萊氏擬烏賊卵子發(fā)生的組織學(xué)觀察

王崢，劉長(zhǎng)琳，陳四清，金廣海，翟介明，林鈴生，葛建龍

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽(yáng) 111000；4.萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東 萊州 261418；5.福建省逸源水產(chǎn)科技有限公司，福建 漳州 363402）

萊氏擬烏賊Sepioteuthis lessoniana 隸屬軟體動(dòng)物門Mollusca、頭足綱Cephalopoda、槍形目Teuthida、槍烏賊科Loliginidae、擬烏賊屬Sepioteuthis，廣泛分布于紅海、西太平洋和印度洋等海域[1]，也是我國(guó)東南沿海常見(jiàn)捕撈水產(chǎn)品，年產(chǎn)量約200 t[2]。

闡明卵子發(fā)生過(guò)程和卵巢發(fā)育特征是頭足類繁殖生物學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，對(duì)保護(hù)頭足類自然資源、開(kāi)展人工繁育及自然資源調(diào)查等有重要意義。目前關(guān)于頭足類卵子分期發(fā)育特征的研究較多，主要集中在金烏賊Sepia esculenta[3,4]、曼氏無(wú)針烏賊Sepiella maindroni[5]、擬目烏賊Sepia lycidas[6]、福氏槍烏賊Loligo forbesi[7]、皮氏槍烏賊Loligo pealei[8]、長(zhǎng)蛸Octopus variabils[9]等，但未見(jiàn)關(guān)于萊氏擬烏賊卵子發(fā)生的研究報(bào)道。本研究采用組織學(xué)方法觀察了萊氏擬烏賊的卵子發(fā)生，依據(jù)卵母細(xì)胞大小、細(xì)胞核形態(tài)位置及濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，分析了解萊氏擬烏賊卵子發(fā)生各個(gè)時(shí)期的特征，以期豐富頭足類繁殖生物學(xué)內(nèi)容，及為萊氏擬烏賊的人工繁育提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年8 月在福建海域采用底拖網(wǎng)獲得體表無(wú)破損的野生雌萊氏擬烏賊性樣本7 尾，其中未性成熟的2 尾，平均胴長(zhǎng)（11.3±4.5）cm，平均體質(zhì)量為（210±43）g，性成熟的5 尾，平均胴長(zhǎng)為（19.2±6.4）cm，平均體質(zhì)量為（430±76）g。

1.2 石蠟切片樣品的制備

將萊氏擬烏賊沿腹部中線剪開(kāi)，將性腺切割，置于Bouin's 液中固定24 h，然后用70%酒精溶液沖洗樣品（間隔12 h），直至酒精溶液接近透明后保存在70%的酒精溶液。按照組織學(xué)研究方法[10]，對(duì)樣品進(jìn)行脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。使用KD-2508 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度約5 μm。石蠟切片經(jīng)脫蠟干燥、H.E 染色、中性樹(shù)膠封片后，置于Nikon 80i 正置顯微鏡下拍照并記錄分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵子發(fā)生分期

依照卵子的大小、細(xì)胞核的形態(tài)分布和濾泡細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征變化，將萊氏擬烏賊卵子發(fā)生過(guò)程分成4 個(gè)階段、9 個(gè)時(shí)期（表1），即卵原細(xì)胞階段（卵原細(xì)胞期）、原生質(zhì)生長(zhǎng)階段（無(wú)濾泡細(xì)胞期、單層濾泡細(xì)胞期和雙層濾泡細(xì)胞期）、間質(zhì)生長(zhǎng)階段（濾泡細(xì)胞增生初期、濾泡細(xì)胞增生中期和濾泡細(xì)胞增生晚期）和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)生長(zhǎng)階段（卵黃堆積期和成熟期）。

表1 萊氏擬烏賊卵子發(fā)生和結(jié)構(gòu)特征Tab.1 Characteristics of morphology and structure of eggs during oogenesis in Indo-Pacific oval squid Sepioteuthis lessoniana

2.1.1 卵原細(xì)胞階段

卵原細(xì)胞期 卵原細(xì)胞的形狀不規(guī)則，少數(shù)呈圓形或橢圓形，平均直徑為10.8～32.4 μm，細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞核較大。卵原細(xì)胞與濾泡細(xì)胞兩者分界明顯，濾泡細(xì)胞呈深藍(lán)色，分散分布在卵原細(xì)胞周圍（圖版Ⅰ-1）。

