E2F轉(zhuǎn)錄因子家族在宮頸癌中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系

陳 玥 佘婧瑤 陳 思 曹 瑩 梁春云 盧 燕 王佩娟 公 真

1.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210028； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023

宮頸癌在中國(guó)的女性癌癥發(fā)病率中居第六位，發(fā)病率與死亡率均較高。2020年全球共報(bào)道超過60萬例新發(fā)病例和超過30萬例死亡病例［1］。在經(jīng)濟(jì)條件較好的國(guó)家和地區(qū)，規(guī)范的宮頸疾病篩查有效地降低了發(fā)病率和死亡率［2］。然而在東南亞地區(qū)，宮頸癌仍是第二常見的癌癥類型，也是中低收入國(guó)家女性因癌癥死亡的主要原因［3］。宮頸癌分為不同組織學(xué)亞型，最常見組織病理學(xué)亞型是鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC），其次是腺癌（adenomatous carcinoma，AC）［4］。手術(shù)是目前治療宮頸癌的主要手段，晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌患者對(duì)傳統(tǒng)的放化療會(huì)有一定的耐藥性，有效的治療方法仍然匱乏。因此，研究對(duì)宮頸癌有預(yù)測(cè)價(jià)值的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)患者的生存和預(yù)后尤為重要。

E2F轉(zhuǎn)錄因子家族已被證實(shí)參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老、DNA損傷反應(yīng)和修復(fù)等過程［5-7］。1987年，該家族首次被證實(shí)為激活E2腺病毒啟動(dòng)子的激活劑，目前已鑒定出該家族的8個(gè)成員：E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7 和E2F8，分別位于不同的染色體上。其中E2F3和E2F7存在a、b兩種亞型，在細(xì)胞的不同周期表達(dá)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能可將其分為激活因子（E2F1、E2F2和E2F3a）和抑制因子（E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8）［8］。

研究發(fā)現(xiàn)，E2F家族成員與多種類型惡性腫瘤（肝癌［9］、腎癌［10］、直腸癌［11］等）的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。它們?cè)谡＝M織中低水平表達(dá)，但在腫瘤組織中過度表達(dá)，使其成為潛在治療靶點(diǎn)［12］。在宮頸癌中，也觀察到部分E2F家族成員的表達(dá)異常上調(diào)［13］。尚未有應(yīng)用生物信息學(xué)分析探索E2Fs在宮頸癌中作用的研究。本研究基于對(duì)在線發(fā)表的數(shù)千個(gè)基因表達(dá)或拷貝數(shù)變異的分析，詳細(xì)分析宮頸癌患者中不同E2F因子的表達(dá)和突變，以確定E2F轉(zhuǎn)錄因子家族在宮頸癌中的表達(dá)模式、潛在功能、不同的預(yù)后價(jià)值以及與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系，從而為宮頸癌的診斷和治療提供新的視角。

1 資料與方法

1.1 Oncomine

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前全球最大的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，旨在挖掘癌癥基因信息［14］。本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫鑒定E2F家族成員在宮頸癌、正常組織以及在宮頸癌不同臨床分期中的差異表達(dá)。篩選條件：（1）【search】分別輸入E2F1-E2F8；設(shè)置P-VALUE：0.05，F(xiàn)OLD CHANGE：2；GENE RANK：2 ，DATA TYPE：mRNA。獲得8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在不同類型癌種中的表達(dá)情況后進(jìn)行合并，藍(lán)色模塊對(duì)應(yīng)低表達(dá)，紅色模塊對(duì)應(yīng)高表達(dá)，3種飽和度由淺至深分別表示差異排序?yàn)?0%，5%，1%。（2）【Analysis Type】--【cancer vs. Normal Analysis】--【Cervical squamous cell carcinoma vs. Normal Analysis】，得到E2F家族在宮頸癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)集，記錄表達(dá)倍數(shù)。

1.2 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)交互分析數(shù)據(jù)庫2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA 2）

GEPIA 2［15］是基于腫瘤基因組計(jì)劃（the Cancer Genome Atlas，TCGA）與 基 因 型 -組 織 表 達(dá)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫建立的可視化癌癥大數(shù)據(jù)分析平臺(tái)。

篩選條件：【enter gene name】分別輸入E2F1-E2F8，點(diǎn)擊【GoPIA】；【Expression DIY】選擇【Boxplot】及【Stage plot】，分別輸入E2F1- E2F8，設(shè)置|Log2FC|Cutoff：1，p-value Cutoff：0.01，【Datasets】選擇CESC，點(diǎn)擊【plot】，用于分析E2F家族在宮頸癌與正常組織中，以及不同疾病期別間的表達(dá)差異。

