基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)

林伯坤 劉欣 郭蓮仙 李林秋 邵軍麗

摘?要：本文介紹了基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)，具體內(nèi)容包括：設(shè)計(jì)思路、實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容（細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌；細(xì)菌分離；細(xì)菌純化和保存；革蘭氏染色和形態(tài)特征；生化試驗(yàn)；藥敏試驗(yàn)）、實(shí)驗(yàn)論文匯報（實(shí)驗(yàn)報告寫成論文形式；實(shí)驗(yàn)論文點(diǎn)評）。筆者已經(jīng)按照上述設(shè)計(jì)實(shí)施多年的實(shí)驗(yàn)教學(xué)（自2017年至今），本文所總結(jié)的多年教學(xué)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，可供開設(shè)微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程的高校同行參考。

關(guān)鍵詞：綜合實(shí)驗(yàn)；微生物；蛋白酶；細(xì)菌篩選；實(shí)驗(yàn)論文

綜合性實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中的重要內(nèi)容，可以訓(xùn)練學(xué)生綜合運(yùn)用多方面的知識、實(shí)驗(yàn)技能和思維方法去分析和解決問題的能力，利于提高學(xué)生的主動性和綜合能力，鍛煉學(xué)生的探索精神［1］。正因?yàn)槿绱酥匾?，普通高等學(xué)校本科教學(xué)工作水平評估方案里對開展綜合實(shí)驗(yàn)的課程比例有要求。通?？梢杂胁煌男问介_展綜合性實(shí)驗(yàn)，其中一種方式是通過設(shè)計(jì)將原本看起來是相互獨(dú)立的不同實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來，形成一個較為完整、具有連續(xù)性的實(shí)驗(yàn)體系［12］，使孤立的實(shí)驗(yàn)整體化、零散的知識系統(tǒng)化，使理論知識和操作技能形成一個有機(jī)的整體［3］。這種綜合性實(shí)驗(yàn)前后實(shí)驗(yàn)聯(lián)系緊密，要求學(xué)生認(rèn)真思考和操作、步步為營，方能理解整體實(shí)驗(yàn)和做出較好的結(jié)果，從而可以培養(yǎng)學(xué)生的整體思維和全局意識［4］。考慮到大學(xué)有不少專業(yè)的課程表安排得非常緊湊，很難有集中的空余時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，另外考慮到實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作量，這種實(shí)驗(yàn)串聯(lián)方式不失為一種較易開展的綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)方式。本文正是采用了這種實(shí)驗(yàn)串聯(lián)方式，將原先獨(dú)立的“細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌”“細(xì)菌接種技術(shù)”和“細(xì)菌革蘭氏染色”等實(shí)驗(yàn)重新設(shè)計(jì)了基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)體系。

一、設(shè)計(jì)思路

原先本微生物課程的實(shí)驗(yàn)一、二和三分別是“細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌”“細(xì)菌接種技術(shù)”和“細(xì)菌革蘭氏染色”。這三個實(shí)驗(yàn)，除了實(shí)驗(yàn)二使用了實(shí)驗(yàn)一配制的培養(yǎng)基外，沒有緊密的聯(lián)系，是相互獨(dú)立的。為了將這幾個實(shí)驗(yàn)整合為一個相互緊密聯(lián)系的綜合實(shí)驗(yàn)體系，需要進(jìn)行重新規(guī)劃，最終把它們設(shè)計(jì)成“某一類細(xì)菌篩選及其特性研究”這一主題的綜合實(shí)驗(yàn)，主要內(nèi)容不僅涵括了原先的“細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌”“細(xì)菌接種技術(shù)”和“細(xì)菌革蘭氏染色”等三個實(shí)驗(yàn)，還增設(shè)了“細(xì)菌分離純化和保存”“細(xì)菌生化試驗(yàn)”和“細(xì)菌藥敏試驗(yàn)”等實(shí)驗(yàn)。這樣就形成了從細(xì)菌分離篩選到細(xì)菌特性研究的一系列連貫實(shí)驗(yàn)，也可以看作是構(gòu)成了一個微小型的研究課題，也確保具有一定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而可以將這一系列實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)報告改為寫成一篇小型學(xué)術(shù)論文，不僅可以鍛煉學(xué)生撰寫論文的能力［5］，還可以讓學(xué)生有自主開展科學(xué)研究的感受，更能引起學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性［6］。

