五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、抗氧化、非特異性免疫及腸道結(jié)構(gòu)的影響

陳嘉聲，韋宏杰，楊奇慧，譚北平，陳宇航，林華杏

（1.廣東海洋大學(xué)/水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025；2.廣東德寧水產(chǎn)科技有限公司，廣東 佛山 528399）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）生長(zhǎng)快，抗逆性強(qiáng)，養(yǎng)殖效益高，是我國(guó)廣受歡迎的海水養(yǎng)殖對(duì)象之一[1-2]。隨著對(duì)高產(chǎn)量的追求，對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖疾病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)不斷增大，病害問(wèn)題隨之成為制約對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[3]。因此，尋找新型免疫增強(qiáng)劑成為飼料業(yè)的研究熱點(diǎn)[4]。

五倍子（Galla chinensis,GC）主要由五倍子蚜寄生在漆樹(shù)科植物上產(chǎn)生的蟲(chóng)癭形成，其活性成分由鞣質(zhì)（又稱單寧酸或鞣酸）及沒(méi)食子酸組成[5]，有提高機(jī)體抗氧化能力[6-7]和抗菌抑菌[8]的作用。近年來(lái)，五倍子在畜禽飼料中已得到廣泛應(yīng)用，可有效提高養(yǎng)殖畜禽的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力及腸道消化酶活性[9-11]。在水產(chǎn)動(dòng)物上亦有報(bào)道，五倍子水提取物可抑制凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的繁殖[12]；五倍子可提高奧尼羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂）[13]的生長(zhǎng)性能，促進(jìn)鳙（Aristichthys nobilis）腸道消化酶的分泌，并改善腸道黏膜結(jié)構(gòu)[14]，有效提高草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）的免疫能力[15]。但有關(guān)五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、非特異性免疫和抗氧化指標(biāo)及腸道組織結(jié)構(gòu)的影響鮮有報(bào)道。本研究分析五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼體生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、肝胰腺抗氧化、非特異性免疫能力及腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，為五倍子在對(duì)蝦配合飼料中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

基礎(chǔ)飼料主要以魚(yú)粉和豆粕等為主要蛋白源，以魚(yú)油等為脂肪源。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%的五倍子效果較好，因此在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.0%（對(duì)照）、0.02%（GC2）和0.04%（GC4）的五倍子（表1），配制成3組等氮等脂實(shí)驗(yàn)飼料。各飼料原料粉碎過(guò)孔徑180 μm 的篩，微量成分采取逐級(jí)擴(kuò)大法添加，利用V 型混合機(jī)（M-256，華南理工大學(xué)），與大宗原料混勻后，再與魚(yú)油和水充分混勻。用雙螺桿制粒機(jī)（F-75，華南理工大學(xué)）擠壓成1.0 mm 和1.5 mm 兩種粒徑的顆粒飼料，經(jīng)后熟化、風(fēng)干后密封放入-20 ℃冰箱中備用。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient level of experimental feed(dry matter basis) %

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)生物研究基地進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前用對(duì)照組飼料投喂1 周。選取健康、規(guī)格整齊[(0.40±0.00)g]的幼蝦480尾，隨機(jī)放入12只0.3 m3桶（3 組，每組4 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)40 尾），分別投喂相應(yīng)飼料8 周。初次日投喂量為對(duì)蝦幼體體質(zhì)量的10%，每天7:00、11:00、17:00、21:00 定量投喂，投喂量根據(jù)飼料實(shí)際消耗量調(diào)整。實(shí)驗(yàn)期間每天早上投料前換水1/3，維持水體溫度為(30.5±0.8)℃，溶氧不低于6 mg/L，鹽度為29～31，氨氮不高于0.02 mg/L，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度不高于0.10 mg/L，pH 7.5～8.0。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停飼對(duì)蝦24 h。對(duì)各桶進(jìn)行計(jì)數(shù)、稱質(zhì)量，計(jì)算存活率（Survival rate，SR，%）、增重率（Weight gain rate，WGR，%）、特定生長(zhǎng)率（Specific growth rate，SGR，%/d）、飼料系數(shù)（Feed conversion ratio，F(xiàn)CR）等生長(zhǎng)性能指標(biāo)。

式中，Nt和N0分別為終末和初始對(duì)蝦數(shù)量；mt和m0分別為終末和初始對(duì)蝦總體質(zhì)量(g)；t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間（d）。

每桶隨機(jī)取蝦25 尾，5 尾對(duì)蝦用于全蝦體成分分析，即水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量測(cè)定；取對(duì)蝦10 尾，從圍心腔采血，室溫下靜置4 h，離心（3 500 r/min，10 min），取上層血清，儲(chǔ)存于-80 ℃待用，用于血清生化指標(biāo)測(cè)定；取4尾對(duì)蝦腸道固定在40 g/L多聚甲醛中，用于制備H.E染色切片。其余對(duì)蝦迅速取出肝胰腺組織，置于-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

