質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)室規(guī)模化制備工藝

賁培玲 陳容前 孫 淼 施向陽(yáng)

滁州城市職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 滁州 239000

細(xì)菌質(zhì)粒DNA（plasmid DNA，pDNA）通常是小的（平均80 kb）環(huán)狀染色體外DNA元件，以游離形式持續(xù)穩(wěn)定地存在于染色體外，能夠通過(guò)招募宿主細(xì)胞機(jī)制進(jìn)行半自主復(fù)制，可攜帶有助于宿主適應(yīng)新環(huán)境的基因或編碼特異性功能的基因。質(zhì)粒作為載體應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域具有兩大優(yōu)勢(shì)：（1）基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中，質(zhì)粒載體具有低毒性、低免疫原性，可耐受核酸酶且轉(zhuǎn)移效率與遺傳物質(zhì)大小無(wú)關(guān)［1］；（2）在基因編輯時(shí)，質(zhì)粒可作為編輯工具CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體和基因修復(fù)序列的供體［2］。

pDNA規(guī)模化制備，主要目標(biāo)是最大限度地提高超卷曲pDNA比例和特定產(chǎn)量。通過(guò)適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒設(shè)計(jì)、宿主菌株選擇、生長(zhǎng)條件優(yōu)化以及適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)和純化策略，可以提高質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究以質(zhì)粒pEGFP-N1為例，探索規(guī)模化生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的方法。pEGFP-N1自身攜帶有能表達(dá)綠色熒光蛋白的EGFP報(bào)告基因，是真核表達(dá)載體，該質(zhì)粒具有很強(qiáng)的復(fù)制能力，具有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因的插入［3］。大腸桿菌Stbl3是混合大腸桿菌K12和大腸桿菌B親本的雜交菌株，可以在培養(yǎng)期間穩(wěn)定維持pDNA［4］。質(zhì)粒的生產(chǎn)分為兩個(gè)階段：上游發(fā)酵生產(chǎn)pDNA，下游加工分離純化pDNA［5］。本研究關(guān)注發(fā)酵培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)粒純化，成功獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 質(zhì)粒pEGFP-N1（4 733 bp ds-DNA）和克隆菌E.coliStbl3由通用生物（安徽）股份有限公司惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑及儀器設(shè)備 質(zhì)粒DNA提取試劑盒（美國(guó)Axygen公司），國(guó)產(chǎn)酵母提取物和蛋白胨，消泡劑 Antifoam 204（德國(guó)Sigma公司），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化銨、氫氧化銨等購(gòu)自國(guó)藥試劑。硫酸卡那霉素，瓊脂糖、限制性內(nèi)切酶（美國(guó)Promega公司）；DNA marker、蛋白檢測(cè)試劑盒（中國(guó)碧云天生物）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒（中國(guó)湛江市康博醫(yī)用設(shè)備有限公司）；質(zhì)粒 DNA 殘留檢測(cè)試劑盒（中國(guó)湖州生物科技有限公司）。

細(xì)菌LB培養(yǎng)基：5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物，蛋白胨，NaCl 0.5 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，磷酸氫二鉀6.78 g/L，氯化銨 1 g/L。微量元素：FeSO4·7H2O（40 mg/L），CaCl2·2H2O（40 mg/L），MnSO4·7H2O（10 mg/L），AlCl3·6H2O（10 mg/L），CoCl2·6H2O（4 mg/L），ZnSO4·7H2O（2 mg/L），NaMoO4·2H2O（2 mg/L），CuSO4·5H2O（1 mg/L），H3BO3（0.5 mg/L）和硫酸卡那霉素（30 mg/L）培養(yǎng)基［6］。

電泳裝置、凝膠成像儀；熒光定量PCR儀；10 L實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式發(fā)酵罐；切向流膜包系統(tǒng)；AKTAExplorer100液相色譜儀、Sepharose6FF凝膠、PlasmidSelectXtra和SOURCE30Q購(gòu)自美國(guó)通用電氣公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌發(fā)酵 搖瓶培養(yǎng)：將來(lái)自冷凍工作細(xì)胞庫(kù)（儲(chǔ)存于-70 ℃）的0.4 mL細(xì)菌培養(yǎng)物無(wú)菌轉(zhuǎn)移至4 mL 含有30 mg/L的卡那霉素培養(yǎng)基中。接種物在培養(yǎng)箱搖床中于37 ℃，160 r/min生長(zhǎng)至吸光度（optical density，OD） 600 nm 3 ～ 5，過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)移至500 mL錐形瓶中，該瓶中含有10 ～ 50 mL培養(yǎng)基，并于37 ℃，250 r/min孵育16 h。