至于具體選擇哪一類細(xì)菌開展實(shí)驗(yàn)，有條件的學(xué)?？梢宰寣W(xué)生自主決定，或者由教師指定幾類容易篩選的細(xì)菌供學(xué)生選擇，比如從環(huán)境中篩選產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌、產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌或者從食物中分離大腸桿菌或某一類耐藥菌等。如果從方便實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備角度考慮，可以指定做某一類細(xì)菌。筆者正是選擇了產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，因?yàn)楫a(chǎn)蛋白酶細(xì)菌在環(huán)境中分布廣泛［7］，學(xué)生可以自主選擇環(huán)境樣品，比如土壤和湖水；篩選方法也簡單，容易篩選到，通常都能確保每一組學(xué)生都可以分離得到；鑒別產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的方法也很簡單和直觀有趣（在牛奶培養(yǎng)基上形成透明圈菌落［89］），學(xué)生學(xué)習(xí)興趣也高。因此，本文以產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌篩選及其特性研究為例闡述相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)。

二、實(shí)驗(yàn)教學(xué)安排

（一）實(shí)驗(yàn)一——培養(yǎng)基配制以及產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離

實(shí)驗(yàn)一可以安排4～6個學(xué)時，大約一個上午或一個下午。主要內(nèi)容包括配制分離純化產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的各種培養(yǎng)基以及滅菌、環(huán)境采樣及樣品處理、固體培養(yǎng)基平板的傾注、平板涂布法分離產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌。由于培養(yǎng)基滅菌過程需要較長的等待時間，為了充分利用時間，在實(shí)驗(yàn)課開始時先快速講解培養(yǎng)基配制這部分內(nèi)容，然后讓學(xué)生開始配制培養(yǎng)基及滅菌；因?yàn)榉蛛x細(xì)菌環(huán)節(jié)需要先用固體培養(yǎng)基，也可以讓學(xué)生先配制固體培養(yǎng)基并開始滅菌，然后再配制其他培養(yǎng)基。另外需要盡量配備多一些電子天平和微波爐等設(shè)備，否則消耗在排隊(duì)等待稱量和加熱的時間也比較多。在配制完所有培養(yǎng)基，在等待滅菌的過程中，再具體給學(xué)生講解其他實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以及觀看一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作教學(xué)視頻（如倒平板、平板涂布等），隨后安排學(xué)生到校園采集土壤樣品，還有樣品稀釋，因此需要將采樣器具和樣品稀釋所需要的材料在課前進(jìn)行滅菌和烘干，等到稀釋好樣品后（稀釋到106），基本上培養(yǎng)基滅菌也即將結(jié)束了。從滅菌鍋中拿出培養(yǎng)基，先擺斜面和高層培養(yǎng)基，然后開始傾注固體培養(yǎng)基，之后用平板涂布法分離產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌（10-3-10-6每個稀釋度涂布一個平板）。第二天，讓學(xué)生在一個課后時間過來觀看細(xì)菌分離結(jié)果和拍照，以及挑取透明水解圈最大的單菌落到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以備實(shí)驗(yàn)二使用。本次實(shí)驗(yàn)主要讓學(xué)生掌握各類細(xì)菌培養(yǎng)基的制備方法、滅菌材料的包扎方法和樣品梯度稀釋、倒平板、平板涂布等實(shí)驗(yàn)技能以及學(xué)習(xí)從環(huán)境樣品中分離細(xì)菌的方法。

分離產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌用的是普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，需要配制固體、半固體和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)一用于產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離和純化，在傾注平板前需要另外加入課前已滅菌的10%脫脂奶粉10mL，兩者混勻后再立刻傾注平板。10%脫脂奶粉的滅菌條件為110℃/10min，滅菌溫度過高、滅菌時間過長都容易造成沉淀。固體培養(yǎng)基還用于制備斜面（用于斜面接種），半固體培養(yǎng)基則用于高層培養(yǎng)基（用于細(xì)菌動力試驗(yàn)的穿刺接種）。液體培養(yǎng)基用于單菌落的培養(yǎng)和菌株保存。

