凡納濱對蝦過氧化物還原酶3基因的分子克隆與功能分析

郭 慧，李 騰,，張秀霞，魯耀鵬，張澤龍，李軍濤，鄭佩華，冼健安

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院海南省熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站，廣東 湛江 524013）

過氧化物還原酶（Peroxiredoxin,Prx）是多數(shù)生物的一類多功能抗氧化酶[1]，在生物體免疫、發(fā)育、炎癥、蛻皮、繁殖和細(xì)胞凋亡等過程發(fā)揮關(guān)鍵作用[2,3]。Prx 由六個(gè)亞家族（Prx1～Prx6）構(gòu)成，通過半胱氨酸（Cys）殘基的數(shù)目和保守程度分為三類：Prx1～Prx4，典型的2-Cys Prx；Prx5，非典型2-Cys Prx；Prx6[5-7]。其中，典型2-Cys Prx 是甲殼動物中分布較多的Prx 類型，有較高的催化效應(yīng)[8]，主要通過同源二聚體的方式清除過氧化氫、烷基過氧化氫等過氧化物。

目前，已在脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）[9]、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）[10]、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[11]和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[12]等甲殼動物中獲得Prx基因及其編碼的氨基酸序列。然而，這些研究僅發(fā)現(xiàn)Prx基因的其中一個(gè)或幾個(gè)亞型[13]，其表達(dá)模式也有一定物種差異和基因亞型差異，蝦蟹類中許多物種的Prx信息還有待挖掘和深入探究[12]。迄今，關(guān)于凡納濱對蝦Prx的研究較少，其在凡納濱對蝦遭受病原菌感染及逆境脅迫時(shí)的生理功能尚不清楚。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國最重要的養(yǎng)殖蝦種之一。然而，工廠高密度集約化的養(yǎng)殖模式嚴(yán)重破壞了對蝦的養(yǎng)殖環(huán)境，引起種質(zhì)資源退化、病害頻發(fā)，造成蝦類免疫功能受損及抗應(yīng)激能力下降，給水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)造成較大損失[14-15]。鑒于Prx基因在機(jī)體免疫過程中的重要作用，筆者研究其在對蝦抗脅迫和抗病原體免疫防御中的作用，為研究甲殼動物Prx基因的生理功能及作用機(jī)制提供參考，并為培育抗病高產(chǎn)對蝦新品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試對蝦的管理和飼養(yǎng)

凡納濱對蝦購自于海南省文昌市對蝦養(yǎng)殖場，體質(zhì)量（7.56±0.79）g，體長（9.86±0.28）cm，生長狀況良好。實(shí)驗(yàn)在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院文昌實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。所有對蝦暫養(yǎng)在鹽度15、溫度（24±2）℃、pH 7.9～8.0 的循環(huán)海水系統(tǒng)中，連續(xù)曝氣增氧，并進(jìn)行循環(huán)過濾處理。在實(shí)驗(yàn)前，每天定時(shí)定點(diǎn)定量投喂對蝦商業(yè)飼料（基本成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)：蛋白質(zhì)40%，脂肪5%，纖維5%，灰分16%）。

1.2 對蝦總RNA提取及cDNA合成

取健康蝦3尾，剖取肝胰腺，放入液氮中進(jìn)行研磨，按TRIzol 法提取組織總RNA，利用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）檢驗(yàn)RNA 的純度和質(zhì)量，并通過瓊脂糖凝膠電泳評估其完整性。選取質(zhì)量良好的總RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 Prx基因cDNA序列克隆

從凡納濱對蝦肝胰腺4-NP 脅迫轉(zhuǎn)錄組中得到LvPrx3基因的部分序列，設(shè)計(jì)中間片段的擴(kuò)增引物Prx-F和Prx-R（表1）。以凡納濱對蝦肝胰腺cDNA為模板，經(jīng)過第1 輪PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒（生工生物工程(上海)股份有限公司）回收、純化，連接至pMD18-T 載體（TaKaRa，大連），轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa，大連）中。挑選陽性單克隆質(zhì)粒，送至深圳華大基因公司測序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in experiments