1.3 Kaplan-Meier plotter

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫來源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）、歐洲基因組（European Genome-phenome Archive，EGA）和TCGA等，目前可評(píng)估基因?qū)?1種癌癥生存的影響，包括宮頸癌［16］。因此，可用此數(shù)據(jù)庫評(píng)估E2F家族各成員表達(dá)水平與宮頸癌患者總生存期（overall survival，OS）、無復(fù)發(fā)生存期（recurrence free survival，RFS）的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

篩選步驟：選擇【Start KM plot for pan-cancer】，【Gene symbol】分別輸入E2F1-E2F8；【Split patients by】設(shè)為median，病種選擇Cervical squamous cell carcinoma，【Survival】分別選擇 OS，RFS，獲得生存曲線。

1.4 cBioPortal

cBioPortal是包含多個(gè)腫瘤基因組項(xiàng)目的多維癌癥數(shù)據(jù)平臺(tái)［17］，使用cBioPortal分析宮頸癌患者的數(shù)據(jù)集（TCGA），探索E2F家族的基因變異情況。同時(shí)利用該平臺(tái)篩選出193個(gè)宮頸癌中E2F家族成員的相關(guān)基因。篩選步驟：（1）點(diǎn)擊【Cervix】，選擇包含310個(gè)樣本的【Cervical Squamous Cell Carcinoma and Endocervical Adenocarcinoma（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）】數(shù)據(jù)庫；【Enter Genes】輸入E2F1- E2F8；選擇【OncoPrint】及【Cancer Types Summary】E2F家族基因突變情況分析。（2）【Co-expression】板塊中藍(lán)色代表被選中基因，搜索框分別輸入E2F1-E2F8；②生成圖中得到Pearson校正值，用于分析宮頸癌E2F家族成員之間的相關(guān)性。

1.5 Sring和Cytoscape

String是Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins的縮寫（https：//string-db.org/），是一個(gè)在線搜索已知的蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，收錄了已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)/基因間的相互作用關(guān)系［18］。具體步驟：cBioPortal數(shù)據(jù)庫中選擇【Co-expression】板塊，依據(jù)P值鑒定出與每個(gè)成員最相關(guān)的25個(gè)基因，去交集后得到193個(gè)基因。String中選擇【Multiple proteins】，【List Of Names】中導(dǎo)入篩選出的193 個(gè)基因，【Organisms】選擇 Homo sapiens，點(diǎn)擊【SEARCH】匹配到190個(gè)基因，將190個(gè)基因?qū)隒ytoscape生成蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 WebGestalt

WebGestalt （http：//www.webgestalt.org/）支 持在線的基因集富集分析［19］，以此對(duì)E2F相關(guān)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。具體步驟：【Gene List】中導(dǎo)入190個(gè)基因，【Organism of Interest】選擇 Homo sapiens，【Method of Interest】選擇 Over-Representation Analysis（ORA），F(xiàn)untional Database選擇不同的富集類型，【Submit】進(jìn)行分析。

1.7 TIMER 2.0

Timer 2.0是一個(gè)提供不同類型癌癥中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)綜合分析的公共資源平臺(tái)［20］。通過該平臺(tái)的【Immune Association】模塊獲取免疫細(xì)胞散點(diǎn)圖，【Gene Expression】分別輸入E2F1-E2F，【Immune Infiltrates】選擇不同的免疫細(xì)胞類型，分析宮頸癌樣本中E2F家族的表達(dá)與不同類型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 E2F家族在宮頸癌中的表達(dá)研究

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫比較宮頸癌與正常組織中E2F的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)E2F1、E2F2、E2F3、E2F7、E2F8在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)（圖1A），GEPIA 2數(shù)據(jù)庫證實(shí)了相同的結(jié)果（圖1B）。此外，E2F家族成員在宮頸癌中的表達(dá)豐度亦不相同：E2F5的相對(duì)表達(dá)量在E2F家族成員中最低，而E2F4的表達(dá)量最高，但與正常組織無明顯差異（圖2）。Scotto的數(shù)據(jù)集中，E2F1在宮頸癌組織中過表達(dá)，與正常組織對(duì)比倍數(shù)變化為3.64（表1）。Biewenga的數(shù)據(jù)集顯示宮頸癌組織中E2F2的表達(dá)較正常組織增加（倍數(shù)變化 =2.19）。在Zhai等3種不同的數(shù)據(jù)集中，E2F3在宮頸癌組織中均過表達(dá)（倍數(shù)變化 = 3.252～4.546）。Pyeon Multi-cancer數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常組織相比，E2F7在宮頸癌組織中表達(dá)增加（倍數(shù)變化 =9.39）。Scotto和Zhai的數(shù)據(jù)集還提示，E2F8在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中亦過表達(dá)（倍數(shù)變化 = 2.557～2.751）。根據(jù)不同的臨床分期劃分亞組，發(fā)現(xiàn)E2F家族各成員在不同臨床分期中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖3）。

