厚環(huán)乳牛肝菌培養(yǎng)條件篩選及接種白皮松初探

趙汝娜

德州市城市園林規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，山東 德州 253000

0 引言

白皮松（Pinus bungeanaZucc. ex Endl.）是我國(guó)特有針葉樹種，樹姿優(yōu)美挺拔，樹皮特點(diǎn)鮮明，極具觀賞價(jià)值[1］。白皮松木材可用于房屋建筑、家具制造等，且種子可食。白皮松果實(shí)具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等功效。另外，白皮松在吸收粉塵、二氧化硫等有害氣體方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。白皮松用途廣泛，因而深受林業(yè)相關(guān)人員青睞，但如何提高白皮松引種成活率及抗逆性有待加強(qiáng)研究。

外生菌根菌是一類可以與特定植物根系形成菌根的高等真菌。菌根可以擴(kuò)大寄主植物根系吸收養(yǎng)分與水分的范圍，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)元素吸收；能夠產(chǎn)生刺激植物生長(zhǎng)的物質(zhì)；還能夠?qū)μ囟ㄖ虏【a(chǎn)生拮抗作用，提高植物抗病性。在生產(chǎn)實(shí)踐中，接種外生菌根真菌，對(duì)提高苗木成活率及抗逆性效果顯著。金陳斌[2］研究表明，對(duì)白皮松、檜柏等松柏類古樹接種外生菌根菌后，其根系活力增強(qiáng)，生長(zhǎng)量明顯提升，衰老趨勢(shì)得以延緩。此外，接種外生菌根菌可以促進(jìn)馬尾松、樟子松幼苗對(duì)養(yǎng)分的吸收與積累，有利于幼苗生長(zhǎng)[3-4］。接種外生菌根菌可以提高黑松等對(duì)逆境的抗性，緩解干旱、土壤酸化及鹽漬化等逆境脅迫[5-7］。外生菌根菌在松樹育苗和造林中的應(yīng)用結(jié)果表明，接種外生菌根菌可以提高出苗率，促進(jìn)苗木生長(zhǎng)，而且明顯提高造林成活率[8-9］。

厚環(huán)乳牛肝菌[Suillus grevillei（Kl.）Sing.］，又名厚環(huán)粘蓋牛肝菌、雅致乳牛肝菌，是一種外生菌根真菌[9-10］，也可食用。筆者對(duì)厚環(huán)乳牛肝菌培養(yǎng)條件進(jìn)行一系列優(yōu)化篩選，并將其接種于白皮松盆栽苗，研究其對(duì)白皮松生長(zhǎng)及土壤堿化的影響，探索以外生菌根菌接種提高白皮松成活率、促進(jìn)白皮松生長(zhǎng)的有效途徑，以期為提高白皮松引種成功率提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

厚環(huán)乳牛肝菌購(gòu)自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，白皮松盆栽苗系實(shí)驗(yàn)室栽培。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基A（常規(guī)PDA 培養(yǎng)基）的配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL；培養(yǎng)基B 的配方為馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉①40.1 g、水1 000 mL；培養(yǎng)基C 的配方為馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉②37.0 g、水1 000 mL；培養(yǎng)基D 的配方為馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉③40.1 g、水1 000 mL；培養(yǎng)基E 的配方為麥芽浸膏5.0 g、葡萄糖5.0 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.5 g、硫酸鎂（MgSO4）0.5 g、氯化銨（NH4Cl）0.5 g，氯化鐵（FeCl3）1.0%溶液10 滴、瓊脂15 g 和水1 000 mL；培養(yǎng)基F 的配方為麥芽糖2.0 g、葡 萄 糖2.0 g、可 溶 性 淀 粉2.0 g、硫 酸 鎂（MgSO4）0.5 g、氯化鈣（CaCl2）0.5 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.25 g、瓊脂20 g 和水1 000 mL。以上6種培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌20 min 后制成平板備用。

