pH值對羅非魚肌球蛋白乳化性的影響

張若蘭，周春霞,2，洪鵬志,2，劉喚明,2，劉 璐，馬煥塔，黃曉冰

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034)

肌球蛋白是魚肉中最重要的功能蛋白之一，約占肌肉總蛋白的30%和肌原纖維蛋白的55%，是影響肉制品質(zhì)量最重要的蛋白質(zhì)[1]。肌球蛋白分子由兩條重鏈和四條輕鏈組成，形如“Y”字[2]。肌球蛋白作為兩親性分子，其分子結(jié)構(gòu)中既含有親水性基團(tuán)又含有疏水性基團(tuán)，能夠在O/W 乳液界面形成吸附層，提高空間位阻并防止乳液中油滴聚集[3]。從動力學(xué)角度分析，蛋白質(zhì)在油水界面達(dá)到穩(wěn)定的過程有以下三個(gè)步驟：1）蛋白質(zhì)擴(kuò)散至油-水界面附近；2）蛋白質(zhì)吸附到油-水界面，分子結(jié)構(gòu)展開；3）界面上的蛋白質(zhì)重排形成緊密的界面蛋白膜[4]。物理化學(xué)處理導(dǎo)致肌球蛋白構(gòu)象的微小變化會極大地影響其乳化性[5]，而調(diào)節(jié)溶液pH 值是一種使蛋白質(zhì)變性和展開的常用方法[6]。不同pH 值可通過改變肌球蛋白的質(zhì)子化程度和表面電荷來改變肌球蛋白的結(jié)構(gòu)[7]。在極端酸性或堿性條件下，肌球蛋白棒狀尾部發(fā)生完全解離或部分解離，頭部構(gòu)象發(fā)生顯著變化，使其呈現(xiàn)“熔球態(tài)”[8]。不同的pH 值條件下肌球蛋白構(gòu)象明顯不同，調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH 值可達(dá)到改變肌球蛋白功能特性的目的[9]。肌球蛋白經(jīng)酸堿處理后，在靜電斥力的作用下分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和殘基[7]，可更好地吸附在油滴表面，形成致密的界面膜，并提供一定的空間位阻防止油滴的聚集[4]。L-精氨酸輔助超聲處理能導(dǎo)致肌球蛋白分子展開，分子柔韌性增強(qiáng)，使其更易吸附在油水界面處，提高乳液的物理穩(wěn)定性[10]。近年來，乳液在功能性食品中作為遞送系統(tǒng)受到廣泛關(guān)注。魚肌原纖維蛋白已被證實(shí)可作為乳液的天然乳化劑[11]，肌球蛋白作為肌原纖維蛋白的主要成分，但是其乳化性質(zhì)的研究相對較少，且主要集中在鱈(Gadus morhua)[12]、花鰱（Aristichthys nobilis)[10]等。我國作為羅非魚生產(chǎn)第一大國，2020 年羅非魚淡水養(yǎng)殖高達(dá)165 萬t[13]，羅非魚可提供豐富的蛋白資源。因此，本研究以羅非魚肌球蛋白為研究對象，研究pH 值對肌球蛋白乳化穩(wěn)定性及界面蛋白組成和結(jié)構(gòu)的影響，以期為為羅非魚肌球蛋白在食品工業(yè)中的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羅非魚，購于廣東省湛江市湖光市場，取其背部白肉，分裝，于-18 ℃貯藏備用。氯化鈉、氯化鉀、六水合氯化鎂、硫酸銨、乙二胺四乙酸二鈉：分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。5-腺苷三磷酸二鈉鹽（ATP）、二硫蘇糖醇（DTT）、馬來酸，購自廣州齊云生物科技有限公司。乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）：分析純，購自上海源葉生物科技有限公司。快速Lowry 法蛋白含量測定試劑盒，購自上海荔達(dá)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti-J-26 sxp 型高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼公司；UV757 紫外分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；IKA T-18 均質(zhì)分散機(jī)，東南科儀器有限公司；AH-NANO 超高壓納米均質(zhì)機(jī)，加拿大ATS儀器公司；NanoBrook Omni 激光粒度及Zeta 電位儀，美國布魯克海文儀器公司；Chirascan V100 圓二色譜儀，熒光應(yīng)用光物理公司；FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌球蛋白的提取 肌球蛋白的提取參考周春霞等[14]的方法。提取后的蛋白保存于4 ℃條件下，并于72 h內(nèi)使用。肌球蛋白濃度采用Lowry法試劑盒檢測，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)和凝膠成像系統(tǒng)計(jì)算蛋白質(zhì)純度高于86%。

