玉米紫色葉突變體zmpl-1表型分析及基因定位

朱振興,郭長英,李 丹

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物分子改良實(shí)驗(yàn)室,遼寧 沈陽 110161)

葉片是植物接受陽光,進(jìn)行光合作用最重要的組織器官。一般植物葉片顏色,因富含葉綠色葉片呈現(xiàn)綠色。在一些外界環(huán)境下刺激或脅迫下,如到了秋季氣溫變低,葉綠素逐漸降解,當(dāng)花青素的含量多于葉綠素時(shí),葉片就會(huì)呈現(xiàn)紫色;在缺磷的條件下,植物會(huì)合成更多花青素,葉片也變成紫色[1]。因此,紫色被認(rèn)為是花青素的標(biāo)識物,花青素屬于黃酮類物質(zhì),是廣泛存在于植物體內(nèi)的一種天然色素,在植物著色以及抗氧化上具有重要作用。也因此可以保護(hù)人體免受自由基氧化的損傷、增加皮膚光滑度、保護(hù)肝臟、保持血管彈性等,是抗氧化、抗衰老的重要活性物質(zhì)[2]。葉色突變體是開展葉片顏色調(diào)控基因功能及光合作用研究的重要材料。在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的葉色突變體多種多樣,包括多種類別,有淺綠葉、黃化轉(zhuǎn)綠葉、黃化葉、白化葉、條紋葉以及紫色葉等[3~7]。紫色葉突變體是研究花青素生物合成調(diào)控的重要材料。另外紫色葉容易識別,對植株生長發(fā)育影響小等特點(diǎn),也被應(yīng)用到品種制種去雜、純度鑒定等育種過程中,可以減少田間人工去雜工作量,極大的提高去雜效率[8]。玉米是中國的第一大作物,在國民生活及經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。盡管玉米花青素生物合成途徑可能與其它物種中分子機(jī)制相似[9],但缺乏詳實(shí)的數(shù)據(jù),還有很多不清楚的地方。發(fā)掘、研究玉米紫色葉片突變體,可以補(bǔ)充、完善玉米花青素合成的分子機(jī)制,也可為制種去雜提供標(biāo)記材料。

盡管葉色突變體在不同物種中報(bào)道了很多,但紫葉相關(guān)突變體報(bào)道相對較少[10]。紫葉突變體在水稻、小麥、油菜等作物中有少量報(bào)道。水稻中克隆了1個(gè)位于第6條染色體上的紫葉控制基因OsPL6,編碼了1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子[11]。在該基因的5’UTR非翻譯區(qū)鑒定到3個(gè) SNP和1個(gè)6 bp的缺失。研究發(fā)現(xiàn)正是該非翻譯區(qū)的變異,導(dǎo)致該MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的上調(diào),繼而促進(jìn)了花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的上調(diào)表達(dá),包括OsCHS、OsPAL、OsF3H以及OsF3’H基因表達(dá)都顯著的被提高,從而促進(jìn)了花青素積累。水稻中的另1個(gè)紫色葉調(diào)控基因OsPL,位于第5條染色體上,同樣也編碼了1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子。該基因第3個(gè)外顯子上插入了1個(gè)堿基,造成了該編碼基因移碼突變[12]。該基因的突變造成植物葉片中花青素含量增加,葉綠素減少。與之相對應(yīng)的是較野生型,花青素合成基因OsPAL、OsCHS、Os-ANS以及OsMYB55顯著上調(diào)表達(dá),而光合相關(guān)基因表達(dá)都被下調(diào)。在小麥中報(bào)道的1個(gè)低溫敏感的紫條紋突變體psl1[13],在低溫下顯示紫色,花青素積累多而葉綠素和胡蘿卜素降低,而在高溫條件下則表現(xiàn)為正常綠色。遺傳分析表明,psl1表型受細(xì)胞質(zhì)遺傳控制。熒光定量實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示出,低溫條件下在相對幼嫩的葉片中葉綠體發(fā)育相關(guān)基因psbA和psbC基因下調(diào)最多。油菜中克隆了1個(gè)能提高紫葉芥菜花青素含量基因BjPur,該基因編碼 1個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[14]。紫葉親本(ZY)與綠葉親本(LY)中的BjPur基因序列比較發(fā)現(xiàn),紫葉親本中的BjPur基因的第一個(gè)內(nèi)含子中有1個(gè)較大的插入,造成BjPur基因在紫葉植株中表達(dá)顯著被提高,而且該基因在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根中。

本研究從在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的EMS人工誘變玉米B73突變體庫中,篩選到1份特異的玉米紫色葉突變體,命名為zmpl-1。擬通過構(gòu)建F2定位群體,分析紫色葉突變體控制基因的遺傳特性,并通過重測序BSA-seq定位該基因位置,以其為解析玉米花青素形成分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及種植條件