圖3 E2F家族表達(dá)水平與宮頸癌臨床分期的相關(guān)性（GEPIA2）

表1 E2F家族在不同類型宮頸癌與正常組織中表達(dá)水平的倍數(shù)變化（Oncomine）

圖1 E2F轉(zhuǎn)錄因子家族表達(dá)分析

圖2 宮頸癌中E2F家族的相對(duì)表達(dá)水平（GEPIA2）

2.2 E2F家族在宮頸癌預(yù)后中的作用分析

采用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析E2F家族成員的表達(dá)水平與宮頸癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，E2F1低表達(dá)與患者較差的OS，E2F3高表達(dá)與患者較差的RFS均顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。上述結(jié)果提示，具有高E2F1和（或）低E2F3 mRNA表達(dá)水平的宮頸癌患者預(yù)計(jì)具有更高的生存率，這些成員可能是評(píng)價(jià)預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

圖4 E2F家族與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系（Kaplan-Meier plotter）

2.3 E2F基因家族在宮頸癌中的遺傳學(xué)改變

通過TCGA數(shù)據(jù)庫和cBioPortal工具對(duì)宮頸癌中E2F家族基因變異頻率和類型進(jìn)行分析。選擇包含310例宮頸癌樣本的數(shù)據(jù)庫，庫內(nèi)共包含191例樣本數(shù)據(jù)，24例（13%）樣本檢測(cè)到E2F家族成員的遺傳變異。其中宮頸SCC樣本突變率為12.26%（19/155），宮頸AC樣本突變率為7.69%（2/26）。如圖5所示，E2F1基因變異率為5%，為E2F家族中最高；E2F2、E2F4、E2F7基因變異率1%，為E2F家族中最低。主要變異類型包括基因擴(kuò)增、基因缺失、錯(cuò)義突變和截?cái)嗤蛔兊?。通過cBioPortal在線工具計(jì)算宮頸癌E2F家族成員之間的相關(guān)性，并進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果表明，在宮頸癌組織中E2F2與E2F7、E2F8，E2F3與E2F5，E2F7與E2F8的表達(dá)呈正相關(guān)；E2F2與E2F5的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其余家族成員間無明顯線性相關(guān)（圖6）。

圖5 宮頸癌中各E2F家族成員的基因改變頻率（cBioPortal）

圖6 E2F家族各成員之間的相關(guān)性（GEPIA2）

2.4 E2F轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)基因的功能及通路富集分析

首先，通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫鑒定出宮頸癌中與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族最密切相關(guān)的193個(gè)基因，運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫匹配到其中190個(gè)基因，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖（圖 7A），結(jié)果顯示 KIF11、CENPA、CENPM、CENPN和MIS18BP1是與宮頸癌中E2F家族功能相關(guān)的核心基因（圖7B）。WebGestalt對(duì)匹配到的其中191個(gè)E2F相關(guān)基因進(jìn)行了GO功能富集分析，結(jié)果顯示E2F相關(guān)基因功能主要與生物調(diào)節(jié)、能量代謝、細(xì)胞成分、應(yīng)激反應(yīng)及發(fā)育過程等環(huán)節(jié)有關(guān)；E2F相關(guān)基因在以下部位、成分中高度富集：細(xì)胞核、膜封閉腔、細(xì)胞漿、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞膜、內(nèi)膜系統(tǒng)等。就分子功能而言，蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性等被高度富集。此外，KEEG分析結(jié)果表明，E2F相關(guān)蛋白與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老密切相關(guān)。

圖7 E2F家族相關(guān)分子分析（cBioPortal，Cytoscape）

2.5 E2F家族與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)是腫瘤預(yù)后和淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)的獨(dú)立評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用TIMER 2.0分析宮頸癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與E2F家族各成員之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，除E2F1與B細(xì)胞呈正相關(guān)（r= 0.283，P＜ 0.001）外，其余家族成員與B細(xì)胞無明顯相關(guān)性；E2F2，E2F4、E2F，7，E2F8與CD4+ T細(xì)胞呈顯著性正相關(guān)（r= 0.229，0.301，0.432，0.278，P＜ 0.001），但E2F5與 CD4+ T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r= -0.229，P＜0.001）；CD8+ T細(xì)胞與E2F5，E2F8）均呈顯著性正相關(guān)（r= 0.257，0.282，P＜ 0.001）；E2F3與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)（r= -0.202，P＜ 0.001）。以上數(shù)據(jù)表明，E2F家族在腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制中發(fā)揮著不同作用，可能與其結(jié)構(gòu)域不同有關(guān)。