全蝦常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分參照文獻(xiàn)[16]檢測(cè)，水分測(cè)定使用105 ℃常壓干燥法(GB5009.4-2016)，粗蛋白含量測(cè)定采用杜馬斯定氮儀檢測(cè)（GB5009.5-2016)，粗脂肪測(cè)定使用乙醚抽提法（GB5009.6-2016)，粗灰分測(cè)定使用550 ℃灼燒法（GB5009.4-2016)。血清總蛋白（TP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）；肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）活性及總抗氧化能力（T-AOC）參照南京建成生物工程研究所的試劑盒方法改進(jìn)。

用DS-Ri2（Nikon，日本）對(duì)腸道組織染色切片進(jìn)行觀察和拍照，并通過(guò)NIS-Elements D（Version 4.3，Nikon，日本）測(cè)量腸壁厚度和絨毛高度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS（Version 20.0，IBM，美國(guó)）分析數(shù)據(jù)，組間差異分析采用單因素方差分析（oneway ANOVA），如各處理間有顯著差異(P ＜0.05)，則進(jìn)行鄧肯氏多重檢驗(yàn)（Duncan's multiple range test），結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果分析

2.1 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

GC 添加組凡納濱對(duì)蝦WGR 和SGR 均顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)，且FCR 均顯著低于對(duì)照組(P ＜0.05)（表2）。

表2 飼料中添加五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of dietary GC supplementation on growth performance for Litopenaeus vannamei

2.2 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分的影響

GC 添加組凡納濱對(duì)蝦體蛋白質(zhì)均顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05），添加GC 對(duì)對(duì)蝦全體水分、粗脂肪及粗灰分均無(wú)顯著影響（P ＞0.05）（表3）。

表3 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦全蝦體成分的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 3 Effects of dietary GC on body composition for Litopenaeus vannamei(dry matter basis) %

2.3 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響

GC添加組凡納濱對(duì)蝦的血清TP含量顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05）；GC4 組血清TG 含量顯著低于對(duì)照組，而GC2 組則與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）；GC 添加組的血清TC 含量、AST 及ALT 活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P ＞0.05）（表4）。

表4 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary GC on serum biochemical indices for Litopenaeus vannamei

2.4 飼料中添加五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺抗氧化、非特異性免疫能力的影響

飼料中添加GC 對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺抗氧化指標(biāo)影響顯著。對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺SOD 及CAT 活性均顯著低于添加組（P ＜0.05），且添加組間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）；對(duì)照組的肝胰腺T-AOC顯著低于GC添加組（P ＜0.05），且GC2組顯著高于其余兩組（P ＜0.05）(表5)。

表5 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺抗氧化及非特異性免疫的影響Table 5 Effects of dietary GC on antioxidant capacity and non-specific immune-enzyme activities of hepatopancreas for Litopenaeus vannamei

飼料中添加GC 可顯著提高凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫酶活性（P ＜0.05），GC 添加組肝胰腺ACP 及LZM 活性顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05），且添加組間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）；對(duì)照組肝胰腺AKP 活性顯著低于GC 添加組，其中GC2 組活性最高且顯著高于其余兩組（P ＜0.05）（表5）。

2.5 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道結(jié)構(gòu)的影響

飼料中添加GC 顯著改善了凡納濱對(duì)蝦全腸結(jié)構(gòu)（P ＜0.05），GC4組腸壁厚度（IWT）顯著高于對(duì)照組和GC2 組（P ＜0.05）；對(duì)照組絨毛高度（VH）顯著低于GC2 組和GC4 組，且添加組間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）（表6）。圖1亦有類似結(jié)果。

表6 五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦全腸結(jié)構(gòu)的影響Table 6 Effects of dietary GC on intestinal morphology for Litopenaeus vannamei μm

圖1 飼料中添加五倍子對(duì)凡納濱對(duì)蝦全腸結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of dietary GC supplementation on intestinal structure for Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1 五倍子對(duì)對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和體成分的影響

在飼料中添加適量五倍子可改善動(dòng)物生長(zhǎng)狀況和提高飼料轉(zhuǎn)化利用率[17]。珍珠龍膽石斑魚(yú)（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的五倍子可顯著提高其終末體質(zhì)量（FBW）、WGR 和SGR，顯著降低FCR[18]。奧尼羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂)飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.04%五倍子顯著提高了FBW、WGR 和SGR[19]。飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%五倍子提取物顯著提高了斷奶仔豬的平均日增重[10]。本研究中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.04%五倍子顯著提高了凡納濱對(duì)蝦的FBW、WGR和SGR，顯著降低FCR，且GC2 和GC4 組的凡納濱對(duì)蝦FBW、WGR、SGR 及FCR 無(wú)顯著差異，表明添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.04%五倍子對(duì)對(duì)蝦生長(zhǎng)無(wú)不良影響。其原因可能是，五倍子對(duì)腸道的收斂作用使食糜在腸道中的停留時(shí)間更長(zhǎng)，進(jìn)而提高了飼料的利用效率，改善了生長(zhǎng)性能[17]。