將提取的肌球蛋白用透析液（20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，0.6 mol/L NaCl）稀釋為10 mg/mL。使用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl分別調(diào)節(jié)pH 值至2.0、5.0、7.0和11.0，用于乳化活性檢測及乳液制備實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 乳化活性指數(shù)(Emulsifying Activity Index,IEA)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(Emulsion stability Index,IES)的測定 參考Lin等[15]的方法并修改，通過濁度法測定肌球蛋白的乳化活性指數(shù)與乳化穩(wěn)定性指數(shù)。分別取不同pH 值的肌球蛋白溶液（6 mL）與2 mL 大豆油于50 mL的塑料量杯中，在12 000 r/min條件下均質(zhì)1 min，立即取新鮮制備的乳液20 μL 并分散在4 mL 含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的SDS 溶液中。迅速讀取500 nm 處的光密度，記為D0。樣品靜置10 min 后，在相同位置再次取樣20 μL，重復(fù)上述步驟將光密度記為D10。乳化活性指數(shù)IEA（單位為m2/g）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)IES（單位為min）分別按下列公式計(jì)算：

其中，D0為樣品初始光密度值；D10為樣品放置10 min后的光密度值；N為稀釋倍數(shù)，N=200；C為蛋白質(zhì)量濃度，C=5.0 g/mL；φ為油相比例，φ=0.2；Δt=10 min。

1.3.3 肌球蛋白-大豆油乳液的制備 準(zhǔn)確量取180 mL上述不同pH 值的肌球蛋白溶液（10 mg/mL），分別加入20 g 大豆油，于10 000 r/min 的條件下均質(zhì)分散1 min 形成粗乳，然后通過高壓均質(zhì)（60 MPa，循環(huán)4 次，4 ℃）制備肌球蛋白-大豆油乳液，分裝，于4 ℃貯藏。

1.3.4 乳液粒徑和電位的檢測 參考陳艾霖等[16]的方法并稍作修改。為避免多重散射，將新鮮制備的乳液使用相應(yīng)pH 的緩沖溶液（20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，0.6 mol/L NaCl）稀釋500 倍，通過動態(tài)光散射分析乳液平均粒徑。乳液和水的反射系數(shù)分別設(shè)置為1.46 和1.33，在25 ℃的條件下進(jìn)行測量。樣品平衡時(shí)間為120 s。

上述同樣的樣品用相應(yīng)pH 值蒸餾水稀釋200倍，使用Nano Brook Omni激光粒度及Zeta電位儀在25 ℃下測量Zeta-電位值。樣品平衡時(shí)間為120 s。

1.3.5 乳析指數(shù)(Creaming Index,IC)的測定 參考Shi等[10]的方法，將均質(zhì)后的乳液立即轉(zhuǎn)移到樣品瓶（內(nèi)徑2 cm，高7 cm）中，并放置于4 ℃冰箱內(nèi)。拍照記錄乳液制備7 d內(nèi)分層情況。乳析指數(shù)計(jì)算如下：

