研究確定了徐薯18莖段誘變處理14 d后的PYM的半致死濃度為1.00 mg·L-1。徐薯18抗鹽材料的NaCl篩選濃度為125 mmol·L-1。通過將經(jīng)1.00 mg·L-1PYM 處理14 d后的甘薯植株接種到含125 mmol·L-1NaCl 的篩選培養(yǎng)基，共篩選到43株生根的PYM誘變株系。在鹽脅迫下，通過生根率篩選出了3株甘薯抗性突變體，其形態(tài)和生理指標均顯著高于誘變親本，且抗鹽基因表達量也顯著高于誘變親本，表明這3株甘薯突變體具有抗鹽性。