2.1.2 原生質(zhì)生長(zhǎng)階段

進(jìn)入原生質(zhì)生長(zhǎng)階段的卵原細(xì)胞，進(jìn)行第一次減數(shù)分裂發(fā)育成卵母細(xì)胞。此階段的卵母細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核增大，胞內(nèi)物質(zhì)增多。濾泡細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增多，包裹卵母細(xì)胞。根據(jù)濾泡細(xì)胞的狀態(tài)分為無(wú)濾泡細(xì)胞期、單層濾泡細(xì)胞期和雙層濾泡細(xì)胞期。

無(wú)濾泡細(xì)胞期 卵母細(xì)胞呈圓形或橢圓形，平均直徑為65.8～112.7 μm，細(xì)胞質(zhì)染色較深。細(xì)胞核呈圓形，平均直徑為32～50 μm，核膜邊界明顯且光滑，核內(nèi)染色質(zhì)呈網(wǎng)狀分布，卵母細(xì)胞周圍未見(jiàn)濾泡細(xì)胞（圖版Ⅰ-2）。

單層濾泡細(xì)胞期 卵母細(xì)胞體積增大，細(xì)胞近圓形，直徑約170.5～185.5 μm，細(xì)胞核呈橢圓形，直徑約65 μm，核膜明顯。此期，出現(xiàn)扁平狀的小型濾泡細(xì)胞，細(xì)胞核成深藍(lán)色，隨著濾泡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，單層排列的濾泡細(xì)胞包裹住卵母細(xì)胞，形成單層濾泡細(xì)胞期（圖版Ⅰ-3）。

雙層濾泡細(xì)胞期 卵母細(xì)胞體積繼續(xù)增大，形態(tài)不一，大多呈橢圓形，直徑在130.6～202.5 μm 之間，細(xì)胞核呈圓形，直徑約80 μm。此時(shí)的卵母細(xì)胞外包裹兩層濾泡細(xì)胞，濾泡細(xì)胞與卵母細(xì)胞分界明顯，內(nèi)層為橢圓形濾泡細(xì)胞，外層為扁平狀濾泡細(xì)胞，濾泡細(xì)胞間分界不明顯（圖版Ⅰ-4）。

2.1.3 間質(zhì)生長(zhǎng)階段

進(jìn)入間質(zhì)生長(zhǎng)階段的卵母細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞體積繼續(xù)增大，卵母細(xì)胞外的雙層濾泡細(xì)胞開(kāi)始向胞內(nèi)增生形成突起，直至充滿整個(gè)卵母細(xì)胞。根據(jù)卵母細(xì)胞大小和濾泡細(xì)胞向內(nèi)的折疊程度分成濾泡細(xì)胞增生初、中、晚3 個(gè)時(shí)期。

濾泡細(xì)胞增生初期 細(xì)胞呈圓形或橢圓形，平均直徑約230 μm，細(xì)胞核位于中間，呈圓形，直徑約95 μm。此期，濾泡細(xì)胞開(kāi)始向內(nèi)翻折，形成6 至8個(gè)指狀突起，突起長(zhǎng)度不等，變化在15～30 μm 之間（圖版Ⅰ-5）。

濾泡細(xì)胞增生中期 細(xì)胞呈圓形，平均直徑約250 μm，細(xì)胞核位于中間，呈圓形或橢圓形，直徑約100 μm。卵母細(xì)胞內(nèi)的指狀突起數(shù)量增多，一般為10～13 個(gè)，內(nèi)折程度更明顯，最長(zhǎng)約80 μm，橢圓形的內(nèi)層濾泡細(xì)胞體積增大，濾泡細(xì)胞與細(xì)胞質(zhì)之間出現(xiàn)明顯空隙（圖版Ⅰ-6）。

濾泡細(xì)胞增生晚期 卵母細(xì)胞呈橢圓形，卵徑約620.5～855.2 μm，細(xì)胞核呈圓形，直徑約115 μm，細(xì)胞核明顯偏向細(xì)胞一側(cè)。此期的卵母細(xì)胞繼續(xù)增長(zhǎng)，胞內(nèi)的指狀突起迅速延展，形成網(wǎng)狀的連接狀態(tài)。指狀突起以橢圓形內(nèi)層濾泡細(xì)胞為主，扁平狀的外層濾泡細(xì)胞消失（圖版Ⅰ-7）。

2.1.4 營(yíng)養(yǎng)質(zhì)生長(zhǎng)階段

卵母細(xì)胞進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)質(zhì)生長(zhǎng)階段后，細(xì)胞繼續(xù)增大。當(dāng)濾泡細(xì)胞占據(jù)整個(gè)細(xì)胞后，橢圓形濾泡細(xì)胞個(gè)體縮小，并逐漸解體，細(xì)胞核消失，指狀突起間的空隙有卵黃形成。根據(jù)濾泡細(xì)胞消失和卵黃出現(xiàn)的狀態(tài)分成卵黃堆積期和成熟期。