其中，Ht為乳液的總高度，Hs為底部上清液的高度。

1.3.6 乳液微觀結(jié)構(gòu)的觀察 分別采用光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)。將乳液稀釋10倍，并吸取10 μL置于載玻片上，蓋上蓋玻片，使用40 倍物鏡的光學(xué)顯微鏡觀察并拍照[17]。另取10 μL 乳液，同時(shí)加入10 μL 尼羅紅染液和20 μL尼羅藍(lán)染液，避光反應(yīng)15 min，隨后吸取10 μL 置于載玻片上，蓋上蓋玻片并排除起泡，置于100倍油鏡下使用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察并拍照，其中激發(fā)波長為633 nm和488 nm，拍照分辨率為1 024×1 024[3]。

1.3.7 界面吸附蛋白的組成分析 參考Li 等[18]的方法并稍作修改，取不同pH值乳液離心（10 000 r/min，30 min），取上層乳析層，加入4 倍體積相應(yīng)pH 值磷酸鹽緩沖溶液，混勻，調(diào)節(jié)蛋白濃度至1 mg/mL，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。蛋白溶液分別與上樣緩沖液1∶1 混合，煮沸4 min，每孔進(jìn)樣10 μg，凝膠電泳于恒壓下（濃縮膠中為80 V，分離膠中為120 V）進(jìn)行。制備好的凝膠，用染色液在室溫下染色1 h，然后用蒸餾水進(jìn)行脫色，直到出現(xiàn)清晰的條帶。

1.3.8 界面蛋白的解吸 參考Li等[4]的方法，使用吐溫-20 通過競爭吸附的方法解吸出油滴表面的肌球蛋白，研究界面蛋白的變化。取20 g 乳液，超速離心（20 000 ×g，1 h，4 ℃）分離乳化層。收集乳化層并用去離子水清洗兩次。隨后將清洗后的乳化層與磷酸鹽緩沖溶液（含體積分?jǐn)?shù)2%的吐溫20）充分混合，使吐溫20 充分置換油滴表面的肌球蛋白，再次離心（20 000×g，1 h，4 ℃），下層清液即為界面吸附蛋白溶液。

1.3.9 二級結(jié)構(gòu)的測定 參考Wu 等[19]的方法，將肌球蛋白乳液以及解吸后的界面蛋白用對應(yīng)pH 值的緩沖液稀釋至0.1 mg/mL，進(jìn)行圓二色譜（circular dichroism，CD）掃描。波長范圍為190～260 nm，上樣量0.2 mL，測定分辨率0.5 mm，掃描速度為100 nm/min，靈敏度為0.02°，響應(yīng)時(shí)間為0.25 s，以緩沖溶液做空白，實(shí)驗(yàn)值為三次掃描的均值。二級結(jié)構(gòu)含量使用CDNN軟件計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)使用Origin 2018 軟件作圖，數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），并通過Duncan 法檢驗(yàn)平均值間的顯著性，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值對肌球蛋白乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)的影響

IEA通過單位質(zhì)量所能穩(wěn)定的油水界面面積來表征蛋白質(zhì)乳化能力，可以反映蛋白質(zhì)在界面處的吸附能力[4]。IES與蛋白質(zhì)在一定時(shí)間內(nèi)保持乳液物理穩(wěn)定性有關(guān)，可以反映蛋白質(zhì)抵抗不穩(wěn)定性如聚集、絮凝等能力[10]。肌球蛋白在不同pH值條件下的IEA和IES結(jié)果（圖1）顯示，當(dāng)pH 5.0（肌球蛋白的等電點(diǎn)附近）時(shí)，肌球蛋白的IEA和IES值最小，因?yàn)榇藭r(shí)肌球蛋白表面電荷量少，靜電斥力的減小使乳液中的蛋白質(zhì)絮凝、聚集，導(dǎo)致乳化性降低。等電點(diǎn)附近的低溶解度降低蛋白質(zhì)在油水界面的吸附能力，從而降低蛋白質(zhì)的乳化性能[20]。而當(dāng)pH 值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)后，肌球蛋白表面靜電荷含量增加，使蛋白質(zhì)的溶解性增加，提高肌球蛋白的IEA和IES值，隨著酸堿度的增加，在電荷排斥的作用下肌球蛋白分子逐漸展開，氨基酸殘基中的疏水基團(tuán)靠近油相，親水基團(tuán)靠近水，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開后，與油滴之間的相互作用增強(qiáng)，提高乳化活性[21]。