LvPrx3基因5＇ 末端片段按照SMART RACE cDNAAmplification Kit試劑盒（Clontech,USA）說明書進(jìn)行擴(kuò)增，用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)基因下游引物Prx-5＇R 和Universal Primer Mix（UPM）進(jìn)行配對擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃30 s，68 ℃30 s，72 ℃3 min，30 個(gè)循環(huán)。Prx3＇末端，使用3＇-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase 試劑盒（Clontech，USA），根據(jù)已知中間片段設(shè)計(jì)基因上游引物Prx-3＇F，然后與3＇ RACE Outer Primer 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。5＇-RACE 和3'-RACE 產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化，與克隆載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，測序。將目的基因5＇和3＇端測序結(jié)果聯(lián)合中間片段進(jìn)行拼接，取得最終的LvPrx3基因cDNA 全長序列。

1.4 LvPrx3基因序列分析

通過DNAStar 中的EditSeq 軟件分析LvPrx3的開放閱讀框（ORF）及其推導(dǎo)的氨基酸序列，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫 的BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）查找LvPrx3的同源核酸序列及其氨基酸序列并進(jìn)行比對。用ExPASy（http://au.expasy.org/tools/）程序預(yù)測LvPrx3的蛋白理化性質(zhì)，以SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測其信號肽，運(yùn)用TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位；再通過NCBI 的保守結(jié)構(gòu)域（CDD）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測其保守區(qū)和特殊位點(diǎn)；運(yùn)用Clustal X 和MEGA 6.0 對不同物種來源的Prx 氨基酸序列進(jìn)行多重比對及聚類分析，并以鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（置信度：Bootstrap=1000）。

1.5 LvPrx3基因組織分布特征分析

隨機(jī)選取15 尾健康蝦，取其血細(xì)胞以及眼柄、鰓、肝胰腺、腸道、肌肉組織，提取其總RNA并進(jìn)行半定量PCR。以內(nèi)參基因的β-ActinF和β-ActinR為引物，各組織cDNA為模板進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增，程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳評估。根據(jù)條帶亮度調(diào)整各組織cDNA模板使用量，使內(nèi)參基因擴(kuò)增的片段亮度基本一致，最終確定各組織cDNA用量。在相同狀態(tài)下，以Prx-RT-F和Prx-RT-R為引物擴(kuò)增LvPrx3，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 脂多糖（LPS）注射和4-壬基酚（4-NP）脅迫實(shí)驗(yàn)

將150尾健康對蝦隨機(jī)分成LPS組和對照組，每組3 個(gè)重復(fù)組，每重復(fù)組25 尾。將LPS（2 mg·mL-1，E.coliL2880，Sigma）溶解于無菌生理鹽水，配制成2 μg·μL-1的LPS 注 射液。根據(jù)Xian 等[16]的研究，LPS 組按每g 蝦8 μg 的用量注射LPS 溶液，對照組注射等量的無菌生理鹽水。在注射后的0、3、6、12、24、48 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對照組各隨機(jī)采樣9 尾，取其眼柄和腸道在液氮速凍，置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)本課題組的前期研究確定4-NP 脅迫質(zhì)量濃度500 μg·L-1[17]。用4-NP（標(biāo)準(zhǔn)品，純度最低為99%）和無水乙醇制備1 mg·mL-1的4-NP 母液。在海水中加入4-NP 母液，使4-NP 最終質(zhì)量濃度為500 μg·L-1。對照組中加入等量的無水乙醇。無水乙醇在4-NP實(shí)驗(yàn)組中的最終體積分?jǐn)?shù)小于0.002%。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行組隨機(jī)放置健康蝦30 尾。為保證水體的實(shí)驗(yàn)濃度穩(wěn)定，每24 h換水1次，每次換水量為50%，加入4-NP工作溶液，保持4-NP 最終質(zhì)量濃度為500 μg·L-1，在水體中的實(shí)際質(zhì)量濃度為（467.18 ± 28.56）μg·L-1。在對照組中未檢測到4-NP。4-NP暴露0、24和48 h后，每個(gè)平行分別隨機(jī)采集9尾蝦，取其眼柄和腸道在液氮速凍保存。