實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵：以與搖瓶培養(yǎng)相同的方式制備用于實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵的接種物。將接種物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基中。6.5 L的發(fā)酵液在10 L發(fā)酵罐中，于37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min和30%溶解氧的空氣飽和度發(fā)酵16 h。

1.2.2 小劑量質(zhì)粒提取 參照說(shuō)明書(shū)，取新鮮發(fā)酵樣品（OD 600為0.5 ～ 4）于1.5 mL離心管中離心棄去上清，立即提取質(zhì)粒或冷凍保存再提取。確保每個(gè)微制備的質(zhì)粒總量是10 ～ 20 μg，溶于Eluent（pH 8.0，含20 μg/mL RNaseA）或去離子水，儲(chǔ)于-20 ℃冰箱中。

1.2.3 質(zhì)粒純化 稱取菌體，加入細(xì)胞重懸液（50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 7.5），充 分 重 懸 后 ，與 堿 裂 解 液（200 mmol/L NaOH，1% SDS）混合。裂解后，懸浮液變粘稠，通過(guò)加入與懸浮緩沖液等體積的中和液（3 mol/L乙酸鉀，5 mol/L冰乙酸）反應(yīng)，沉淀細(xì)胞碎片和SDS復(fù)合物。裂解液離心后取上清液，泵入濾芯式濾器（濾芯過(guò)濾孔徑為0.45 μm）中過(guò)濾，最終獲得澄清的裂解液。

用2倍柱體積的去離子水洗滌Sepharose 6FF，然后用2倍柱體積的平衡緩沖液［2.1 mol/L （NH4）2SO4，10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5］洗滌柱。質(zhì)粒粗提液過(guò)柱Sepharose 6 Fast Flow。樣品上樣量0.3個(gè)柱體積，使用泵以0.1 ～ 1 CV/min的速度加載到柱上。然后用平衡緩沖液［2.0 M（NH4）2SO4，10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5］2 倍CV清洗柱，收集pDNA，棄去RNA［6］。

用溶液［0.3 mol/L NaCl，1.7 mol/L （NH4）2SO4，10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5］作為緩沖液平衡HiTrap PlasmidSelect Xtra，收集的質(zhì)粒DNA進(jìn)行過(guò)柱，出現(xiàn)第1個(gè)吸收峰即線性質(zhì)粒DNA峰，待吸收曲線趨于平穩(wěn)后，用溶液（0.4 mol/L NaCl， 10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5）作為洗脫液，出現(xiàn)第2峰即超螺旋質(zhì)粒DNA峰，收集超螺旋質(zhì)粒（sc pDNA）［7-8］。

pDNA 的精提：用溶液（0.4 mol/L NaCl， 10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5）洗脫去除內(nèi)毒素，再以溶液（1.0 mol/L NaCl， 10 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5）洗脫收集超螺旋質(zhì)粒DNA［9］。

1.2.4 質(zhì)粒質(zhì)量分析 （1）動(dòng)力學(xué)定量染色Qubit4.0測(cè)定質(zhì)粒濃度：測(cè)定核酸溶液的濃度用TE緩沖液稀釋，在260 nm處分光光度測(cè)量，測(cè)定水溶液中核酸的濃度。（2）1%瓊脂糖凝膠分析1 μg未消化質(zhì)粒和1 μg酶切的質(zhì)粒。（3）高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)檢測(cè)質(zhì)粒亞型。（4）蛋白質(zhì)殘留檢測(cè)：參照說(shuō)明書(shū)，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液，樣品與工作液混合后37 ℃孵育30 min，然后在562 nm下比色測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)粒DNA蛋白質(zhì)殘留。（5）內(nèi)毒素含量檢測(cè)：參照說(shuō)明書(shū)，用終點(diǎn)顯色法細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素含量。（6）細(xì)菌基因組DNA殘留的qPCR檢測(cè)：參考使用說(shuō)明書(shū)，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次；反應(yīng)體積30 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Design Expert 10.0.1軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Plackett-Burman設(shè)計(jì)進(jìn)行多元回歸分析和單因素方差分析以擬合數(shù)學(xué)模型［9］。將蛋白胨、酵母提取物、抗生素、甘油、pH、溫度、接種濃度和培養(yǎng)液/搖瓶體積比等進(jìn)行多因素分析，采用F檢驗(yàn)和多元相關(guān)擬合優(yōu)度R對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)。在本研究中，進(jìn)行了12個(gè)實(shí)驗(yàn)，并選擇了最優(yōu)的變量進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。通過(guò)對(duì)這些變量的回歸分析，認(rèn)為P＜ 0.05對(duì)質(zhì)粒的產(chǎn)量有顯著影響。確定了3個(gè)最重要的變量之后，通過(guò)適當(dāng)改變所選變量的范圍，執(zhí)行最陡爬坡試驗(yàn)（plackett-burman， PB），以將響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)區(qū)域向最優(yōu)方向移動(dòng)。當(dāng)達(dá)到最大值時(shí)，可將該點(diǎn)作為優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。用于構(gòu)建和探索響應(yīng)即質(zhì)粒容積產(chǎn)率的假定函數(shù)關(guān)系［10］。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 PB實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量具有顯著影響的因素