圖1 pH值對羅非魚肌球蛋白IEA和IES的影響Fig.1 Effect of pH value on the IEA and IES of tilapia myosin

2.2 pH值對肌球蛋白乳液平均粒徑及電位的影響

乳液平均粒徑的大小可以反映蛋白質(zhì)的乳化能力[22]，乳液粒徑越小，乳化能力越強(qiáng)。不同pH 值條件下制備的肌球蛋白-大豆油乳液，其平均粒徑結(jié)果見圖2。在不同pH 值條件下，新鮮制備的乳液粒徑大小有顯著性差異。在pH 5.0 時(shí)，肌球蛋白乳液粒徑最大，乳液穩(wěn)定性差；當(dāng)pH 值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，乳液粒徑減?。≒＜0.05）。蛋白乳液的穩(wěn)定主要由蛋白質(zhì)提供的空間位阻和液滴之間的靜電斥力決定[23]。在等電點(diǎn)附近，肌球蛋白分子表面靜電荷接近于零，靜電斥力下降使肌球蛋白分子之間發(fā)生疏水聚集，與油滴的結(jié)合位點(diǎn)減少，蛋白在油滴表面的吸附能力弱，不能形成致密、穩(wěn)定的界面膜來提供足夠的空間位阻使乳液液滴分散。當(dāng)pH 值遠(yuǎn)離肌球蛋白等電點(diǎn)時(shí)，肌球蛋白開始失去大部分的側(cè)鏈連接，形成“熔融球體”[8]，溶解度增加，可迅速擴(kuò)散到油-水界面形成界面膜[24]，且蛋白吸附能力強(qiáng)，可形成穩(wěn)定的乳液。

圖2 pH值對羅非魚肌球蛋白-大豆油乳液粒徑和Zeta-電位的影響Fig.2 Effect of pH value on particle size and Zeta-potential of tilapia myosin-soybean oil emulsion

Zeta 電位是表征蛋白質(zhì)表面電荷量的直接指標(biāo)[11]。在O/W 乳液中，乳液液滴所帶的電荷來自于覆蓋在油滴表面的蛋白質(zhì)，電位絕對值越大表示液滴之間靜電斥力越大，乳液液滴之間越分散[25]。圖2顯示，隨著pH 值的增加，電位絕對值呈現(xiàn)“V”字型趨勢。pH 2.0 時(shí)，肌球蛋白乳液帶正電荷；當(dāng)pH 5.0時(shí)，乳液電位絕對值最??；而當(dāng)pH 值增加至7.0 與11.0時(shí)，乳液帶負(fù)電荷。在pH 5.0時(shí)，肌球蛋白分子間靜電斥力小，蛋白分子間因疏水相互作用而發(fā)生聚集，表面疏水性降低，乳液的平均粒徑最大。當(dāng)pH 值處于極端條件時(shí)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生解離、展開和重排，蛋白質(zhì)的表面凈電荷增加，液滴之間的靜電斥力增大，抑制蛋白質(zhì)分子的聚集，形成的乳液粒徑小[26]。在pH 值為2.0、7.0 和11.0 時(shí)，肌球蛋白在油-水界面的吸附能力較強(qiáng)，能形成良好的界面膜，并且可提供穩(wěn)定乳液的靜電斥力。