總結(jié)需要課前滅菌的材料有：采樣材料（金屬藥勺、裝有90mL生理鹽水的250mL錐形瓶）；10%脫脂奶粉10mL（用試管裝）；稀釋樣品用的生理鹽水（用試管裝，每管9mL，共5管）；移液管或者移液器吸頭（200μL和1mL）；玻璃培養(yǎng)皿或者一次性滅菌塑料培養(yǎng)皿。

（二）實(shí)驗(yàn)二——產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的純化與保存

實(shí)驗(yàn)二可以安排2～3個學(xué)時。本次實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容是對實(shí)驗(yàn)一分離獲得的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌進(jìn)行平板劃線純化、斜面和穿刺接種，主要是訓(xùn)練學(xué)生學(xué)會各種細(xì)菌接種方法，每個學(xué)生至少練習(xí)每一種接種方法兩次。接種菌液用的是實(shí)驗(yàn)一挑取單菌落到液體培養(yǎng)基長出來的菌液，從而才能保證每個學(xué)生都能練習(xí)三種接種方法。培養(yǎng)基則是使用實(shí)驗(yàn)一配制的各類培養(yǎng)基。培養(yǎng)一天后，讓學(xué)生拍照接種效果，并把相關(guān)培養(yǎng)物放置于冰箱保存。時間安排允許的情況下，可以先進(jìn)行平板劃線純化，等平板劃線培養(yǎng)出來確認(rèn)是純的菌株后，再進(jìn)行斜面和穿刺接種。這樣的流程在學(xué)術(shù)上是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，但耗時過長，不太適合本科教學(xué)安排。實(shí)際情況下，往往還是選擇同時進(jìn)行三種接種，不需要等劃線純化結(jié)果出來再進(jìn)行其他接種，但需要與學(xué)生解釋清楚，讓學(xué)生明白在做科研情況下應(yīng)該如何做。

穿刺接種可以觀察細(xì)菌的動力，為了讓結(jié)果更好辨認(rèn)，可以同時接種已知的有鞭毛和無鞭毛的細(xì)菌作為參照菌。同時注意半固體培養(yǎng)基的瓊脂含量不能過高，通常是0.3%～0.5%。

（三）實(shí)驗(yàn)三——產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察

本次實(shí)驗(yàn)可以安排3～4學(xué)時。本次實(shí)驗(yàn)主要是訓(xùn)練學(xué)生掌握使用普通光學(xué)顯微鏡（尤其是油鏡觀察）觀察細(xì)菌形態(tài)和革蘭氏染色法，使用的是實(shí)驗(yàn)二劃線分離的單菌落。確保每一個學(xué)生都至少做出三個樣品，一是各自所篩選的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，二和三分別是用于參照的已知的革蘭氏陽性和陰性菌。要求學(xué)生拍照最終的染色結(jié)果，判斷所篩選的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌屬于陽性菌還是陰性菌，同時觀察細(xì)菌的形態(tài)（桿狀還是球狀或者其他形狀），也可以增加其他染色方法實(shí)驗(yàn)，比如鞭毛染色。

（四）實(shí)驗(yàn)四——產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)四可以安排4～6個學(xué)時。本次實(shí)驗(yàn)主要是訓(xùn)練學(xué)生掌握常見生化試驗(yàn)方法和藥敏試驗(yàn)的紙片擴(kuò)散法，這兩方面知識都是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的重要內(nèi)容，菌種是使用之前實(shí)驗(yàn)接種到平板和斜面的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的菌落。為了節(jié)省時間，生化試驗(yàn)通過購買商品化生化鑒定管來開展，可以多達(dá)20余種生化鑒定項(xiàng)目，主要測定項(xiàng)目包括氧化酶、DNA酶、乙酰胺酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、苯丙氨酸脫氨酶、脲酶、硫化氫試驗(yàn)、OF試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、多種糖類和醇類發(fā)酵試驗(yàn)（包括葡萄糖、麥芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇等）。有條件的情況下，可以增設(shè)對細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，比如16S?rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測序。藥敏試驗(yàn)的藥敏紙片也是可以通過購買獲得，可以做至少6種藥物，比如慶大霉素、氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素和新霉素等。藥敏試驗(yàn)使用的MH培養(yǎng)基可以由實(shí)驗(yàn)室在課前制備，也可以由學(xué)生在實(shí)驗(yàn)三提前配制和滅菌，同時需要配備濁度管。第二天觀看和記錄試驗(yàn)結(jié)果，有些生化試驗(yàn)需要在看結(jié)果時加入試劑反應(yīng)才能判定結(jié)果，比如硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯報

