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    基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)

    2023-05-06 14:17:29林伯坤劉欣郭蓮仙李林秋邵軍麗
    科技風(fēng) 2023年12期
    關(guān)鍵詞:綜合實(shí)驗(yàn)微生物蛋白酶

    林伯坤 劉欣 郭蓮仙 李林秋 邵軍麗

    摘?要:本文介紹了基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì),具體內(nèi)容包括:設(shè)計(jì)思路、實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容(細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌;細(xì)菌分離;細(xì)菌純化和保存;革蘭氏染色和形態(tài)特征;生化試驗(yàn);藥敏試驗(yàn))、實(shí)驗(yàn)論文匯報(實(shí)驗(yàn)報告寫成論文形式;實(shí)驗(yàn)論文點(diǎn)評)。筆者已經(jīng)按照上述設(shè)計(jì)實(shí)施多年的實(shí)驗(yàn)教學(xué)(自2017年至今),本文所總結(jié)的多年教學(xué)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),可供開設(shè)微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程的高校同行參考。

    關(guān)鍵詞:綜合實(shí)驗(yàn);微生物;蛋白酶;細(xì)菌篩選;實(shí)驗(yàn)論文

    綜合性實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中的重要內(nèi)容,可以訓(xùn)練學(xué)生綜合運(yùn)用多方面的知識、實(shí)驗(yàn)技能和思維方法去分析和解決問題的能力,利于提高學(xué)生的主動性和綜合能力,鍛煉學(xué)生的探索精神[1]。正因?yàn)槿绱酥匾?,普通高等學(xué)校本科教學(xué)工作水平評估方案里對開展綜合實(shí)驗(yàn)的課程比例有要求。通??梢杂胁煌男问介_展綜合性實(shí)驗(yàn),其中一種方式是通過設(shè)計(jì)將原本看起來是相互獨(dú)立的不同實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來,形成一個較為完整、具有連續(xù)性的實(shí)驗(yàn)體系[12],使孤立的實(shí)驗(yàn)整體化、零散的知識系統(tǒng)化,使理論知識和操作技能形成一個有機(jī)的整體[3]。這種綜合性實(shí)驗(yàn)前后實(shí)驗(yàn)聯(lián)系緊密,要求學(xué)生認(rèn)真思考和操作、步步為營,方能理解整體實(shí)驗(yàn)和做出較好的結(jié)果,從而可以培養(yǎng)學(xué)生的整體思維和全局意識[4]。考慮到大學(xué)有不少專業(yè)的課程表安排得非常緊湊,很難有集中的空余時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),另外考慮到實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作量,這種實(shí)驗(yàn)串聯(lián)方式不失為一種較易開展的綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)方式。本文正是采用了這種實(shí)驗(yàn)串聯(lián)方式,將原先獨(dú)立的“細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌”“細(xì)菌接種技術(shù)”和“細(xì)菌革蘭氏染色”等實(shí)驗(yàn)重新設(shè)計(jì)了基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)體系。

    一、設(shè)計(jì)思路

    原先本微生物課程的實(shí)驗(yàn)一、二和三分別是“細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌”“細(xì)菌接種技術(shù)”和“細(xì)菌革蘭氏染色”。這三個實(shí)驗(yàn),除了實(shí)驗(yàn)二使用了實(shí)驗(yàn)一配制的培養(yǎng)基外,沒有緊密的聯(lián)系,是相互獨(dú)立的。為了將這幾個實(shí)驗(yàn)整合為一個相互緊密聯(lián)系的綜合實(shí)驗(yàn)體系,需要進(jìn)行重新規(guī)劃,最終把它們設(shè)計(jì)成“某一類細(xì)菌篩選及其特性研究”這一主題的綜合實(shí)驗(yàn),主要內(nèi)容不僅涵括了原先的“細(xì)菌培養(yǎng)基配制和滅菌”“細(xì)菌接種技術(shù)”和“細(xì)菌革蘭氏染色”等三個實(shí)驗(yàn),還增設(shè)了“細(xì)菌分離純化和保存”“細(xì)菌生化試驗(yàn)”和“細(xì)菌藥敏試驗(yàn)”等實(shí)驗(yàn)。這樣就形成了從細(xì)菌分離篩選到細(xì)菌特性研究的一系列連貫實(shí)驗(yàn),也可以看作是構(gòu)成了一個微小型的研究課題,也確保具有一定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從而可以將這一系列實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)報告改為寫成一篇小型學(xué)術(shù)論文,不僅可以鍛煉學(xué)生撰寫論文的能力[5],還可以讓學(xué)生有自主開展科學(xué)研究的感受,更能引起學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性[6]。