1.2.2 液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，121 ℃條件下滅菌20 min 后備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 厚環(huán)乳牛肝菌培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選。①固體培養(yǎng)基篩選。將菌種接種于1.2.1所述6種固體培養(yǎng)基上，于20 ℃條件下培養(yǎng)。②培養(yǎng)溫度篩選。將菌種接種在常規(guī)PDA培養(yǎng)基上，分別在15.0、17.5、20.0、22.5 ℃及25.0 ℃條件下培養(yǎng)。③培養(yǎng)基pH值篩選。用稀鹽酸溶液或稀氫氧化鈉溶液將常規(guī)PDA 培養(yǎng)基pH 值調(diào)節(jié)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，接種菌種后在20 ℃條件下培養(yǎng)。④光照條件篩選。將菌種接種在常規(guī)PDA培養(yǎng)基上，分別置于室內(nèi)自然光及黑暗條件下，在20 ℃條件下培養(yǎng)。⑤濕度條件篩選。將菌種接種在常規(guī)PDA培養(yǎng)基上，一組使用封口膜封口進(jìn)行保濕，一組不進(jìn)行封口，在20 ℃條件下培養(yǎng)。⑥接種方向篩選。將菌種接種在常規(guī)PDA 培養(yǎng)基上，一組菌絲塊正面向上，一組菌絲塊正面向下，在20 ℃條件下培養(yǎng)。上述試驗(yàn)均取直徑6 mm菌絲塊接種于培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，在相應(yīng)條件下置于生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)14 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3.2 接種厚環(huán)乳牛肝菌于白皮松試驗(yàn)。將菌絲塊搗碎接種于1.2.2所述液體培養(yǎng)基中，在20 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 d，過(guò)濾，棄去濾液，菌絲進(jìn)行勻漿。勻漿后將菌液用灌根法接種于白皮松盆栽苗，對(duì)照組白皮松使用等量清水進(jìn)行相同操作。接種組和對(duì)照組各10個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)期間（2022 年1—4 月）正常養(yǎng)護(hù)，灌溉用水pH值為8.15。接種前及接種3個(gè)月后分別測(cè)量白皮松高度、地徑及土壤pH值。株高測(cè)定方法為用直尺測(cè)量株高（含盆），測(cè)量3次取平均值；地徑測(cè)定方法為用游標(biāo)卡尺測(cè)量距盆土表面10 cm處樹干直徑，測(cè)一組垂直交叉數(shù)據(jù)，取平均值；土壤pH值采用電位法測(cè)定。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用SPSS 進(jìn)行差異性分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件篩選結(jié)果分析

2.1.1 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是菌絲生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其組成成分尤為重要。菌絲在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)存在差異。由表1 可知，培養(yǎng)基A 和培養(yǎng)基F 上的菌落直徑較大，分別為13.05 mm 和11.30 mm。其中，培養(yǎng)基A 上的菌落表現(xiàn)為菌絲潔白、長(zhǎng)勢(shì)致密，培養(yǎng)基F 上的菌落菌絲長(zhǎng)勢(shì)稀疏。培養(yǎng)基E 上的菌落直徑稍小，為8.87 mm，培養(yǎng)基B、培養(yǎng)基C、培養(yǎng)基D 上的菌落幾乎未見生長(zhǎng)。綜上所述，在6 種供試培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基A 最適宜厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)，表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度快且菌絲潔白致密。

表1 厚環(huán)乳牛肝菌在不同配方培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.1.2 溫度。厚環(huán)乳牛肝菌菌絲在2～35 ℃條件下均可生長(zhǎng)[10-11］。如表2 所示，培養(yǎng)溫度在15.0～25.0 ℃時(shí)，菌落直徑為11.25～14.75 mm，并且隨溫度升高呈先增加后減小趨勢(shì)，適宜菌絲生長(zhǎng)的溫度為20.0～25.0 ℃，最適宜溫度為22.5 ℃。

