水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus）肝臟抗氧化指標(biāo)影響

李鈺，葉恒振，李爭可，許悅，韋露，郭志強(qiáng)

（海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

鉻是水體污染的有害重金屬之一，每年大約有7×106t 鉻廢水被排放到自然環(huán)境中[1]，嚴(yán)重危害水生生物的生理，如抗氧化酶活性、細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡等[2-4]。Cr（Ⅵ）進(jìn)入生物體后還原成Cr（Ⅲ）并產(chǎn)生大量活性氧自由基（ROS），引起組織氧化損傷甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、突變等[4-7]。在水環(huán)境中，鉻最穩(wěn)定的兩種氧化態(tài)為三價(jià)鉻Cr（Ⅲ）和六價(jià)鉻Cr（Ⅵ），Cr（Ⅵ）是一種強(qiáng)氧化劑，對生物體的毒性是Cr（Ⅲ）的1 000 倍，致突變性為100 倍，且由于跨膜方式的不同，Cr（Ⅵ）比Cr（Ⅲ）更加容易被吸收并在組織內(nèi)累積[2,8,9]。盡管Cr（Ⅲ）的毒性要遠(yuǎn)低于Cr（Ⅵ），當(dāng)Cr（Ⅲ）在生物體內(nèi)累積過量，也會損傷DNA 并造成遺傳毒性[10-12]。

抗氧化防御系統(tǒng)作為生物體內(nèi)基本的生理功能和防御機(jī)制，抗氧化酶活指標(biāo)被廣泛應(yīng)用于研究重金屬對魚體抗氧化防御系統(tǒng)的影響[13-16]。在輕度脅迫下，刺激抗氧化酶活性升高以抵御外界脅迫，而在重度脅迫下，過度消耗抗氧化酶活性，超出機(jī)體抵御能力，抗氧化酶活性降低[17-19]。主要的抗氧化防御系統(tǒng)由抗氧化酶以及抗氧化劑共同作用?？寡趸赴ǔ趸锲缁福⊿OD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等，非酶抗氧化劑如谷胱甘肽（GSH）可與抗氧化酶協(xié)同作用以抑制活性氧（ROS）過量產(chǎn)生[19]。例如，抗氧化酶SOD 活性隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，草魚（Ctenopharyngodon idellus）鰓的ROS 含量先升高后降低[20]。盡管有關(guān)六價(jià)鉻對生物體的毒理效應(yīng)研究已較為充分，但有關(guān)三價(jià)鉻的毒性研較為稀少，且兩種不同價(jià)態(tài)鉻差異對比的研究則更為罕見[20,21]。

豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus）為一種高觀賞價(jià)值、高食用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)魚類而被人類廣泛捕撈，導(dǎo)致種群數(shù)量逐年下降[23]而被列入《瀕危物種紅色名錄》[24]。目前，關(guān)于豹紋鰓棘鱸的研究大多集中在生態(tài)、體色、基因等方面[25-27]。未見有關(guān)三價(jià)鉻[Cr（Ⅲ）]和六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]對豹紋鰓棘鱸，尤其是其肝臟抗氧化酶活性影響的對比研究。本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的水相三價(jià)鉻[Cr（Ⅲ）]和六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]對豹紋鰓棘鱸幼魚超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量的影響，為準(zhǔn)確衡量水相三價(jià)鉻[Cr（Ⅲ）]和六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]毒性對水生生物健康的影響提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要儀器和試劑

酶標(biāo)分析儀（雷杜RT-6100 型，上海蔚霆商貿(mào)有限公司）；可見分光光度計(jì)（UV-5100 型，上海元析儀器有限公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（H2050R，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電子分析天平（PX85ZH，奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司）。

氯化鉻（CrCl3·6H2O，Cr（Ⅲ），純度≥99%）和重鉻酸鉀（K2Cr2O7，Cr（Ⅵ），純度≥99.5%），購自中國上海Sigma-Aldrich 貿(mào)易有限公司（https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh）。蛋白定量（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。商業(yè)魚飼料購自中國山東省三通生物工程有限公司。

1.2 方法

體質(zhì)量（16.5±2.1）g 的豹紋鰓棘鱸幼魚（n=84）購自中國海南省陵水市藍(lán)海水產(chǎn)養(yǎng)殖場，采用半靜態(tài)法對幼魚進(jìn)行了14 d 和21 d 的水相鉻暴露實(shí)驗(yàn)。首先將該魚馴養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室水族箱（0.8 m×0.6 m×0.6 m）中馴化15 d，每天投喂兩次（9:00 和17:00）[28]。實(shí)驗(yàn)室水質(zhì)條件：總鉻濃度<0.034 mg/L，溶解氧5.6～7.4 mg/L，pH 7.4～8.4，水溫28.3～29.7℃，光周期12 h（12 L∶12 D）。