3 討 論

2020年全球報(bào)道的宮頸癌病例中，80%發(fā)生在中低收入國(guó)家，這給患者和醫(yī)療系統(tǒng)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［21］。因此，降低治療成本、改善治療結(jié)果對(duì)宮頸癌的診療管理至關(guān)重要。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也已得到部分證實(shí)，但針對(duì)其與宮頸癌相關(guān)性的生物信息學(xué)分析仍有待進(jìn)行。本研究首次探討了E2F轉(zhuǎn)錄因子家族不同成員在宮頸癌中的表達(dá)水平和預(yù)后價(jià)值，將有助于提高疾病認(rèn)知，促進(jìn)治療優(yōu)化，改善宮頸癌患者預(yù)后。

在E2F家族中，E2F1與宮頸癌的關(guān)系是目前研究最多的。研究顯示，沉默或過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子E2F1可導(dǎo)致RNASEH2A表達(dá)的顯著下調(diào)或上調(diào)，而RNASE2A過表達(dá)可加快DNA復(fù)制并縮短細(xì)胞周期，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖［22］。本研究顯示，E2F1在宮頸癌組織中表達(dá)明顯升高，采用Kaplan-Meier plotter，本研究確定了E2F1在乳腺癌患者中的預(yù)后價(jià)值，在隨訪的宮頸癌患者中，E2F1低表達(dá)與生存率差顯著相關(guān)。

到目前為止，關(guān)于E2F2在宮頸癌中的表達(dá)作用研究較少。Chang等［13］研究顯示，E2F2敲除可導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞周期停滯。在本研究中，E2F2在宮頸癌組織中的表達(dá)高于正常組織。然而，E2F2表達(dá)與宮頸癌患者的腫瘤分期、預(yù)后均無顯著相關(guān)。

E2F3過表達(dá)是許多類型惡性腫瘤（包括宮頸癌）的致癌因素。Liu等［23］證明了E2F3誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，激活CD36-AKT-E2F3信號(hào)傳導(dǎo)和靶向FGF2轉(zhuǎn)錄，隨后通過FGFR1介導(dǎo)的PI3K/AKT和MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，E2F3被證實(shí)是miR-340-5p的靶基因，可被LINC01094間接和正向調(diào)控，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖［24］。本研究顯示，E2F3在宮頸癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且更低的E2F3表達(dá)與宮頸癌患者更好的生存率顯著相關(guān)。

通常認(rèn)為E2F7和E2F8是轉(zhuǎn)錄抑制因子，但他們亦有可能扮演激活因子的角色。與正常宮頸組織相比，E2F7在宮頸癌樣本中上調(diào)，其發(fā)揮作用的主要途徑可能是通過調(diào)節(jié)CDC6的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的［25］。研究發(fā)現(xiàn)，E2F8的表達(dá)在多種惡性腫瘤中顯著增加，這意味著它可能參與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展［26］。E2F8在實(shí)驗(yàn)中被證明可通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化促進(jìn)宮頸癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［27］，遺憾的是相關(guān)研究數(shù)量仍然較少。在本研究中，E2F7和E2F8在宮頸癌組織中顯著過表達(dá)，但其表達(dá)水平與宮頸癌患者的腫瘤分期和預(yù)后均無關(guān)，需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它們?cè)趯m頸癌中的作用。

本研究系統(tǒng)地分析了E2F家族在宮頸癌中的表達(dá)和其預(yù)后價(jià)值，嘗試深入了解宮頸癌分子生物學(xué)層面的異質(zhì)性。通過對(duì)基因的功能和通路的富集分析，進(jìn)一步加深了對(duì)E2F家族在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中作用的理解。此外，近年來很多報(bào)道重視腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，有效提高了多種癌癥的診斷特異性和預(yù)后評(píng)估的準(zhǔn)確性［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中多數(shù)E2F家族成員的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)呈顯著性正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。CD4+和CD8+T細(xì)胞都是最常見的免疫細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞是腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的主要成分。因此，調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)一直是癌癥免疫治療的重點(diǎn)［30］，而M0巨噬細(xì)胞也在之前的研究中被證明與宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［31］。CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被認(rèn)為可通過免疫反應(yīng)達(dá)到抑癌作用，但免疫逃逸機(jī)制可能是導(dǎo)致免疫細(xì)胞大量浸潤(rùn)卻無法發(fā)揮抗腫瘤作用的元兇；相反，正反饋機(jī)制使免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步加劇，與此相關(guān)的深入研究亟待進(jìn)行。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，E2F轉(zhuǎn)錄因子家族部分成員在宮頸癌中異常表達(dá)，并導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例失調(diào)，從而影響臨床結(jié)局和免疫治療的效果。E2F家族成員（尤其是E2F1、E2F3）可能是潛在的預(yù)后標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)，后續(xù)擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究其具體作用機(jī)制，為宮頸癌患者新治療方案的發(fā)現(xiàn)、更特異預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)的制定，提供更多理論依據(jù)，使更多宮頸癌患者受益。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突