卵黃堆積期 細(xì)胞呈橢圓形并繼續(xù)增大，卵徑約1 512.5～1 818.9 μm，細(xì)胞核消失。胞內(nèi)的濾泡細(xì)胞解體，指狀突起界限模糊，突起間空隙逐漸增大，空隙間形成大量卵黃物質(zhì)（圖版Ⅰ-8）。

成熟期 細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞個(gè)體達(dá)到最大，卵徑約2 823.6～3 318.5 μm。胞內(nèi)幾乎充滿卵黃物質(zhì)，HE 染色呈橘紅色。此時(shí)期只有少數(shù)尚未解體的指狀突起，濾泡細(xì)胞染色較深，但不易分辨（圖版Ⅰ-9）。

圖版Ⅰ 萊氏擬烏賊卵子發(fā)生Plate Ⅰ Oogenesis in Indo-Pacific oval squid Sepioteuthis lessoniana

2.2 濾泡細(xì)胞的變化

卵母細(xì)胞進(jìn)入原生質(zhì)生長(zhǎng)階段后，單層濾泡細(xì)胞期的卵母細(xì)胞周圍生成扁平狀濾泡細(xì)胞，長(zhǎng)約9.5 μm（圖版Ⅱ-1）；進(jìn)入雙層濾泡細(xì)胞期后，內(nèi)層濾泡細(xì)胞呈橢圓形，直徑約7.4 μm，外層的扁平濾泡細(xì)胞直徑約為10 μm，兩種濾泡細(xì)胞間分界較明顯（圖版Ⅱ-2）；進(jìn)入間質(zhì)生長(zhǎng)階段后，濾泡細(xì)胞向內(nèi)翻折，橢圓形濾泡細(xì)胞直徑約9.7 μm，扁平濾泡細(xì)胞長(zhǎng)約7.5 μm（圖版Ⅱ-3），此后濾泡細(xì)胞繼續(xù)向內(nèi)翻折，濾泡細(xì)胞個(gè)體稍有縮小，橢圓形濾泡細(xì)胞直徑約8.8 μm，扁平濾泡細(xì)胞長(zhǎng)約7.3 μm（圖版Ⅱ-4）；當(dāng)指狀突起布滿卵母細(xì)胞后，濾泡細(xì)胞大小變化不大，而扁平濾泡細(xì)胞消失（圖版Ⅱ-5）；進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)質(zhì)生長(zhǎng)階段的濾泡細(xì)胞已不能區(qū)分，大多已解體（圖版Ⅱ-6）。

圖版Ⅱ 萊氏擬烏賊卵子發(fā)生過(guò)程中濾泡細(xì)胞的變化Plate Ⅱ The change in follicular cells during oogenesis in Indo-Pacific oval squid Sepioteuthis lessoniana

3 討論

3.1 萊氏擬烏賊卵子發(fā)生的特征

不同物種的卵子發(fā)生特征不同，卵母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的劃分標(biāo)準(zhǔn)也不同。但大多研究依據(jù)卵母細(xì)胞的個(gè)體大小、胞核形態(tài)位置、濾泡細(xì)胞形態(tài)變化等特征劃分發(fā)育時(shí)期。最早的研究將卵巢發(fā)育分成卵原細(xì)胞期、單層濾泡細(xì)胞期、卵黃泡期、卵黃充滿期、成熟期和退化期[3]。蔣霞敏等[5]最早將曼氏無(wú)針烏賊劃分成卵原細(xì)胞期、卵母細(xì)胞期、成熟期和退化期4 個(gè)時(shí)期；尹亞南[4]在郝振林研究的基礎(chǔ)上將金烏賊卵子發(fā)生更加細(xì)化，劃分為增生期、小生長(zhǎng)期、大生長(zhǎng)期、成熟期和退化吸收期5 個(gè)時(shí)期9 個(gè)時(shí)相。本研究參照以上及羅江等[6]對(duì)擬目烏賊卵子發(fā)生的研究，依據(jù)萊氏擬烏賊卵子發(fā)生過(guò)程中卵母細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞核大小和位置變化、濾泡細(xì)胞與卵母細(xì)胞的分布變化及卵黃變化等標(biāo)志特征，將萊氏擬烏賊卵子發(fā)生劃分為卵原細(xì)胞階段（卵原細(xì)胞期）、原生質(zhì)生長(zhǎng)階段（無(wú)濾泡細(xì)胞期、單層濾泡細(xì)胞期和雙層濾泡細(xì)胞期）、間質(zhì)生長(zhǎng)階段（濾泡細(xì)胞增生早期、濾泡細(xì)胞增生中期和濾泡細(xì)胞增生晚期）和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)生長(zhǎng)階段（卵黃堆積期和成熟期）4 個(gè)階段9 個(gè)時(shí)期。