質(zhì)粒的產(chǎn)量與質(zhì)粒和工程菌的兼容性及各自特性有關(guān)，為提高工業(yè)化生產(chǎn)條件下質(zhì)粒的產(chǎn)量，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究挑選了影響質(zhì)粒生產(chǎn)的7大潛在因素作為PB設(shè)計(jì)的待考察對(duì)象，7大因素及水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 PB設(shè)計(jì)中涉及的影響質(zhì)粒生產(chǎn)的7大因子及其水平

根據(jù)PB設(shè)計(jì)矩陣設(shè)置好的相應(yīng)生長(zhǎng)條件，測(cè)量各反應(yīng)條件下的E.coliStbl3 OD 600（可以表示菌種濃度，反映菌種的生長(zhǎng)情況）值及質(zhì)粒產(chǎn)量。將質(zhì)粒容積產(chǎn)率作為響應(yīng)值代入PB設(shè)計(jì)矩陣（表2），以便后續(xù)細(xì)菌生長(zhǎng)及質(zhì)粒生產(chǎn)的主要影響因素分析。

表2 PB設(shè)計(jì)矩陣及響應(yīng)值

選取了貢獻(xiàn)度 ＞ 1的因子作為自變量納入回歸模型擬合，如酵母提取物（B）、抗生素（C）、甘油（D）、接種濃度（E）、溫度（F）、蛋白胨-抗生素交互作用（AC）。以質(zhì)粒容積產(chǎn)率為因變量（Y），以各模型項(xiàng)或因子為自變量（X）擬合質(zhì)粒生產(chǎn)模型，其F值為14.0，表明該模型顯著。納入該模型的變量中，質(zhì)粒生產(chǎn)的顯著影響因素（P＜ 0.05）包括：抗生素、甘油、接種濃度、溫度、蛋白胨-抗生素交互作用（表3）。因此，質(zhì)粒生產(chǎn)最終模型為：Y = - 43.57 × B - 71.36× C - 100.65 × D + 88.86 × E + 57.08 × F - 83.55× AC + 93.06。此模型預(yù)測(cè)R2 = 0.618，校正R2 =0.877，兩者不一致，表明模型擬合中可能存在一些問(wèn)題；但該模型精密度= 13.098 4（＞ 4），表明該模型信息量充足，仍可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 擬合質(zhì)粒生產(chǎn)的PB因子模型并進(jìn)行方差與回歸分析

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化質(zhì)粒發(fā)酵

2.2.1 質(zhì)粒發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和結(jié)果 利用接種濃度、甘油和酵母提取物作為質(zhì)粒生產(chǎn)的最顯著影響因素進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和響應(yīng)值見(jiàn)表4和表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和編碼

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 利用Design-Expert軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：質(zhì)粒容積產(chǎn)量 = 19.978 - 0.318 75 × A + 0.216 25 × B - 0.035 × C - 0.275 × AB + 0.495 × AC +0.125 × BC - 0.666 5 × A2- 1.401 5 × B2-1.5165 × C2?；貧w方程進(jìn)行方差分析如表6所示。其中，F(xiàn)值可用來(lái)檢驗(yàn)各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性的高低。F越大，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。當(dāng)模型顯著性檢驗(yàn)P＜ 0.05，說(shuō)明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表7分析結(jié)果顯示，發(fā)酵條件對(duì)質(zhì)粒容積產(chǎn)率影響大小順序?yàn)椋篈 ＞ B ＞ C，即接種濃度 ＞ 甘油 ＞ 酵母提取物。模型的決定系數(shù)R2為0.971 3，說(shuō)明模型具有較高的顯著性，而校正R2= 0.934 3，能夠解釋實(shí)驗(yàn)93.43%的響應(yīng)值變異，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c真實(shí)數(shù)據(jù)擬合程度良好。