    至于具體選擇哪一類細(xì)菌開展實(shí)驗(yàn),有條件的學(xué)??梢宰寣W(xué)生自主決定,或者由教師指定幾類容易篩選的細(xì)菌供學(xué)生選擇,比如從環(huán)境中篩選產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌、產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌或者從食物中分離大腸桿菌或某一類耐藥菌等。如果從方便實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備角度考慮,可以指定做某一類細(xì)菌。筆者正是選擇了產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌,因?yàn)楫a(chǎn)蛋白酶細(xì)菌在環(huán)境中分布廣泛[7],學(xué)生可以自主選擇環(huán)境樣品,比如土壤和湖水;篩選方法也簡單,容易篩選到,通常都能確保每一組學(xué)生都可以分離得到;鑒別產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的方法也很簡單和直觀有趣(在牛奶培養(yǎng)基上形成透明圈菌落[89]),學(xué)生學(xué)習(xí)興趣也高。因此,本文以產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌篩選及其特性研究為例闡述相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)。

    二、實(shí)驗(yàn)教學(xué)安排

    (一)實(shí)驗(yàn)一——培養(yǎng)基配制以及產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離

    實(shí)驗(yàn)一可以安排4~6個學(xué)時,大約一個上午或一個下午。主要內(nèi)容包括配制分離純化產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的各種培養(yǎng)基以及滅菌、環(huán)境采樣及樣品處理、固體培養(yǎng)基平板的傾注、平板涂布法分離產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌。由于培養(yǎng)基滅菌過程需要較長的等待時間,為了充分利用時間,在實(shí)驗(yàn)課開始時先快速講解培養(yǎng)基配制這部分內(nèi)容,然后讓學(xué)生開始配制培養(yǎng)基及滅菌;因?yàn)榉蛛x細(xì)菌環(huán)節(jié)需要先用固體培養(yǎng)基,也可以讓學(xué)生先配制固體培養(yǎng)基并開始滅菌,然后再配制其他培養(yǎng)基。另外需要盡量配備多一些電子天平和微波爐等設(shè)備,否則消耗在排隊(duì)等待稱量和加熱的時間也比較多。在配制完所有培養(yǎng)基,在等待滅菌的過程中,再具體給學(xué)生講解其他實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以及觀看一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作教學(xué)視頻(如倒平板、平板涂布等),隨后安排學(xué)生到校園采集土壤樣品,還有樣品稀釋,因此需要將采樣器具和樣品稀釋所需要的材料在課前進(jìn)行滅菌和烘干,等到稀釋好樣品后(稀釋到106),基本上培養(yǎng)基滅菌也即將結(jié)束了。從滅菌鍋中拿出培養(yǎng)基,先擺斜面和高層培養(yǎng)基,然后開始傾注固體培養(yǎng)基,之后用平板涂布法分離產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌(10-3-10-6每個稀釋度涂布一個平板)。第二天,讓學(xué)生在一個課后時間過來觀看細(xì)菌分離結(jié)果和拍照,以及挑取透明水解圈最大的單菌落到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),以備實(shí)驗(yàn)二使用。本次實(shí)驗(yàn)主要讓學(xué)生掌握各類細(xì)菌培養(yǎng)基的制備方法、滅菌材料的包扎方法和樣品梯度稀釋、倒平板、平板涂布等實(shí)驗(yàn)技能以及學(xué)習(xí)從環(huán)境樣品中分離細(xì)菌的方法。

    分離產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌用的是普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,需要配制固體、半固體和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)一用于產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離和純化,在傾注平板前需要另外加入課前已滅菌的10%脫脂奶粉10mL,兩者混勻后再立刻傾注平板。10%脫脂奶粉的滅菌條件為110℃/10min,滅菌溫度過高、滅菌時間過長都容易造成沉淀。固體培養(yǎng)基還用于制備斜面(用于斜面接種),半固體培養(yǎng)基則用于高層培養(yǎng)基(用于細(xì)菌動力試驗(yàn)的穿刺接種)。液體培養(yǎng)基用于單菌落的培養(yǎng)和菌株保存。