2.3 pH值對肌球蛋白乳液貯藏穩(wěn)定性的影響

乳液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，隨著貯藏時(shí)間的延長，乳液體系中顆粒運(yùn)動加快，使油-水界面處吸附的肌球蛋白分子發(fā)生重排或脫落，從而改變了其界面結(jié)構(gòu)。圖3(a)顯示pH 值對肌球蛋白乳液貯藏期時(shí)粒徑變化情況。4 ℃下貯藏7 d，四種肌球蛋白乳液粒徑均顯著增大。極端pH 值條件下的肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，表面疏水性增加，有利于促進(jìn)界面處蛋白質(zhì)吸附至油滴[5]，使其穩(wěn)定的乳液在儲藏期粒徑變化小，不發(fā)生分層。由于布朗運(yùn)動、重力等因素的影響，乳液中的液滴處于連續(xù)運(yùn)動狀態(tài)并相互碰撞[10]。較大顆粒的液滴比較小的液滴移動速率更快，液滴間相互碰撞的機(jī)率增加，更容易發(fā)生聚集現(xiàn)象，因此，pH 5.0條件的乳液平均粒徑增長明顯。

乳液在貯藏過程中，可以通過記錄乳析指數(shù)的變化來表征乳液的乳化穩(wěn)定性[27]。乳析指數(shù)越小乳液越穩(wěn)定。由圖3(b)可見，4 ℃下貯藏7 d，只有pH 5.0條件下的肌球蛋白乳液出現(xiàn)分層，且隨著貯藏時(shí)間的增加，乳析指數(shù)增大。由圖3(c)也可看出，新鮮制備的肌球蛋白乳液都呈現(xiàn)均勻的白色，在貯藏過程中，pH 5.0 條件下的肌球蛋白乳液發(fā)生明顯的分層，上層為白色的乳析層，下層為透明的水層。乳液的長期穩(wěn)定性主要依賴于油水界面吸附蛋白膜的強(qiáng)度與厚度[28]。肌球蛋白在油滴上的吸附是可逆的[3]，隨著貯藏時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)聚集增加會導(dǎo)致無法形成良好的界面膜包裹油滴[11]。當(dāng)肌球蛋白體系pH 值處于遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，其穩(wěn)定的乳液貯藏穩(wěn)定性良好，在7 d 內(nèi)不會發(fā)生分層現(xiàn)象。這一結(jié)果表明，在pH 2.0、7.0 和11.0 時(shí)，肌球蛋白在油-水界面的吸附能力強(qiáng)，可形成致密的界面膜防止液滴的聚集，并且在較大的靜電斥力作用下，乳液貯藏穩(wěn)定性得到進(jìn)一步提高。

圖3 不同pH值條件下羅非魚肌球蛋白-大豆油乳液貯藏過程中粒徑、乳析指數(shù)及樣品的變化Fig.3 Changes in particle size,creaming index and sample of tilapia myosin-soybean oil emulsions during storage under different pH values

2.4 pH值對肌球蛋白乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4 顯示，不同pH 值條件下的乳液液滴直徑不同。pH 5.0時(shí)乳液發(fā)生明顯聚集，且聚集體較大，分布廣泛，與粒徑和Zeta-電位檢測結(jié)果一致；pH 2.0時(shí)乳液有部分聚集；當(dāng)pH值大于等電點(diǎn)時(shí)，乳液的光學(xué)顯微鏡圖顯示乳液液滴呈現(xiàn)球狀且分布均勻，無明顯的液滴聚集的情況。在pH 7.0與pH 11.0時(shí)，油滴被肌球蛋白完全包裹并均勻分布以形成穩(wěn)定的乳液，與粒徑檢測結(jié)果一致。

激光共聚焦顯微鏡(CLSM)可用于肌球蛋白乳液中油滴（紅色）和蛋白質(zhì)（綠色）分布的可視化[5]。從圖4 中可發(fā)現(xiàn)大小不同的油滴分布在水相中，油滴表面被肌球蛋白包圍。在pH 5.0 條件下的乳液液滴聚集明顯，此時(shí)肌球蛋白間靜電斥力小，形成較大的蛋白質(zhì)聚集體，不能很好包裹油滴使其分散。在pH 7.0、2.0 和11.0 條件下，肌球蛋白分子部分展開，與油滴結(jié)合緊密，乳液液滴均勻且尺寸更小，表明蛋白質(zhì)能夠快速吸附在油-水界面形成完整的界面膜，有效防止液滴的聚集從而形成更小的液滴[29]，蛋白質(zhì)的相互作用可以形成多層蛋白質(zhì)吸附，并在油滴之間產(chǎn)生強(qiáng)大的空間位阻，從而提高乳液的穩(wěn)定性[30]。