1.7 LvPrx3基因相對表達(dá)量分析

用Bio-Rad T100（Bio-Rad，USA）儀器進(jìn)行qRTPCR檢測，以Prx-RT-F、Prx-RT-R和β-ActinF、β-ActinR為引物，PCR 反應(yīng)體系設(shè)置為20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃3 min，95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析LPS刺激和4-NP脅迫下，LvPrx3基因在相應(yīng)組織中的表達(dá)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 LvPrx3基因序列分析

通過5＇/3＇-RACE 技術(shù)分別克隆得到585 bp 的5＇末端和682 bp 的3＇末端，經(jīng)拼 接獲得962 bp 的LvPrx3cDNA 全長序列。該序列含有45 bp 的5＇端非編碼區(qū)（5＇ UTR）、233 bp 的3＇ 端非編碼區(qū)（3＇ UTR）和684 bp 的ORF，可編碼227 個(gè)氨基酸。其3＇末端處有1 個(gè)終止密碼子TAA，多聚腺苷酸加尾信號AATAAA 和poly A 尾（圖1）。LvPrx3 蛋白的分子質(zhì)量為25.09 ku，pI 為6.22。LvPrx3具有“FYPLDFTFVCPTE”的N 端和“GEVCPA”的C 端，為典型2-Cys Prx的特殊結(jié)構(gòu)域。此外，LvPrx3還有以下的特殊結(jié)構(gòu)域：催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)（T77-C80-R156），二聚體界面（V37-F78-V79-T82-G145-L155-K168-H169-M170-V172-N173-D174-G178-R179-R186-C201-P202-A203-N204），十聚體（五個(gè)二聚體）界面（F76-F110-S111-F136-K138-D150），過氧化和可溶性半胱氨酸（C80-C201）（圖2）。SignalP 5.0預(yù)測結(jié)果表明，LvPrx3蛋白為跨膜信號肽。Cell-PLoc 2.0預(yù)測結(jié)果顯示，LvPrx3蛋白主要定位于線粒體中。

圖1 凡納濱對蝦Prx3及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Prx3 gene of Litopenaeus vannamei

2.2 LvPrx3基因同源性及進(jìn)化樹分析

LvPrx3基因與凡納濱對蝦基因組對應(yīng)核苷酸序列（GenBank 登錄號XR_003477980.1）的相似性達(dá)99%；LvPrx3基因可編碼227個(gè)氨基酸，而基因組對應(yīng)核苷酸序列編碼的氨基酸（ROT83170.1）僅為186個(gè)，兩者的覆蓋率（Coverage）為72%。LvPrx3與報(bào)道的凡納濱對蝦Prx 蛋白序列（ACX53642）的相似性為65%；與Prx4（AET36895）的相似性為57%。同其他物種相比，LvPrx3 與斑節(jié)對蝦（P.monodon，XP_037784347.1）的Prx 相似性最高，為98%；與日本對蝦（Penaeus japonicus，XP_042874112.1）和美國龍蝦（Homarus americanus，XP_042239359.1）的相似性次之，分別為94%和86%；與擬穴青蟹（Scylla paramamosain，ASS34530.1）的相似性為82%。與無脊椎動物日本扇貝（Mizuhopecten yessoensis，OWF43851.1）、蚤狀溞（Daphnia pulex，EFX63892.1）和大型溞（Daphnia magna，KZS17058.1）的相似性分別為75%、75%和70%，與紅樹林鳉（Kryptolebias marmoratus，XP_017259545.1）、虎尾海馬（Hippocampus comes，XP_019737549.1）、長鰭叉尾鮰（Ictalurus furcatus，ADO27790.1）、斑點(diǎn)叉尾鮰（I.punctatus，NP_001188127.1）、黃顙魚（Tachysurus fulvidrac，XP_027030673.1）的相似性分別為74%、72%、72%、72%和68%。