玉米紫色葉突變體zmpl-1,玉米品種 Mo17。小缽盆栽實(shí)驗(yàn)于2021年3月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工氣候箱中(澤大儀器有限公司)開展,12 h光照/12 h黑暗,將催完芽后的玉米種子播種于滅菌的營養(yǎng)基質(zhì)中(購置于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)工廠化技術(shù)服務(wù)中心),然后正常澆水,培養(yǎng)至指定天數(shù)。F2材料2021年5月常規(guī)種植于試驗(yàn)地中,種植大概行距40 cm,行長 2 m,株距 20 cm,其它與一般大田管理,正常澆水、施肥、蟲害管理等。

1.2 葉片花青素含量測定

于2021年3月取葉片鮮樣約0.1 g,提取液為0.1 mol/L的鹽酸乙醇溶液(1 L溶液含有8.3 ml濃鹽酸其余用95%乙醇稀釋)。首先將葉片置于2 ml離心管,加入一顆4 mm直徑陶瓷珠(因溶液呈酸性注意不要使用金屬小球)以及1ml提取液,于植物組織研磨儀上以頻率 50破碎1 min(上海靜信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司 Tissuelyser-64L組織研磨儀)。然后轉(zhuǎn)入50 ml離心管中并加入9 ml提取液,于60℃溫育提取30 min,然后加入5 ml提取液繼續(xù)浸提15 min,再次加入5 ml提取液繼續(xù)浸提15 min,最后用提取液定容至25 ml,全程注意避光。其后在分光光度計(jì)上(日本島津 UV2600)分別檢測530 nm、620 nm以及650 nm波長處的光密度值,然后按照Greey公式計(jì)算花青素含量,花青素含量(nmol/g)=[(OD530-OD620)-0.1×(OD650-OD620)]×V/W/(4.62×104)×1 000 000,其中 V,提取液加入總體積(ml);W,重量(g);4.62×104為花青素摩爾消光系數(shù)。

1.3 DNA提取及BSA-seq

在B73背景紫色葉突變體zmpl-1與Mo17雜交組配的F2群體中,分別取野生表型14份植株,突變體表型植株14份葉片,然后進(jìn)行基因組DNA提取,提取采用植物高效基因組DNA提取試劑盒DP350(天根生化科技有限公司)。純化出來的基因組DNA采用兩種方法進(jìn)行濃度和質(zhì)量的檢測,一是0.8%瓊脂糖凝膠電泳,要求基因組DNA條帶清晰、銳利,無明顯拖尾;二是采用Nanodrop(美國賽默飛世爾科技公司)測定 DNA質(zhì)量和濃度,挑選出的樣品要求280/260,260/230比值在1.8~2.2之間。利用重測序技術(shù)進(jìn)行BSA-Seq時(shí),兩個(gè)混池按照每個(gè)樣品基因組DNA使用總量100 ng均一混樣即可,每個(gè)樣品濃度要求在 50 ng/μl左右。檢測合格的基因組DNA混樣,送到北京普朗泰科生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序分析。

測序出來的原始序列過濾掉接頭序列、低質(zhì)量序列等,得到Clean Reads,用于后續(xù)分析。bwa軟件將重測序獲得的短序列reads定位到參考基因組上(zea_mays.V4,ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-41/fasta/zea_mays/dna/)。通過比對定位Clean Reads在參考基因組上的位置,統(tǒng)計(jì)各樣品的測序深度、基因組覆蓋度等信息,并進(jìn)行變異的檢測。利用GATK軟件工具包檢測SNP(Single Nucleotide Polymorphism)。性狀關(guān)聯(lián)分析采用歐式距離(Euclidean Distance,ED)算法[18],利用測序數(shù)據(jù)尋找混池間存在顯著差異的標(biāo)記,并以此評估與性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域的方法。在進(jìn)行分析時(shí),利用兩混池間基因型存在差異的SNP位點(diǎn),統(tǒng)計(jì)各個(gè)堿基在不同混池中的深度,并計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)ED值。利用標(biāo)記在基因組上的位置,對同一條染色體上標(biāo)記的ED值進(jìn)行擬合,并根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值,選擇閾值以上的區(qū)域作為與性狀相關(guān)的區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型觀察及花青素含量測定