幼魚適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為7 組7 箱：對照組（Control）、Cr（Ⅲ）處理組（0.05 mg/L、0.1 mg/L 和0.2 mg/L）和Cr（Ⅵ）處理組（0.05 mg/L、0.1 mg/L 和0.2 mg/L）。每缸12 尾魚，每次取6 尾魚作為平行。實(shí)驗(yàn)期間，自然海水經(jīng)48 h 暗沉淀處理、二級砂濾，符合海水水質(zhì)I 類標(biāo)準(zhǔn)，每隔24 h 換一次水；每日8:00 am 和4:00 pm 記錄水溫，測定氨氮、溶氧含量和水中鉻濃度等。水中鉻濃度測定平均值分別為：（0.053±0.014）mg/L、（0.132±0.021）mg/L 和（0.216±0.029）mg/L。實(shí)驗(yàn)組Cr 質(zhì)量濃度未包括海水本底值。

飼養(yǎng)期間，分別在第14 d 和第21 d 取樣，在冰袋上快速分離肝臟并稱重，迅速裝入1.5 mL 無菌離心管中置于-80℃冰箱保存。

1.3 酶活性的測定

將肝臟組織按照體積（mL）加入9 倍體積的0.9%生理鹽水（4℃預(yù)冷），利用勻漿器機(jī)械破碎組織樣品（60 hz，30 sec），冰水浴制備10%勻漿（2 500 r/min 離心10 min），取上清勻漿液測定酶活性。采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液蛋白濃度（TP 試劑盒），利用SOD、CAT、POD 和GSH 檢測試劑盒分別測定幼年豹紋鰓棘鱸肝臟組織內(nèi)的三種酶活性以及GSH含量。

SOD 活力單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50 %時(shí)所對應(yīng)的SOD 量為一個(gè)酶活力單位（U）。CAT 單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol 的H2O2量為一個(gè)酶活力單位（U）。POD 單位定義：37℃下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg 底物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。因此，組織勻漿中總SOD、CAT、POD 活力單位為U/mg prot。GSH 單位定義：37℃條下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 nmol NDPH 氧化為一個(gè)酶活單位。即組織勻漿中GSH 活力單位為mgGSH/g prot。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，分別利用Excel 和GraphPad Prism 8.0（Comparative Graph-Pad Software Inc.,USA）處理、多元統(tǒng)計(jì)分析和作圖。通過單因素方差分析（One-Way ANOVA）與多重比較Tukey's Method 檢驗(yàn)處理組之間三種酶活性以及GSH 含量差異的顯著性。若P<0.05，則為顯著差異；P<0.01，則為極顯著差異；P>0.05，則差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水相C r（Ⅲ）和C r（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

14 d 時(shí)，Cr 處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD活性顯著低于對照組（P<0.05）（圖1-A）；且隨著處理濃度的增加而增加。0.05 mg/L 濃度Cr（Ⅲ）與Cr（Ⅵ）處理下SOD 活性都極顯著低于對照組（55.35±5.59 U/m gprot）（P<0.01），平均值分別為（28.56±3.28）U/mg prot 和（23.39±1.79）U/mg prot；0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度Cr（Ⅲ）下SOD 活性顯著高于C（rⅥ）組（P<0.01）。

圖1 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性Fig.1 The activity of superoxide dismutase（SOD）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）組處理組SOD 活性低于對照組，但無顯著性差異（P>0.05）（圖1-B）；在Cr（Ⅵ）處理下，SOD 活性顯著低于對照組（P<0.05）；Cr（Ⅲ）處理組的SOD 活性在0.05 mg/L 和0.2 mg/L 濃度下極顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.01）。

2.2 水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過氧化氫酶（CAT）活性的影響

14 d 時(shí)，Cr 處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的CAT活性都顯著低于對照組（P<0.05）。Cr（Ⅲ）組0.1 mg/L 濃度下，CAT 活性最低，與對照組（16.87±3.95）U/mg prot 差異極顯著（P<0.01），且顯著低于同濃度的Cr（Ⅵ）處理組（5.64±1.60）U/mg prot（P<0.05）；Cr（Ⅵ）處理組的CAT 活性隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高而升高，濃度為0.05 mg/L 時(shí)Cr（Ⅵ）處理組（7.15±1.73）U/mg prot 的CAT 活性最低（圖2-A）。