表6 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

表7 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 如圖1所示，發(fā)酵接種濃度A和甘油B的交互作用對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量的影響呈拋物面分布，當(dāng)接種濃度A一定時(shí)，隨著甘油B的增加，質(zhì)粒容積產(chǎn)率先上升后下降。當(dāng)甘油B不變時(shí)，隨著接種濃度A的提高，質(zhì)粒容積產(chǎn)率先增加后減小。相較而言，在接種濃度方向曲面波動(dòng)幅度更大，表明接種濃度較甘油對(duì)結(jié)果影響顯著。僅考慮二者因素作用下的最優(yōu)工藝組合為：接種濃度A為0.012 5 ～ 0.015，甘油B為6 ～ 7 g/L水平組合附近。如圖2所示的交互作用中，酵母提取物和接種濃度的交互作用等高線呈顯著橢圓形，表明二者交互作用對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量影響顯著。質(zhì)粒容積產(chǎn)率隨酵母提取物和接種濃度的增加呈現(xiàn)先增后減變化。當(dāng)接種濃度 A OD600為0.012 5 ～ 0.015、酵母提取物C取19 ～ 21 g/L水平區(qū)間值時(shí)，質(zhì)粒容積產(chǎn)率最高。如圖3所示，甘油-酵母提取物交互作用等高線呈現(xiàn)顯著圓形，表明二者交互作用對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量影響不顯著。當(dāng)甘油B為6 ～ 7 g/L水平區(qū)間、酵母提取物C取19 ～ 21 g/L時(shí)，質(zhì)粒容積產(chǎn)率較高。

圖1 接種濃度和甘油的交互作用對(duì)質(zhì)粒容積產(chǎn)率的影響

圖2 接種濃度和酵母提取物的交互作用對(duì)質(zhì)粒容積產(chǎn)率的影響

圖3 甘油和酵母提取物的交互作用對(duì)質(zhì)粒容積產(chǎn)率的影響

以質(zhì)粒容積產(chǎn)率最大為優(yōu)化目標(biāo)，根據(jù)Design-Expert軟件運(yùn)行結(jié)果，質(zhì)粒產(chǎn)量在接種濃度A、甘油B、酵母提取物C的共同影響下的最優(yōu)工藝為：接種濃度A OD 600為0.014、甘油B為6.378 g/L、酵母提取物C為19.787 g/L，在此條件下模型預(yù)測(cè)的最大質(zhì)粒容積產(chǎn)率為20.035 mg/L。

2.3 工藝條件試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)合實(shí)際工藝設(shè)置的可行性，取接種濃度A OD 600為0.014 、甘油B為6 g/L、酵母提取物C為20 g/L，進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)，得平均質(zhì)粒容積產(chǎn)率為22.3 mg/L，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近，表明基于該響應(yīng)面模型分析優(yōu)化質(zhì)粒產(chǎn)量工藝的方法有效可行。

2.4 質(zhì)粒發(fā)酵驗(yàn)證

采用10 L發(fā)酵罐中加入6.5 L培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)，其中甘油6 g/L，酵母提取物20 g/L，E.coliStbl3接種初始濃度OD 600為0.014，發(fā)酵16 h，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌的生物量OD 600為（28.07 ± 2.01）。

2.5 質(zhì)粒純化

采用低機(jī)械應(yīng)力堿性裂解程序，切向流過(guò)濾濃縮質(zhì)粒粗提液。采用Sepharose 6 Fast Flow層析柱分離DNA與RNA，避免動(dòng)物源RNA酶的污染。然后采用Plasmidselect Xtra層析柱去除開(kāi)環(huán)或線性質(zhì)粒DNA，獲得超螺旋質(zhì)粒DNA。進(jìn)一步采用PlasmidSelect Xtra去除樣品內(nèi)毒素，獲得高純度的質(zhì)粒DNA。通過(guò)HPLC分析獲得的pDNA的超螺旋亞型用百分比表示的均勻性為95.55%，質(zhì)粒體積產(chǎn)量為（21.34 ± 1.31） mg/L，共獲得質(zhì)粒150 mg。