多重序列比對結(jié)果表明，催化三聯(lián)體與過氧化和可溶性Cys結(jié)構(gòu)在所比對物種的Prxs序列中高度保守，但二聚體界面結(jié)構(gòu)和十聚體界面結(jié)構(gòu)在不同物種的序列中有差異。在典型的2-Cys型Prx中，包含兩個(gè)保守且有還原活性的Cys：過氧化Cys和可溶性Cys，且為結(jié)構(gòu)域交疊的同源二聚體?？扇苄訡ys位于C 端，由五個(gè)二聚體按特定規(guī)則形成一個(gè)環(huán)狀十聚體[18-20]。由此推斷，本研究克隆的LvPrx3基因?qū)儆诘湫偷?-Cys 型Prx；同時(shí)結(jié)合Cell-PLoc 2.0 預(yù)測結(jié)果，該基因定位于線粒體中，屬于Prx3亞型（圖2）。

圖2 LvPrx3蛋白的多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of LvPrx3 protein

由Prx 序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，凡納濱對蝦先與同為節(jié)肢動物門甲殼綱的斑節(jié)對蝦聚為一支，再與軟甲綱的擬穴青蟹聚成一小分支；而節(jié)肢動物門切甲亞綱的兩種水溞和軟體動物門雙殼綱日本扇貝聚為一小分支后再與凡納濱對蝦所在分支形成無脊椎動物的兩大分支。Prxs的變化趨勢符合從低等無脊椎動物發(fā)展到高等脊椎動物的進(jìn)化歷程（圖3）。

圖3 LvPrx3基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of LvPrx3 gene

2.3 LvPrx3基因在不同組織中的表達(dá)量

圖4 可見，LvPrx3基因在所有檢測組織中均有不同程度的表達(dá)，在眼柄中表達(dá)量最高，腸道次之，其他4種組織中的表達(dá)量無明顯區(qū)別。

圖4 LvPrx3在不同組織中的相對表達(dá)Fig.4 Expression levels of LvPrx3 gene in different tissues

2.4 LPS刺激及4-NP脅迫后LvPrx基因的表達(dá)量

如圖5(A)所示，LPS 刺激3 h 時(shí)，對蝦眼柄中的LvPrx3表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），6 h時(shí)恢復(fù)到對照組水平（P＞0.05），12～48 h 時(shí)出現(xiàn)長時(shí)間上升（P＜0.05）。在刺激12 h 時(shí)表達(dá)量最大，是對照組的1.79倍。圖5(B)表明，LPS 刺激后凡納濱對蝦腸道中的LvPrx表達(dá)量在3～24 h時(shí)持續(xù)性顯著下調(diào)（P＜0.05），而在LPS刺激48 h時(shí)升至對照組水平（P＞0.05）。

圖5 LPS注射后LvPrx3在蝦眼柄和腸道中的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of LvPrx3 gene in eyestalk and intestine after LPS injection

圖6(A)可見，凡納濱對蝦眼柄中LvPrx3表達(dá)量在4-NP 脅迫后6～24 h 逐漸上調(diào)（P＜0.01），24 h 時(shí)最大，為對照組的4.11倍；脅迫至48 h時(shí)LvPrx3表達(dá)水平的增加量減少，但仍顯著高于對照組（P＜0.05）。圖6(B)表明，凡納濱對蝦腸道中LvPrx3表達(dá)量在脅迫6 h 時(shí)與對照組無明顯區(qū)別（P＞0.05），脅迫12 h時(shí)顯著上升（P＜0.05），24 h 時(shí)降低至對照組水平（P＞0.05），脅迫48 h時(shí)出現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.05）。

圖6 4-NP脅迫下LvPrx3在眼柄和腸道中的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of LvPrx3 gene in eyestalk and intestine under 4-NP stress