表2 溫度對(duì)厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.1.3 pH 值。培養(yǎng)基pH 值對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有重要影響，適宜的pH值有利于菌絲生長(zhǎng)。如表3所示，培養(yǎng)基pH 值為4.0～8.0 時(shí)，菌落直徑為14.08～15.93 mm，并且隨pH 值升高呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)。培養(yǎng)基pH值為5.0～7.0 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，其中pH 值為6.0時(shí)菌落直徑最大、長(zhǎng)勢(shì)最好。

表3 培養(yǎng)基pH值對(duì)厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.1.4 光照。試驗(yàn)結(jié)果表明，黑暗條件下培養(yǎng)的菌落直徑為14.73 mm，光照條件下培養(yǎng)的菌落直徑為12.56 mm，黑暗組菌落直徑比光照組大17.3%。此外，黑暗組菌絲更為潔白，且直立生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯，次生代謝物明顯減少。

2.1.5 濕度。試驗(yàn)結(jié)果表明，封口組菌落直徑為13.40 mm，未封口組菌落直徑為11.02 mm，封口組菌落直徑比未封口組大22%。由此可見，保持一定的濕度可以明顯促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。

2.1.6 接種方向。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲塊正面向下組菌落直徑為18.15 mm，向上組菌落直徑為14.29 mm，向下組菌落直徑比向上組大27%。由此可見，菌絲塊菌絲面接觸培養(yǎng)基的接種方法明顯有利于菌絲生長(zhǎng)。

2.2 接種厚環(huán)乳牛肝菌于白皮松結(jié)果分析

2.2.1 白皮松株高和地徑。接種組白皮松株高生長(zhǎng)量是對(duì)照組的2.7倍，地徑生長(zhǎng)量是對(duì)照組的1.4倍。由此可見，接種厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)白皮松生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用（見表4）。

表4 接種厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)白皮松株高和地徑的影響

2.2.2 土壤pH 值。由表5 可知，接種組和對(duì)照組土壤pH 值均有不同程度的升高，接種組pH 值升高0.27，對(duì)照組pH 值升高0.21。由此表明，接種厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)抑制土壤堿化效果不明顯。

表5 接種厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)土壤pH值的影響

3 討論

該研究探索了培養(yǎng)基配方、溫度、pH 值、光照、濕度和接種方向等因素對(duì)厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。其中，培養(yǎng)基配方對(duì)厚環(huán)乳牛肝菌菌絲的生長(zhǎng)影響極大，具體表現(xiàn)在菌絲生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)及次生代謝物等方面。在該研究篩選的6 種固體培養(yǎng)基中，常規(guī)PDA 培養(yǎng)基最適宜厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速度最快、菌落潔白致密、次生代謝物相對(duì)較少。適宜厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的溫度為20～25 ℃，與前人研究結(jié)果（15～20 ℃）[11］略有差異，表明不同菌株的生長(zhǎng)適溫可能存在差異。最適宜厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的pH值為5.0～7.0，與前人研究結(jié)果一致[11-12］，且培養(yǎng)基pH 值為6.0 時(shí)厚環(huán)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度最快。PDA 培養(yǎng)基的自然pH 值與此相近，因此，配制培養(yǎng)基時(shí)可視情況省略調(diào)節(jié)pH 值這一操作。光照可以促進(jìn)厚環(huán)乳牛肝菌子實(shí)體分化，使其長(zhǎng)勢(shì)健旺、顏色純正[11］，但同時(shí)會(huì)抑制其菌絲生長(zhǎng)，并促進(jìn)次生代謝物合成，延長(zhǎng)培養(yǎng)周期。水分是菌絲生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。厚環(huán)乳牛肝菌培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，在利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)宜對(duì)其用封口膜封口，以防止水分散失，進(jìn)而促使菌絲正常生長(zhǎng)。對(duì)于厚環(huán)乳牛肝菌菌絲塊的接種方向鮮有學(xué)者提及，此研究發(fā)現(xiàn)接種塊向下接種、使菌絲接觸培養(yǎng)基有利于菌絲生長(zhǎng)。