該突變體僅葉尖及葉緣部位呈現(xiàn)紫色,而葉片其它部位顏色較野生型 B73無明顯差異(圖1A,B以及F)。在14 d苗齡時(shí),突變體第1、2片全展葉在葉尖呈現(xiàn)紫色,特別是第2片全展葉(圖1A和圖1B)。第2片全展葉的花青素含量測定表明zmpl-1突變體葉片中花青素含量較野生型顯著增加,大概為野生型葉片中含量的10倍(圖1C)。在吐絲期時(shí),觀察突變體表型發(fā)現(xiàn),該紫色葉片的面積在老葉中比較大,而在相對幼嫩的葉片中逐漸減少,最上面的6片葉中上幾乎觀察不到紫色,而最后的5片葉片中,紫色葉片在葉尖及葉緣范圍依次增加(圖1D~F)。

圖1 野生型B73和zmpl-1突變體植株表型及葉片花青素含量Figure 1 Phenotype and leaf anthocyanin concentrations of wild type B73 and zmpl-1 mutant

2.2 遺傳分析

在B73背景的zmpl-1突變體與Mo17雜交的F1植株47株,均呈現(xiàn)出正常綠色葉片,說明該紫色葉性狀受隱性基因控制。在吐絲期觀察F2群體中植株葉片表型的分離情況,結(jié)果顯示在種植的F2群體中,葉片表現(xiàn)類似于zmpl-1突變體表型的植株僅有14株,葉片全綠色的植株有962株。

卡方分析表明,F2中紫色葉表型植株與綠色葉植株數(shù)量符合63∶1的比例(表1),表明該紫色葉性狀可能受3個(gè)隱性基因共同調(diào)控,而且只有這3個(gè)隱性基因都存在的情況下,植株才能顯示出紫色葉表型。

表1 zmpl-1×Mo17 F2群體中分離個(gè)體遺傳分析Table 1 Statistical analysis of phenotype of F 2 population from zmpl-1×Mo17

2.3 BSA-seq重測序數(shù)據(jù)總概

B73來源突變體zmpl-1與 Mo17雜交組配定位群體,在吐絲期F2群體中挑選14株突變體表型植株以及14株葉片顏色全綠色植株,進(jìn)行BSA-seq重測序分析。結(jié)果表明兩個(gè)混樣池綠色葉混樣池(L)以及紫色葉混樣池(P),測序總數(shù)據(jù)量分別高達(dá)272 054 640和257 343 500個(gè)Clean reads,數(shù)據(jù)量達(dá)到了平均17X和16X的測序深度,而定位到基因組上的Clean reads數(shù)比例也高達(dá) 90%,說明測序數(shù)據(jù)量多,質(zhì)量也高(表2)。

表2 BSA-seq測序數(shù)據(jù)總概Table 2 Statistical analysis of BAS-seq data

2.4 性狀關(guān)聯(lián)分析

性狀關(guān)聯(lián)分析采用歐式距離(Euclidean Distance,ED)算法,通過統(tǒng)計(jì)各堿基在不同混池中的等位基因頻率,計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的原始ED值。根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值判定,最終將紫色葉zmpl-1突變體控制基因定位到第2條、第3條、第5條以及第10條染色體上(圖2),區(qū)間高達(dá)207.3 Mb。詳細(xì)關(guān)聯(lián)到的信息如表3所示,主要定位區(qū)域是第2條及第10條染色體上的區(qū)間,而第3條與第5條染色體上涉及的定位區(qū)域相對較少僅8.8 Mb。

圖2 SNP-index值在染色體上的分布Figure 2 Distribution of SNP-index on chromosomes

表3 染色體關(guān)聯(lián)區(qū)域匯總Table 3 Summary of associated chromosome region

染色體編號 起始位置 結(jié)束位置 區(qū)間大小(Mb) 染色體編號 起始位置 結(jié)束位置 區(qū)間大小(Mb)2 79800000 83100000 3.3 3 234700000 235400000 0.7 2 84300000 88200000 3.9 5 300000 400000 0.1 2 90700000 91900000 1.2 5 900000 5600000 4.7 2 93900000 101300000 7.4 10 6700000 17600000 10.9 2 101500000 109800000 8.3 10 18100000 32600000 14.5 2 110300000 116600000 6.3 10 33800000 37800000 4 2 117500000 117600000 0.1 10 38000000 42800000 4.8 2 117800000 120300000 2.5 10 46300000 47200000 0.9 2 120900000 121100000 0.2 10 47400000 47600000 0.2 2 121600000 124900000 3.3 10 49700000 51400000 1.7 2 130900000 135100000 4.2 10 54100000 67500000 13.4 2 138000000 138400000 0.4 10 69700000 88400000 18.7 2 138600000 138700000 0.1 10 90200000 93700000 3.5 2 146300000 157500000 11.2 10 96100000 100600000 4.5 2 158200000 160300000 2.1 10 109000000 132700000 23.7