3 討論

從凡納濱對蝦中克隆到962 bp 的LvPrx3基因cDNA 全長序列，通過蛋白特異性結(jié)構(gòu)域分析和BLAST 比對，確定其屬于典型的2-Cys Prx，有特異的“FYPLDFTFVCPTE”N 端和“GEVCPA”C 端，與多種物種的Prx 氨基酸序列相似性較高。LvPrx3與先前報(bào)道的凡納濱對蝦Prx（ACX53642）[21-22]和Prx4（AET36895）[13]的相似性分別為65%、57%。這3 個(gè)不同亞型Prx 的序列差異較大，表明它們在對蝦中可能發(fā)揮了不同的生理作用。

通過對LvPrx3的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其不僅有典型的2-Cys Prx 的C 端和N 端，還包含催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，二聚體、十聚體界面，過氧化、可溶性半Cys。其中催化三聯(lián)體與LvPrx3的蛋白酶促反應(yīng)相關(guān)，而過氧化和可溶性Cys 是使LvPrx3蛋白更易與氧化還原信號分子反應(yīng)的調(diào)節(jié)開關(guān)。目前特殊的蛋白結(jié)構(gòu)二聚體界面與十聚體界面的功能尚不明確，但蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)對蛋白質(zhì)的活性有影響，對其表達(dá)和激活有決定性作用。Jang等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生物體內(nèi)過氧化物濃度處于低水平時(shí)，Prx會以單體或二聚體狀態(tài)存在；當(dāng)氧化物濃度處于高水平時(shí)，Prx則折疊成穩(wěn)定的環(huán)狀十聚體結(jié)構(gòu)，作為分子伴侶行使抗氧化功能。另外，對LvPrx3進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)它主要存在于易聚集活性氧的線粒體中，這與Prx的功能相對應(yīng)，與中華絨螯蟹EsPrx3[12]的結(jié)果一致，表明LvPrx3可能具有抗氧化功能。

基因的組織分布和病理相關(guān)表達(dá)量變化與其行使的功能密切相關(guān)[25]。中國明對蝦（F.chinensis）Prx主要在肝胰腺、卵巢和腸道中有較高的表達(dá)量[10]，Prx4則在性腺和肝胰腺中高表達(dá)[26]。脊尾白蝦（E.carinicauda）Prx5在肝胰腺和卵巢中出現(xiàn)高表達(dá)，在眼柄、胃和腸道中低表達(dá)[9]。在斑節(jié)對蝦（P.monodon）中，Prx1主要在腦、腸道、鰓和肌肉中高表達(dá)，而Prx5在肌肉中高表達(dá)，在胃、心臟和鰓中的表達(dá)量逐漸降低[11]。在日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）中，Prx表達(dá)量最高的組織是肝胰腺和鰓，最低的是腸道[27]。中華絨螯蟹（E.sinensis）的4種Prx（Prx、Prx3、Prx4和Prx5）均在肝胰腺中有較高的表達(dá)水平[12]。在擬穴青蟹（Scylla paramamosain）和遠(yuǎn)海梭子蟹（Portunus pelagicus）中，Prx3在肝胰腺中的表達(dá)量最高，肌肉（擬穴青蟹）和性腺（遠(yuǎn)海梭子蟹）中次之[28-29]。中華新米蝦（Neocaridina denticulata sinensis）Prx3在鰓組織中表達(dá)量最高，眼柄中次之，在肝胰腺、性腺和腸道中幾乎無表達(dá)[30]。本研究中，LvPrx3在所檢測的6 個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在眼柄中表達(dá)量最高，腸道中次之?？梢姡煌锓N及不同亞型Prx的表達(dá)具有一定的組織特異性，不同物種各種亞型的Prx主要在特定組織中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究的LvPrx3主要在眼柄和腸道的抗氧化過程中發(fā)揮作用。