    總結(jié)需要課前滅菌的材料有:采樣材料(金屬藥勺、裝有90mL生理鹽水的250mL錐形瓶);10%脫脂奶粉10mL(用試管裝);稀釋樣品用的生理鹽水(用試管裝,每管9mL,共5管);移液管或者移液器吸頭(200μL和1mL);玻璃培養(yǎng)皿或者一次性滅菌塑料培養(yǎng)皿。

    (二)實(shí)驗(yàn)二——產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的純化與保存

    實(shí)驗(yàn)二可以安排2~3個學(xué)時。本次實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容是對實(shí)驗(yàn)一分離獲得的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌進(jìn)行平板劃線純化、斜面和穿刺接種,主要是訓(xùn)練學(xué)生學(xué)會各種細(xì)菌接種方法,每個學(xué)生至少練習(xí)每一種接種方法兩次。接種菌液用的是實(shí)驗(yàn)一挑取單菌落到液體培養(yǎng)基長出來的菌液,從而才能保證每個學(xué)生都能練習(xí)三種接種方法。培養(yǎng)基則是使用實(shí)驗(yàn)一配制的各類培養(yǎng)基。培養(yǎng)一天后,讓學(xué)生拍照接種效果,并把相關(guān)培養(yǎng)物放置于冰箱保存。時間安排允許的情況下,可以先進(jìn)行平板劃線純化,等平板劃線培養(yǎng)出來確認(rèn)是純的菌株后,再進(jìn)行斜面和穿刺接種。這樣的流程在學(xué)術(shù)上是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?,但耗時過長,不太適合本科教學(xué)安排。實(shí)際情況下,往往還是選擇同時進(jìn)行三種接種,不需要等劃線純化結(jié)果出來再進(jìn)行其他接種,但需要與學(xué)生解釋清楚,讓學(xué)生明白在做科研情況下應(yīng)該如何做。

    穿刺接種可以觀察細(xì)菌的動力,為了讓結(jié)果更好辨認(rèn),可以同時接種已知的有鞭毛和無鞭毛的細(xì)菌作為參照菌。同時注意半固體培養(yǎng)基的瓊脂含量不能過高,通常是0.3%~0.5%。

    (三)實(shí)驗(yàn)三——產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察

    本次實(shí)驗(yàn)可以安排3~4學(xué)時。本次實(shí)驗(yàn)主要是訓(xùn)練學(xué)生掌握使用普通光學(xué)顯微鏡(尤其是油鏡觀察)觀察細(xì)菌形態(tài)和革蘭氏染色法,使用的是實(shí)驗(yàn)二劃線分離的單菌落。確保每一個學(xué)生都至少做出三個樣品,一是各自所篩選的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌,二和三分別是用于參照的已知的革蘭氏陽性和陰性菌。要求學(xué)生拍照最終的染色結(jié)果,判斷所篩選的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌屬于陽性菌還是陰性菌,同時觀察細(xì)菌的形態(tài)(桿狀還是球狀或者其他形狀),也可以增加其他染色方法實(shí)驗(yàn),比如鞭毛染色。

    (四)實(shí)驗(yàn)四——產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)四可以安排4~6個學(xué)時。本次實(shí)驗(yàn)主要是訓(xùn)練學(xué)生掌握常見生化試驗(yàn)方法和藥敏試驗(yàn)的紙片擴(kuò)散法,這兩方面知識都是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的重要內(nèi)容,菌種是使用之前實(shí)驗(yàn)接種到平板和斜面的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的菌落。為了節(jié)省時間,生化試驗(yàn)通過購買商品化生化鑒定管來開展,可以多達(dá)20余種生化鑒定項(xiàng)目,主要測定項(xiàng)目包括氧化酶、DNA酶、乙酰胺酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、苯丙氨酸脫氨酶、脲酶、硫化氫試驗(yàn)、OF試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、多種糖類和醇類發(fā)酵試驗(yàn)(包括葡萄糖、麥芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇等)。有條件的情況下,可以增設(shè)對細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,比如16S?rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測序。藥敏試驗(yàn)的藥敏紙片也是可以通過購買獲得,可以做至少6種藥物,比如慶大霉素、氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素和新霉素等。藥敏試驗(yàn)使用的MH培養(yǎng)基可以由實(shí)驗(yàn)室在課前制備,也可以由學(xué)生在實(shí)驗(yàn)三提前配制和滅菌,同時需要配備濁度管。第二天觀看和記錄試驗(yàn)結(jié)果,有些生化試驗(yàn)需要在看結(jié)果時加入試劑反應(yīng)才能判定結(jié)果,比如硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)。