圖4 pH值對羅非魚肌球蛋白-大豆油乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of pH value on the microstructure of tilapia myosin-soybean oil emulsion

2.5 pH值對肌球蛋白乳液界面蛋白組成的影響

通過SDS-PAGE 分析吸附在油-水界面的蛋白質(zhì)組成，結(jié)果如圖5 所示。未經(jīng)處理的肌球蛋白在220 ku 附近顯示明顯的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）條帶，在30 ku 附近有一條輕微的原肌球蛋白條帶，在15～22 ku 附近顯示肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，LHC）條帶。乳液界面吸附肌球蛋白主要包括MHC 和LHC。但與未經(jīng)處理的肌球蛋白相比，不同pH 值條件下肌球蛋白乳液體系中界面蛋白的MHC 和LHC 條帶顏色和寬度均有所變化。蛋白質(zhì)發(fā)生降解主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)條帶的模糊、弱化和擴(kuò)展[17]，這表明pH 值的變化及高壓均質(zhì)乳化等可能對蛋白質(zhì)的交聯(lián)降解有影響。在pH 11.0 時(shí)，乳液的穩(wěn)定性較好，經(jīng)離心后沒有分離出明顯的乳析層，導(dǎo)致此時(shí)的電泳條帶顏色較淺；而在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，肌球蛋白分子展開受到抑制，不利于界面蛋白膜的形成[31]，此時(shí)蛋白質(zhì)分子間靜電斥力最小，蛋白質(zhì)包裹的油滴相互靠近并發(fā)生聚集，導(dǎo)致肌球蛋白發(fā)生聚集和沉淀，電泳條帶變窄，與粒徑檢測結(jié)果一致。油滴表面的界面蛋白膜由肌球蛋白構(gòu)成，因此，肌球蛋白發(fā)生交聯(lián)會使此條件下的蛋白乳液穩(wěn)定性下降，可能發(fā)生分層等情況。

圖5 pH值對羅非魚肌球蛋白-大豆油乳液界面蛋白組成的影響Fig.5 Effect of pH value on the interfacial protein composition of tilapia myosin-soybean oil emulsion

2.6 pH值對乳液及界面肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步了解乳液及界面肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其與乳液穩(wěn)定性的關(guān)系，使用CD 光譜分析不同pH 值肌球蛋白乳液中界面蛋白的二級結(jié)構(gòu)。肌球蛋白棒狀尾部95%是由α-螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，肌球蛋白α-螺旋含量的變化可反映桿狀尾部的結(jié)構(gòu)[32]。由圖6 可見，未經(jīng)處理的肌球蛋白CD 光譜在208 nm和222 nm 處有兩個(gè)明顯的負(fù)峰，這是α-螺旋的特征峰[33]。經(jīng)計(jì)算可得，未處理的羅非魚肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)包括67.93% 的α-螺旋、3.53% 的β-折疊、12.60%的β-轉(zhuǎn)角和13.63%的無規(guī)則卷曲。魚的種類不同，其肌球蛋白含量也有所變化。大眼金槍魚(Thunnus obesus)的肌球蛋白含有65%的α-螺旋結(jié)構(gòu)，而明太魚(Gadus chalcogrammus)肌球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量僅為38%[32]。Liu 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，pH 值對肌球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的影響主要是通過改變蛋白質(zhì)分子帶電氨基酸和表面的α-羥基及α-氨基末端的質(zhì)子化程度來實(shí)現(xiàn)。CD 光譜顯示乳液穩(wěn)定性與α-螺旋含量呈正相關(guān)[19]。α-螺旋結(jié)構(gòu)在油滴表面的暴露有利于蛋白質(zhì)和油滴之間形成較強(qiáng)的相互作用，較高含量的β-折疊表明相鄰蛋白質(zhì)分子之間有更多的交聯(lián)，形成蛋白質(zhì)界面層，為乳液提供一定的空間位阻，體系的穩(wěn)定性增強(qiáng)，但是當(dāng)β-折疊結(jié)構(gòu)含量過高時(shí)，最外層的蛋白質(zhì)可能會表現(xiàn)出一些聚集，從而導(dǎo)致乳液液滴的不穩(wěn)定[4]。