Prx是一類重要的過氧化物酶，主要在清除過氧化物，防止過量活性氧（ROS）引起的氧化損傷中起關(guān)鍵作用[7]。甲殼動物Prx在大多數(shù)環(huán)境脅迫和病原體感染過程中均被誘導(dǎo)并發(fā)揮作用[31]。斑節(jié)對蝦（P.monodon）在病原菌[哈維弧菌（Vibrio harveyi）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）]感染、鹽度脅迫、pH 脅迫狀態(tài)下，鰓中Prx5表達(dá)量均一定程度上調(diào)，在重金屬銅和鎘脅迫時(shí)則被顯著抑制[11]。中國明對蝦（F.chinensis）在受到弧菌（Vibrio anguillarum）刺激時(shí)，肝胰腺和血細(xì)胞中的Prx轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)[32]；在對蝦感染白斑綜合征病毒（WSSV）后，Prx4在這兩種組織中mRNA 表達(dá)量顯著升高[26]。在日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）中，Prx6在感染鰻弧菌（V.anguillarum）后被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，通過調(diào)節(jié)過氧化物還原酶活性，提高了對蝦的抗細(xì)菌能力[33]；在感染W(wǎng)SSV后，Prx4被誘導(dǎo)分泌到血淋巴中，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Dorsal 入核，后誘導(dǎo)抗菌肽基因的表達(dá)，抑制WSSV的復(fù)制[34]。脊尾白蝦（E.carinicauda）被鰻弧菌（V.anguillarum）和WSSV 脅迫后，肝胰腺和血細(xì)胞的Prx5表達(dá)量出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)趨勢[9]。擬穴青蟹（S.paramamosain）在受到重金屬鎘脅迫時(shí)Prx表達(dá)量在刺激前期顯著上調(diào)[28]。中華絨螯蟹（E.sinensis）在感染嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的狀態(tài)下，Prx、Prx3、Prx4和Prx5表達(dá)水平均顯著升高[12]。本研究中，經(jīng)LPS刺激后，眼柄和腸道的LvPrx3表達(dá)量表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，眼柄LvPrx3的表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)上調(diào)，腸道LvPrx3表達(dá)水平則被顯著抑制，表明LvPrx3在革蘭陰性菌感染時(shí)，在眼柄中起重要的抗氧化保護(hù)作用，而在腸道中可能不是主要免疫防御因子。4-NP 脅迫結(jié)果顯示，眼柄LvPrx3的表達(dá)量在所有檢測的時(shí)間點(diǎn)被顯著誘導(dǎo)上調(diào)，腸道LvPrx3表達(dá)量在脅迫中期略有上升，在后期被抑制。這些結(jié)果表明LvPrx3在4-NP脅迫時(shí)，在眼柄的抗氧化防御中發(fā)揮重要作用，也參與了腸道的免疫防御。LPS 刺激和4-NP 脅迫后，均可發(fā)現(xiàn)LvPrx3在眼柄中有高度的表達(dá)量，表明LvPrx3主要在眼柄中發(fā)揮抗氧化保護(hù)功能，與LvPrx3在眼柄中基礎(chǔ)表達(dá)量最高的結(jié)果相吻合。

4 結(jié)語

LvPrx3全長cDNA 序列962 bp，ORF 為684 bp，能編碼227個(gè)氨基酸。氨基酸序列推導(dǎo)的蛋白分子質(zhì)量為25.09 ku，pI 為6.22。LvPrx3基因?qū)儆诘湫偷?-Cys Prx，主要定位于線粒體中，包含高度保守的“FYPLDFTDVCPTE”N 端和“GEVCPA”C 端。還具有催化三聯(lián)體、二聚體界面、十聚體界面、過氧化和可溶性半胱氨酸等結(jié)構(gòu)域。LvPrx3 與斑節(jié)對蝦P.monodon的Prx 氨基酸序列相似性最高?；騆vPrx3在凡納濱對蝦所有檢測的組織中均有表達(dá)，在眼柄中表達(dá)量最高，腸道次之。LPS 刺激和4-NP脅迫后，LvPrx3在眼柄的表達(dá)量均顯著上調(diào)，表明LvPrx3主要在眼柄中發(fā)揮抗氧化保護(hù)功能。