外生菌根菌是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，其對(duì)寄主植物的生長(zhǎng)、抗病性、抗逆性等方面均有極大的影響。周文婷[13］研究表明，對(duì)濕地松接種厚環(huán)乳牛肝菌能夠增加濕地松針葉中葉綠素的含量，促進(jìn)濕地松對(duì)土壤中氮和磷元素的吸收，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。尹大川等[14］研究表明，對(duì)樟子松接種厚環(huán)乳牛肝菌等外生菌根菌能夠增加樟子松針葉中光合色素的含量，并且提高苗木自身及根際土壤相關(guān)酶類的活性，從而促進(jìn)苗木生長(zhǎng)，誘導(dǎo)苗木產(chǎn)生對(duì)氧化脅迫的抗性。郭秀珍等[15］研究表明，接種厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)油松幼苗猝倒病具有防治作用，厚環(huán)乳牛肝菌菌絲對(duì)立枯絲核菌及尖孢鐮刀菌等致病菌具有拮抗作用。溫祝桂等[7］研究表明，接種外生菌根菌可以提高黑松體內(nèi)脯氨酸含量，促進(jìn)黑松對(duì)K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高黑松對(duì)鹽堿化土壤的適應(yīng)性。白皮松喜酸性土壤，不耐鹽堿[16］。筆者所在地區(qū)土壤偏堿性，土壤pH值普遍在8.0以上，對(duì)白皮松引種成活率造成了不利影響。該研究對(duì)白皮松盆栽苗接種厚環(huán)乳牛肝菌，結(jié)果表明厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)白皮松生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，接種后白皮松的株高和地徑生長(zhǎng)量均明顯提升；但是，接種厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)抑制土壤pH 值升高未見明顯效果，甚至接種組土壤pH 值略高于對(duì)照組，而接種組白皮松株高和地徑生長(zhǎng)量仍然明顯高于對(duì)照組。這一結(jié)果表明，接種厚環(huán)乳牛肝菌可能會(huì)增強(qiáng)白皮松對(duì)堿化土壤的耐受性。厚環(huán)乳牛肝菌促進(jìn)白皮松生長(zhǎng)的作用機(jī)制及該菌種對(duì)白皮松耐鹽堿、抗病性等方面的影響有待繼續(xù)研究。另外，該研究采用灌根法對(duì)白皮松進(jìn)行厚環(huán)乳牛肝菌接種，操作簡(jiǎn)單便捷，其他接種方法如截根法、溝施法等[17］的接種效率仍有待進(jìn)一步探索。同時(shí)，厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)白皮松地栽苗的生長(zhǎng)是否同樣具有促進(jìn)作用也需要探究，從而為厚環(huán)乳牛肝菌在白皮松引種栽培中的應(yīng)用提供更為全面、科學(xué)的依據(jù)。

4 結(jié)論

此研究較為細(xì)致地探討了厚環(huán)乳牛肝菌菌絲的培養(yǎng)條件，確定其適宜培養(yǎng)條件為常規(guī)PDA 培養(yǎng)基、溫度20～25 ℃、pH 值5.0～7.0、黑暗條件、較高濕度、菌絲塊向下接種，為實(shí)驗(yàn)室快速培養(yǎng)厚環(huán)乳牛肝菌菌絲提供了重要參考依據(jù)。此研究結(jié)果表明，在白皮松根部接種厚環(huán)乳牛肝菌，白皮松株高和地徑等生長(zhǎng)指標(biāo)明顯提升，即接種厚環(huán)乳牛肝菌對(duì)白皮松生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。此研究為外生菌根菌在白皮松上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，對(duì)提高白皮松在各地尤其是鹽堿地區(qū)的引種成功率具有借鑒意義。