2.6 質(zhì)粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

圖4A顯示，經(jīng)過(guò)層析的質(zhì)粒，凝膠電泳DNA條帶清晰，開(kāi)環(huán)形態(tài)得到明顯去除，RNA檢測(cè)不出，Qubit4.0測(cè)定RNA殘留0.3%。圖4B顯示質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定結(jié)果正確。A260/A280為1.91 ± 0.02。用BCA的方法沒(méi)有檢測(cè)到蛋白質(zhì)的污染物。內(nèi)毒素分析顯示，制劑中的內(nèi)毒素水平低于0.005 EU/g PDNA，完全符合基因治療用低于0.1 EU/g PDNA的規(guī)范。細(xì)菌染色體DNA經(jīng)qPCR檢測(cè)不到。

圖4 質(zhì)粒pEGFP-N1瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討 論

質(zhì)粒DNA生產(chǎn)過(guò)程中，細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)提高發(fā)酵效率至關(guān)重要，直接影響到下游的純化和最終的質(zhì)量和收率［11］。肉湯TB培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)，工程菌生長(zhǎng)速度過(guò)快，容易發(fā)生質(zhì)粒丟失。綜合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和成本費(fèi)用等因素，使用甘油和國(guó)產(chǎn)的蛋白胨、酵母提取物分別作為碳源和氮源。通過(guò)建模及方差回歸分析，篩選出質(zhì)粒產(chǎn)量的3個(gè)主要影響因子分別為接種濃度、甘油和酵母提取物，進(jìn)一步發(fā)酵驗(yàn)證。

通常在搖瓶培養(yǎng)中，細(xì)菌培養(yǎng)基的光密度（OD 600）值約為3 ～ 6。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)器發(fā)酵，通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)料速率來(lái)限制細(xì)胞的特定生長(zhǎng)速度，以保留高比例的超螺旋質(zhì)粒［12］。發(fā)酵采用葡萄糖和線性氨基酸的批量補(bǔ)料策略，獲得高質(zhì)量（高超卷曲質(zhì)粒水平）質(zhì)粒［13］。本研究中采用葡萄糖作為補(bǔ)料，但葡萄糖濃度過(guò)高或者溶氧過(guò)低，大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生大量乙酸，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的高效表達(dá)，降低超卷曲質(zhì)粒百分比。在生物反應(yīng)器中監(jiān)測(cè)溫度、溶解氧和pH值，pH降低時(shí)及時(shí)補(bǔ)充氯化銨，最終獲得高密度菌，OD 600達(dá)到30.2。3次發(fā)酵菌體濕重總量達(dá)到990 g，獲得的菌體生物量是搖瓶的2倍多。

采用堿性裂解和色譜純化方法相結(jié)合制備質(zhì)粒DNA。在菌體裂解后，進(jìn)一步沉淀、超濾和濃縮質(zhì)粒DNA溶液［14］。質(zhì)粒DNA粗制備溶液產(chǎn)物中?；煊蠷NA、蛋白等雜質(zhì)，影響其應(yīng)用［15］。本研究中主要采用Sepharose 6FF柱、PlasmidSelect Xtra柱、SOURCE 30Q柱3步層析，除去細(xì)菌宿主細(xì)胞脂多糖、細(xì)菌基因組DNA、RNA、蛋白質(zhì)等，結(jié)果表明獲得的質(zhì)粒DNA超螺旋比例大于90%，含有極低數(shù)量的基因組DNA、RNA、蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素，質(zhì)粒DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)符合《質(zhì)粒抽提和抽提規(guī)則》。

綜上所述，選擇合適的菌株，采用響應(yīng)面法選擇和優(yōu)化發(fā)酵條件，在生物反應(yīng)器中可以監(jiān)測(cè)和調(diào)整不同的操作變量，如pH、溶解氧、間接測(cè)定特定的細(xì)胞生長(zhǎng)率等，完善質(zhì)粒pDNA實(shí)驗(yàn)室規(guī)模化制備工藝，并進(jìn)行質(zhì)粒質(zhì)量評(píng)價(jià)。本研究適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模化制備pDNA，并可擴(kuò)展地制造pDNA作為原料或藥物物質(zhì)，最大限度地提高質(zhì)粒產(chǎn)量滿足醫(yī)藥研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突