筆者此前多年指導(dǎo)本科畢業(yè)論文發(fā)現(xiàn)，許多學(xué)生在寫畢業(yè)論文時還是存在很多問題，包括格式問題，論文指導(dǎo)教師要花大量時間糾正這些問題。究其原因，重要一點(diǎn)在于學(xué)生在寫畢業(yè)論文之前缺乏論文寫作訓(xùn)練，對于不少學(xué)生來說，畢業(yè)論文是第一次寫論文。因此迫切需要在畢業(yè)論文之前的學(xué)習(xí)中，增加學(xué)生的論文寫作訓(xùn)練。把綜合實(shí)驗(yàn)報告寫成論文形式是一種極好的訓(xùn)練方式［10］。以往做法通常是在實(shí)驗(yàn)后要求學(xué)生寫實(shí)驗(yàn)報告。而經(jīng)過筆者重新規(guī)劃設(shè)計(jì)，幾個原先獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)串聯(lián)成一個有研究主題的綜合性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相對比較多，因此可以要求每個學(xué)生把實(shí)驗(yàn)結(jié)果寫成一篇小型論文進(jìn)行報告，論文題目統(tǒng)一為“產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的篩選及其特性研究”，內(nèi)容包括常規(guī)的研究背景、方法、結(jié)果、討論等部分，論文格式可以參照本校的本科畢業(yè)論文。強(qiáng)調(diào)每個學(xué)生都要單獨(dú)完成這篇實(shí)驗(yàn)論文，雖然在開展實(shí)驗(yàn)時，受實(shí)驗(yàn)條件所限，很難做到每個學(xué)生單獨(dú)完成所有實(shí)驗(yàn)。同一實(shí)驗(yàn)小組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以相同，但是不同人寫出來的論文終究是不同的。

可以給予學(xué)生充足的時間去完成這篇實(shí)驗(yàn)論文，比如1個月，教師在布置實(shí)驗(yàn)論文任務(wù)時可以講解論文寫作注意問題。教師在批改完實(shí)驗(yàn)論文后，也應(yīng)當(dāng)總結(jié)學(xué)生在論文中出現(xiàn)的問題，做成PPT，在課上進(jìn)行集中點(diǎn)評，這樣才能真正讓學(xué)生得到提高，論文點(diǎn)評可以安排2個學(xué)時。

鑒于實(shí)驗(yàn)論文均由每個學(xué)生單獨(dú)撰寫，也耗費(fèi)了較多時間，論文寫作也能較好反映學(xué)生的能力水平。因此，應(yīng)適當(dāng)提高實(shí)驗(yàn)論文在課程平時成績中的占比，具體比例應(yīng)依據(jù)具體情況而定，如除了實(shí)驗(yàn)論文，沒有其他特別的考核項(xiàng)目，可以將比例提高到課程平時成績的50%。這樣才能更好地區(qū)分學(xué)生的能力水平，也可以讓學(xué)生更有學(xué)習(xí)積極性。

結(jié)語

基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)可以安排15～21學(xué)時，具體內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)一：培養(yǎng)基配制和細(xì)菌分離；實(shí)驗(yàn)二：細(xì)菌純化和保存；實(shí)驗(yàn)三：細(xì)菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察；實(shí)驗(yàn)四：細(xì)菌的生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)論文點(diǎn)評（實(shí)驗(yàn)報告寫成論文形式）。通過此綜合實(shí)驗(yàn)，不僅可以讓學(xué)生學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制、細(xì)菌接種技術(shù)、細(xì)菌分離純化保存、細(xì)菌形態(tài)觀察、革蘭氏染色法、各種生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)等重要的微生物檢驗(yàn)基本技術(shù)，還可以訓(xùn)練學(xué)生撰寫論文的能力，讓學(xué)生有開展課題研究的體驗(yàn)。

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作者簡介：林伯坤（1982—?），男，漢族，廣東肇慶人，博士，副教授，研究方向：微生物檢驗(yàn)。

*通訊作者：邵軍麗（1980—?），女，漢族，河南安陽人，博士，副教授，研究方向：衛(wèi)生檢驗(yàn)。