圖6 不同pH值條件下肌球蛋白在乳液（a）與界面吸附（b）狀態(tài)下的CD光譜Fig.6 CD spectra of myosin in emulsion(a)and interface adsorption(b)states at different pH values

與未經(jīng)處理的羅非魚肌球蛋白（對照組）相比，乳液狀態(tài)和界面吸附狀態(tài)下肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量變化趨勢一致，即α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著下降，表明高壓均質(zhì)制備乳液過程中的強(qiáng)烈剪切、撞擊和空穴作用等可能使肌球蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)部分被破壞。表1顯示，在pH 7.0時(shí)，乳液肌球蛋白的α-螺旋質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（54.90±2.56）%，遠(yuǎn)離中性pH值條件時(shí)，界面肌球蛋白α-螺旋含量均顯著下降。由于肌球蛋白尾部對酸性pH 環(huán)境敏感，因此，在pH 2.0 和pH 5.0時(shí)，肌球蛋白尾部螺旋結(jié)構(gòu)解離，易形成β-折疊結(jié)構(gòu)[35]，較高的β-折疊結(jié)構(gòu)含量可能使蛋白質(zhì)分子在界面發(fā)生聚集，影響乳液的穩(wěn)定性，且pH 5.0時(shí)，肌球蛋白分子表面凈電荷接近于零，分子間靜電斥力的下降使肌球蛋白發(fā)生疏水聚集，故該條件下肌球蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性最差。與酸性處理相比，肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)在堿性pH 條件下的變化較小[32]。pH 11.0 時(shí)，肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，表面疏水性增強(qiáng)，疏水基團(tuán)的暴露有利于蛋白質(zhì)分子吸附在油滴表面，提高肌球蛋白的乳化性，且此時(shí)β-折疊結(jié)構(gòu)含量的適當(dāng)增加有利于蛋白質(zhì)間的相互作用，能提供一定的空間位阻穩(wěn)定乳液，提高乳液貯藏穩(wěn)定性。

表1 pH值對肌球蛋白在乳液與界面吸附狀態(tài)下的二級結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 1 Effect of pH value on the secondary structure content of myosin in emulsion and interface adsorpotion states %

3 結(jié)論

pH 值的變化會顯著影響肌球蛋白的乳化活性及乳液的穩(wěn)定性。當(dāng)pH 值為7.0 時(shí)，肌球蛋白經(jīng)高壓均質(zhì)處理后二級結(jié)構(gòu)變化較小，蛋白質(zhì)分子完全包裹油滴并均勻分布，乳液貯藏7 d 不分層。當(dāng)pH值接近肌球蛋白等電點(diǎn)（pH 5.0）時(shí)，分子間靜電斥力小，蛋白質(zhì)分子在油-水界面發(fā)生聚集，未形成完整的界面膜，乳液液滴聚集，乳液穩(wěn)定性差。而在極端pH 值（2.0 和11.0）條件下，肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)部分展開，蛋白質(zhì)分子和油滴之間的相互作用增強(qiáng)，在油滴表面形成穩(wěn)定的界面蛋白膜，乳液穩(wěn)定性提高。且當(dāng)pH 值為11.0時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)含量的適當(dāng)增加更有利于蛋白質(zhì)分子間的相互作用，提供一定的空間位阻使乳液更加穩(wěn)定。因此，pH值的調(diào)節(jié)能改變肌球蛋白的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善其乳化性。