3 結(jié)論與討論

花青素是一類植物中廣泛存在的天然色素,抗氧化性好,在食品著色、醫(yī)藥、化妝品等方面都有重要用途[3]。紫色一般被認(rèn)為是花青素化合物的標(biāo)記性顏色,紫色葉突變體是研究花青素生物合成、調(diào)控途徑重要的原始材料[11~14]。本研究對EMS誘變玉米B73突變體庫中篩選到的紫色葉突變體zmpl-1進(jìn)行了表型分析、葉片花青素含量測定、遺傳和重測序 BSA-seq基因定位分析。表型觀察表明,zmpl-1突變體在葉尖及葉緣出現(xiàn)紫色,而且紫色的分布在老葉與新葉不同。花青素測定表明突變體紫色葉片中花青素含量較野生型大幅提高。與 Mo17組配的 F2群體中植株葉片顏色表型遺傳分析表明,該zmpl-1突變體紫色葉性狀可能受3個(gè)隱性基因控制。BSA-seq重測序?qū)⒃撟仙~性狀控制基因定位到4條染色體上207.3 Mb的區(qū)間內(nèi),包括染色體第 2條、第 10條、第3條以及第5條。

本研究中鑒定的玉米紫色葉突變體zmpl-1,遺傳分析表明該性狀可能受3個(gè)隱性基因調(diào)控(表1),而 BSA-seq將該基因定位在四條染色體上(圖2),主要是第2條和第10條染色體上的區(qū)間,下一步需要重點(diǎn)關(guān)注這兩個(gè)區(qū)間。綜合紫色葉突變體zmpl-1的遺傳分析和定位來看,該紫色葉性狀受多個(gè)基因控制,而且需要幾個(gè)基因同時(shí)為隱性基因型才能起作用,植株葉片呈現(xiàn)紫色表型。該突變體出現(xiàn)的原因可能是我們在突變體庫建立時(shí)使用EMS誘變花粉時(shí),使用的劑量較大,容易造成出現(xiàn)多位點(diǎn)突變。在油菜中鑒定到的紫色葉相關(guān)調(diào)控基因,主要定位在兩條染色體上,B04以及B05上。最終克隆了位于B05染色體上BjPur,該基因編碼了一個(gè) R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[14]。油菜中的BjPur基因是半顯性基因,而我們玉米突變體zmpl-1是受隱性基因控制,表明該基因的調(diào)控的分子路徑與油菜BjPur基因很可能不同。而其它幾個(gè)在水稻中已經(jīng)發(fā)表的紫葉調(diào)控基因都與花青素合成途徑有關(guān),克隆出來的基因基本都是屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員[11~12],因此在zmpl-1定位區(qū)間搜尋相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子可能是克隆該基因重要方法。從另一方面來說,從zmpl-1受隱性多基因調(diào)控,與其它現(xiàn)已報(bào)道紫葉調(diào)控基因明顯不同,我們鑒定的這一份玉米紫色葉突變體zmpl-1屬于特異的資源,為解析新的玉米花青素分子路徑提供了重要材料。

本研究僅是初定位了玉米突變體zmpl-1,定位區(qū)間很大,離基因克隆還有一定距離。下一步需要擴(kuò)大群體,進(jìn)行精細(xì)定位。盡管我們F2群體取樣是在吐絲期,確保了樣品表型的準(zhǔn)確性,規(guī)避了苗期取樣易出現(xiàn)表型不準(zhǔn)確情況(田間B73野生型苗期可能是冷害或是肥料不均一等原因,容易出現(xiàn)紫色葉片植株)。但是從遺傳分析上看紫色葉突變表型可能受3對隱性基因共同調(diào)控,在重測序BSA-seq結(jié)果卻定位到基因組4個(gè)區(qū)域上,可能由于用于測序植株數(shù)量較少,造成假陽性位點(diǎn)的出現(xiàn)。而第2條和第10條染色體上關(guān)聯(lián)到的區(qū)間較多,該結(jié)果應(yīng)該可靠,需要進(jìn)一步精細(xì)定位。但由于在F2定位群體中出現(xiàn)紫色葉表型的個(gè)體數(shù)量非常少,未來精細(xì)定位工作量巨大。而且從現(xiàn)在的表型看,如何能定位到這幾個(gè)基因具有很大的挑戰(zhàn)性。在基因定位策略中有一種定位手段叫Mutmap[15],該策略通過與野生型材料回交,可以過濾掉很多干擾位點(diǎn)的影響,然后同樣是進(jìn)行混池法測序,檢測 SNP、indel等變異,檢測后代基因頻率,實(shí)現(xiàn)突變位點(diǎn)的定位。因此將來也可以嘗試采用回交群體利用Mutmap方法繼續(xù)進(jìn)行基因的定位,挖掘候選基因。