萊氏擬烏賊卵子在卵原細(xì)胞階段和原生質(zhì)生長(zhǎng)階段胞體較小，進(jìn)入間質(zhì)生長(zhǎng)階段和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)生長(zhǎng)階段后細(xì)胞急劇增大。萊氏擬烏賊卵母細(xì)胞個(gè)體增大時(shí)期與其它頭足類大體一致，如金烏賊[4]、擬目烏賊[6]、曼氏無(wú)針烏賊[5]等，主要是濾泡細(xì)胞大量增生內(nèi)折以及卵黃物質(zhì)的產(chǎn)生等原因?qū)е?。但頭足類不同種類間達(dá)成熟期后卵子的大小也不同，其原因包括個(gè)體大小、繁殖周期和產(chǎn)卵策略等。細(xì)胞核也有明顯增大，持續(xù)至濾泡細(xì)胞增生中、晚期，細(xì)胞核最大直徑約110 μm，并隨著濾泡細(xì)胞內(nèi)折發(fā)生偏移，最終隨著濾泡細(xì)胞解體而消失，這與擬目烏賊[6]和皮氏槍烏賊[8]一致。萊氏擬烏賊屬于分批產(chǎn)卵類型，即親體在交配后一段時(shí)間內(nèi)可多次產(chǎn)卵，這與卵巢的組織切片結(jié)果一致，卵巢內(nèi)觀察到多個(gè)發(fā)育時(shí)期的卵母細(xì)胞。

3.2 濾泡細(xì)胞的形態(tài)變化和功能

濾泡細(xì)胞的出現(xiàn)、折疊變化規(guī)律是對(duì)卵子發(fā)生時(shí)期劃分的重要依據(jù)之一。關(guān)于濾泡細(xì)胞的來(lái)源主要有兩種解釋：（1）由卵巢內(nèi)的生殖細(xì)胞演化形成[11-13]；（2）由卵巢內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞分化形成[5,14-16]。受取樣條件限制，未取到早期卵巢樣品，尚不能確定萊氏擬烏賊卵巢內(nèi)濾泡細(xì)胞的來(lái)源，但結(jié)合多種頭足類卵巢濾泡細(xì)胞來(lái)源的研究[5,6,9,17]，認(rèn)為其卵巢內(nèi)濾泡細(xì)胞由基質(zhì)細(xì)胞分化形成。卵巢內(nèi)兩種濾泡細(xì)胞的大小和狀態(tài)處于動(dòng)態(tài)變化中，萊氏擬烏賊卵巢內(nèi)扁平濾泡細(xì)胞的形成和消失皆早于橢圓形濾泡細(xì)胞一個(gè)時(shí)期，且扁平濾泡細(xì)胞出現(xiàn)明顯的先增大后減小，這些與皮氏槍烏賊[8]和擬目烏賊[9]一致。

濾泡細(xì)胞在卵子發(fā)生過(guò)程中具有重要作用：（1）分泌物質(zhì)可形成卵膜，如曼氏無(wú)針烏賊和青鳉Oryzias latipes 的濾泡細(xì)胞的分泌物能形成卵子的次級(jí)卵膜[5,18,19,20]；（2）合成并分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如曼氏無(wú)針烏賊、金烏賊和擬目烏賊的濾泡細(xì)胞能合成并分泌卵黃物質(zhì)顆粒，證明濾泡細(xì)胞能分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4-6,21]；（3）促進(jìn)排卵，如南方鲇Silurus meridionalis 卵巢的濾泡細(xì)胞內(nèi)富含大量微絲，起到促進(jìn)排卵的功能[15]。萊氏擬烏賊卵巢內(nèi)濾泡細(xì)胞形成的指狀突起數(shù)量較多。當(dāng)這些濾泡細(xì)胞解體后，卵子

個(gè)體急劇增大，大量的卵黃物質(zhì)開(kāi)始形成。推測(cè)認(rèn)為，萊氏擬烏賊卵子內(nèi)的濾泡細(xì)胞同樣起到合成并分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用。