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組的CAT 活性與對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；Cr（Ⅵ）處理組的CAT 活性都顯著低于對照組（P<0.05），且隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高而下降，濃度為0.2 mg/L 時(shí)CAT 活性最低（12.68±2.95）U/mg prot；Cr（Ⅲ）處理組的CAT 活性在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度下極顯著高于同濃度Cr（Ⅵ處理組（P<0.01）（圖2-B）。

圖2 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）時(shí)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過氧化氫酶（CAT）活性Fig.2 The activity of catalase（CAT）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

2.3 水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過氧化物（POD）活性的影響

14 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的POD 活性在0.1 和0.2 mg/L 濃度時(shí)顯著高于對照組（4.76±0.64）U/mg prot（P<0.05），且極顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.01），平均值分別為（7.42±2.83）U/mg prot 和（9.12±1.50）U/mg prot；Cr（Ⅵ）處理組的POD 活性在濃度為0.05 mg/和0.1 mg/L 時(shí)與對照組無顯著差異（P>0.05），在0.2 mg/L 濃度下Cr（Ⅵ）處理組（2.08±0.41）U/mg prot 顯著低于對照組（P<0.05）（圖3-A）。

圖3 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過氧化物酶（POD）活性Fig.3 The activity of peroxidase（POD）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組的POD 活性顯著高于對照組（7.22±1.32）U/mg prot（P<0.05），隨著濃度的升高而升高；Cr（Ⅵ）處理組的POD 活性在0.05 mg/L和0.1 mg/L 時(shí)顯著高于對照組（P<0.05），平均值分別為（9.66±0.91）U/mg prot 和（14.45±1.72）U/mg prot；在濃度為0.2 mg/L 時(shí)Cr（Ⅵ）處理組（4.56±1.58）U/mg prot 顯著低于對照組（P<0.05）；Cr（Ⅲ）處理組的POD 活性極顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.01）（圖3-B）。

2.4 水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟谷胱甘肽（GSH）含量的影響

14 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的的GSH 含量隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的升高而升高，在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度時(shí)顯著高于對照組（13.71±1.53）mg GSH/g prot（P<0.05），且極顯著高于Cr（Ⅵ）組（P<0.01），平均值分別為（18.70±2.05）mgGSH/g prot 和（22.14±1.64）mg GSH/g prot；Cr（Ⅵ）處理組的GSH 含量隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高而下降，在0.2 mg/L 濃度時(shí)Cr（Ⅵ）處理組GSH含量（10.34±2.20）mg GSH/g prot 顯著低于對照組（P<0.05）（圖4-A）。

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組的GSH 含量隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的升高而升高，在0.2 mg/L 濃度下Cr（Ⅲ）處理（16.35±1.34）mg GSH/g prot 顯著高于對照組（12.02±0.73）mg GSH/g prot（P<0.05）；Cr（Ⅵ）處理組的GSH 含量隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高而下降，在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度時(shí)Cr（Ⅵ）處理組顯著低于對照組（P<0.05），平均值分別為（10.20±0.90）mg GSH/g prot 和（6.17±0.94）mg GSH/g prot；Cr（Ⅲ）處理組的GSH 含量在0.05 mg/L 濃度下顯著低于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.05），在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度下顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.05）（圖4-B）。

圖4 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟谷胱甘肽（GSH）含量Fig.4 The activity of glutathione（GSH）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

3 討論

3.1 Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟組織SOD 和CAT 活性的影響

SOD 可以催化ROS 的超氧陰離子（O2-·）產(chǎn)生H2O2，抑制ROS 以減少脅迫對機(jī)體的損傷。輕度脅迫下SOD 活性升高以抵御外界對機(jī)體的脅迫刺激，而在重度脅迫下，生物體內(nèi)受損嚴(yán)重導(dǎo)致過量ROS積累，SOD 活性被過度消耗而降低[29]。CAT 的主要作用是與細(xì)胞內(nèi)的H2O2反應(yīng)產(chǎn)生H2O[19,29-31]，以清除SOD 催化ROS 后所產(chǎn)生的H2O2廢物。本研究中，水相Cr（Ⅲ）暴露14 d 時(shí)顯著抑制豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD 和CAT 活性（P<0.05），但此抑制作用隨時(shí)間的增長而降低，并在21 d 時(shí)與對照組相比無顯著差異（P>0.05）（圖1、圖2），這可能是由于第21 d 水相Cr（Ⅲ）暴露已無法使豹紋鰓棘鱸幼魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，以產(chǎn)生ROS 消耗SOD 與CAT 的酶活力，即豹紋鰓棘鱸幼魚可能已逐漸適應(yīng)0.05 mg/kg、0.1 mg/kg 和0.2 mg/kg 的水相Cr（Ⅲ）暴露環(huán)境。在水相Cr（Ⅲ）對金魚（Carassius auratus）急性（96 h，10 mg/L）暴露實(shí)驗(yàn)中，處理組的SOD 和CAT活性在24 h 時(shí)與對照組差異顯著（P<0.05）；在48和96 h 時(shí)與對照組差異不顯著（P>0.05），這與本研究結(jié)果相似[32]。