體組成是評(píng)價(jià)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況和健康的重要指標(biāo)之一[19]。水產(chǎn)動(dòng)物飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%的栗木單寧可顯著降低其粗脂肪含量，而對(duì)水分、粗蛋白和粗灰分則未產(chǎn)生影響[20]。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～2%縮合單寧對(duì)日本花鱸（Lateolabrax japonicus）體成分影響不顯著[21]。單寧是五倍子中重要活性物質(zhì)，本研究中，添加五倍子可顯著提高對(duì)蝦粗蛋白含量，與文獻(xiàn)[19-20]不一致，可能與研究物種和單寧含量不同有關(guān)。

3.2 五倍子對(duì)對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可反映動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝功能及健康狀況[22]。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.16%五倍子顯著提高了羅非魚(yú)血清血紅蛋白含量[13]。五倍子提取物可顯著降低高脂肪膳食飼喂大鼠的TC 和TG含量[23]。攝食補(bǔ)充五倍子提取物的肉雞肝臟中TC含量降低約12%[22]。飼喂五倍子提取物可顯著提高仔豬血清TP 含量[25-26]。本研究表明，飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.04%五倍子顯著提高了對(duì)蝦血清TP 含量，降低了血清TG 含量，與上述結(jié)果相似，表明五倍子提高了對(duì)蝦對(duì)蛋白質(zhì)的利用和脂質(zhì)的代謝。AST 與ALT 活性是衡量機(jī)體氨基酸代謝水平的重要指標(biāo)，正常機(jī)體血清轉(zhuǎn)氨酶活性會(huì)維持在較低的水平，當(dāng)肝功能異常時(shí)AST 和ALT 活性會(huì)顯著提高[27-28]。本研究表明，添加五倍子對(duì)血清AST 和ALT 活性影響不顯著，表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%和0.4%五倍子不會(huì)對(duì)對(duì)蝦肝胰腺產(chǎn)生損傷，添加量在合理范圍內(nèi)。

3.3 五倍子對(duì)對(duì)蝦肝胰腺非特異性免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響

ACP和AKP均屬于溶酶體酶，與甲殼動(dòng)物的免疫功能密不可分[29]。LZM 是水產(chǎn)動(dòng)物非特異免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可通過(guò)水解細(xì)胞壁導(dǎo)致細(xì)菌破裂而亡[30]。飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.10%～0.15%水解單寧顯著提高了珍珠龍膽石斑魚(yú)肝臟中AKP和ACP 活性[18]。飼料中添加0.50%～2.00%水解單寧顯著提高了鳙血清AKP 和LZM 活性[31]；飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.00%酵提五倍子顯著提高了鳙血清LZM 活性[32]。本研究中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.04%五倍子可顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清中ACP、AKP 和LZM 活性，與前人研究結(jié)果相似，表明飼料中添加五倍子后，對(duì)蝦對(duì)病原體的消除作用增強(qiáng)，對(duì)蝦非特異性免疫能力提高。

CAT、SOD 屬于機(jī)體抗氧化酶，可清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)O2-，從而避免細(xì)胞受其損傷[33]。水解單寧可有效提高副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 脅迫后的對(duì)蝦血清CAT 和SOD活性[34]。珍珠龍膽石斑魚(yú)的飼料中添加1 000～1 500 mg/kg 水解單寧顯著提高了肝臟中CAT 和SOD 活性[18]。飼料中添加水提五倍子可提高鳙血清SOD 活性[31]。水提五倍子活性成分主要由單寧組成，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)證明，水解單寧的抗氧化效果比同濃度的維生素C 和維生素E 更佳[35]，可提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗氧化能力。本研究中添加GC 可顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清的CAT和SOD活性，與其在對(duì)蝦[34]、珍珠龍膽石斑魚(yú)[18]以及鳙[31]的研究一致，表明五倍子可提高凡納濱對(duì)蝦的抗氧化能力。

3.4 五倍子對(duì)對(duì)蝦全腸結(jié)構(gòu)的影響

腸道在機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)代謝中有重要作用[36]。飼料成分是影響腸道組織形態(tài)的重要因素之一[18]，且消化道形態(tài)也會(huì)隨著營(yíng)養(yǎng)水平和環(huán)境改變[37]，特別是腸道絨毛高度和肌層厚度。研究表明，水解單寧可顯著提高石斑魚(yú)腸道絨毛高度[18]。在陸生動(dòng)物上有較多類似的結(jié)果，如肉雞[37]、仔豬[38-39]和羊[40]。本研究中，添加五倍子顯著提高了凡納濱對(duì)蝦腸道的絨毛高度和肌層厚度，與前人研究結(jié)果基本一致，究其原因可能是水解單寧酸進(jìn)入腸道后會(huì)與腸上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)合，生成保護(hù)腸道黏膜的生物膜，并抑制病原體的入侵，降低腸道損傷發(fā)生概率，保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)同時(shí)促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖，使腸道絨毛長(zhǎng)度和腸壁厚度顯著增加[39,41]。

4 結(jié)論

在本研究條件下，添加0.02%～0.04%五倍子顯著提高了凡納濱對(duì)蝦幼蝦的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、非特異性免疫能力，改善了對(duì)蝦的腸道結(jié)構(gòu)。