    三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯報

    筆者此前多年指導(dǎo)本科畢業(yè)論文發(fā)現(xiàn),許多學(xué)生在寫畢業(yè)論文時還是存在很多問題,包括格式問題,論文指導(dǎo)教師要花大量時間糾正這些問題。究其原因,重要一點(diǎn)在于學(xué)生在寫畢業(yè)論文之前缺乏論文寫作訓(xùn)練,對于不少學(xué)生來說,畢業(yè)論文是第一次寫論文。因此迫切需要在畢業(yè)論文之前的學(xué)習(xí)中,增加學(xué)生的論文寫作訓(xùn)練。把綜合實(shí)驗(yàn)報告寫成論文形式是一種極好的訓(xùn)練方式[10]。以往做法通常是在實(shí)驗(yàn)后要求學(xué)生寫實(shí)驗(yàn)報告。而經(jīng)過筆者重新規(guī)劃設(shè)計(jì),幾個原先獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)串聯(lián)成一個有研究主題的綜合性實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相對比較多,因此可以要求每個學(xué)生把實(shí)驗(yàn)結(jié)果寫成一篇小型論文進(jìn)行報告,論文題目統(tǒng)一為“產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的篩選及其特性研究”,內(nèi)容包括常規(guī)的研究背景、方法、結(jié)果、討論等部分,論文格式可以參照本校的本科畢業(yè)論文。強(qiáng)調(diào)每個學(xué)生都要單獨(dú)完成這篇實(shí)驗(yàn)論文,雖然在開展實(shí)驗(yàn)時,受實(shí)驗(yàn)條件所限,很難做到每個學(xué)生單獨(dú)完成所有實(shí)驗(yàn)。同一實(shí)驗(yàn)小組,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以相同,但是不同人寫出來的論文終究是不同的。

    可以給予學(xué)生充足的時間去完成這篇實(shí)驗(yàn)論文,比如1個月,教師在布置實(shí)驗(yàn)論文任務(wù)時可以講解論文寫作注意問題。教師在批改完實(shí)驗(yàn)論文后,也應(yīng)當(dāng)總結(jié)學(xué)生在論文中出現(xiàn)的問題,做成PPT,在課上進(jìn)行集中點(diǎn)評,這樣才能真正讓學(xué)生得到提高,論文點(diǎn)評可以安排2個學(xué)時。

    鑒于實(shí)驗(yàn)論文均由每個學(xué)生單獨(dú)撰寫,也耗費(fèi)了較多時間,論文寫作也能較好反映學(xué)生的能力水平。因此,應(yīng)適當(dāng)提高實(shí)驗(yàn)論文在課程平時成績中的占比,具體比例應(yīng)依據(jù)具體情況而定,如除了實(shí)驗(yàn)論文,沒有其他特別的考核項(xiàng)目,可以將比例提高到課程平時成績的50%。這樣才能更好地區(qū)分學(xué)生的能力水平,也可以讓學(xué)生更有學(xué)習(xí)積極性。

    結(jié)語

    基于細(xì)菌篩選及其特性研究的微生物綜合實(shí)驗(yàn)可以安排15~21學(xué)時,具體內(nèi)容包括:實(shí)驗(yàn)一:培養(yǎng)基配制和細(xì)菌分離;實(shí)驗(yàn)二:細(xì)菌純化和保存;實(shí)驗(yàn)三:細(xì)菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察;實(shí)驗(yàn)四:細(xì)菌的生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)論文點(diǎn)評(實(shí)驗(yàn)報告寫成論文形式)。通過此綜合實(shí)驗(yàn),不僅可以讓學(xué)生學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制、細(xì)菌接種技術(shù)、細(xì)菌分離純化保存、細(xì)菌形態(tài)觀察、革蘭氏染色法、各種生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)等重要的微生物檢驗(yàn)基本技術(shù),還可以訓(xùn)練學(xué)生撰寫論文的能力,讓學(xué)生有開展課題研究的體驗(yàn)。

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    作者簡介:林伯坤(1982—?),男,漢族,廣東肇慶人,博士,副教授,研究方向:微生物檢驗(yàn)。

    *通訊作者:邵軍麗(1980—?),女,漢族,河南安陽人,博士,副教授,研究方向:衛(wèi)生檢驗(yàn)。

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