Cr（Ⅵ）處理組的豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD 和CAT 活性在14 d 和21 d 都顯著低于對照組（P<0.05），表明2～3 周的Cr（Ⅵ）脅迫下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD 和CAT 活性被過度消耗，受到重度脅迫。Chen 等[33]在毒性研究中發(fā)現(xiàn)，在0.01 mg/L 的Cr（Ⅵ）對時(shí)斑馬魚（Danio rerio）發(fā)育畸形；魚體的抗氧化系統(tǒng)ROS、SOD 等抗氧化酶活性指標(biāo)都低于對照組，這與本研究結(jié)果相符。Cr（Ⅵ）處理組SOD和CAT 活性基本上都低于Cr（Ⅲ）處理組和對照組，表明Cr（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸幼魚的毒性要高于Cr（Ⅲ）。Kubrak 等[32]的Cr（Ⅲ）與Cr（Ⅵ）對金魚組織的急性（96 h，10 mg/L）暴露實(shí)驗(yàn)表明，兩種鉻離子都會在金魚肝臟和腎臟組織中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，且Cr（Ⅵ）處理下的SOD 和CAT 活性要低于Cr（Ⅲ）。本研究結(jié)果與Kubrak 等[32]描述的Cr（Ⅵ）與Cr（Ⅲ）對魚體的抗氧化酶活影響具有相似性。氧化應(yīng)激是緩解鉻毒性的關(guān)鍵機(jī)制。

3.2 Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟組織POD 活性和GSH 含量的影響

POD 存在于真核生物內(nèi)的H2O2酶體內(nèi)，能夠清除機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過氧化物等有害物質(zhì)，避免過氧化物在生物體內(nèi)累積[19]。輕度脅迫下POD會升高以抵御外界脅迫，而在重度脅迫下超出機(jī)體抵御能力則表現(xiàn)為POD 降低[17-19]。而GSH 可以與抗氧化酶協(xié)同作用清除活性氧及防御膜脂過氧化[34-36]。Cr（Ⅲ）可以與配合物絡(luò)合增強(qiáng)清除自由基的能力，發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用，如槲皮素-Cr（Ⅲ）絡(luò)合物[37]。本研究的Cr（Ⅲ）處理組的豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的POD 活性和GSH 含量都表現(xiàn)升高趨勢（圖3、圖4），這與低濃度下有毒物質(zhì)對抗氧化系統(tǒng)的增益作用有關(guān)[29]。本研究結(jié)果表明Cr（Ⅲ）的低毒性對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的抗氧化系統(tǒng)具有誘導(dǎo)作用，以增強(qiáng)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的抗氧化能力。

此外，Cr（Ⅵ）處理組POD 活性和GSH 含量基本上都低于Cr（Ⅲ）處理組和對照組，尤其是在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度時(shí)，Cr（Ⅵ）處理組與Cr（Ⅲ）處理組相比，POD 活性和GSH 含量差異極顯著（P<0.01），這與SOD 和CAT 活性結(jié)果一致。說明Cr（Ⅵ）處理抑制了豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的SOD、CAT、POD 活性和GSH 含量，而水相Cr（Ⅵ）的毒性顯然要高于對水相Cr（Ⅲ）。這與水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）暴露下對巴西本土魚（Piaractus mesopotamicus）的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[2]，該研究還指出Cr（Ⅵ）具有更高的毒性還會引起不可逆的病變；而Cr（Ⅲ）在推薦水平內(nèi)施用時(shí)，可以安全地用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

3.3 結(jié)論

本文研究了兩種價(jià)態(tài)的鉻（Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ））分別在三種濃度（0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L）下浸泡14 d 和21 d，對豹紋鰓棘鱸肝臟組織抗氧化酶活的影響。結(jié)果表明，暴露14 d 下Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）抑制肝臟抗氧化能力，但是暴露21 d 下Cr（Ⅲ）增強(qiáng)了肝臟抗氧化能力，Cr（Ⅵ）依舊為抑制作用且在較低的濃度下也會對豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟抗氧化能力產(chǎn)生一定程度的抑制影響，毒性大于Cr（Ⅲ）。本研究為區(qū)分不同價(jià)態(tài)鉻在不同暴露時(shí)間段鉻下對抗氧化機(jī)制影響的差異提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。