魚類干擾素調控因子（IRF）的抗病毒作用研究現(xiàn)狀及進展

姜曉娜，賈智英

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農業(yè)農村部淡水水產(chǎn)生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

在魚類中，病毒感染會引起許多宿主基因的表達，進而使機體對病毒產(chǎn)生抗性免疫反應，干擾素（interferon regulatory factor,IFN）是魚體受到病毒感染或細菌等因素下在受體細胞迅速反應并產(chǎn)生的一種具有高生物活性的糖蛋白[1]。IFN 與其同源受體（interferon regulatory factor receptor,IFNR）結合激活Jak-STAT 信號通路，Jak-STAT 信號轉導促進干擾素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISG）與多種ISG 的IFN 激活調控元件（interferon stimulation reaction element,ISRE）結合，進而誘導多種抗病毒基因的表達[2]，抑制病毒mRNA 翻譯，增加宿主細胞的抵抗力，在機體抗病毒免疫應答中起重要作用[3]。干擾素調控因子（interferon regulatory factor,IRF）作為參與IFN 抗病毒免疫反應中的重要轉錄調節(jié)因子，啟動IFN 的轉錄表達[4]。

1 IRF 家族

1988 年，IRF1（Homo sapiens）作為IRF 家族的第一個成員被發(fā)現(xiàn)，確定其具有啟動IFN 轉錄表達的作用[5]。迄今為止，脊椎動物鑒定出11 個IRF 家族成員，包括IRF1-11[6]，其中IRF10 為魚類和鳥類中特有，而IRF11 為硬骨魚特有[7,8]。根據(jù)C 端結構特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，IRF 家族可分為四個亞家族：IRF1 亞家族（包含IRF1、IRF2 和IRF11）、IRF3 亞家族（IRF3 和IRF7）、IRF4 亞家族（IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10）和IRF5 亞家族（IRF5 和IRF6），表明了IRF 家族基因在進化過程中的功能多樣性。IRF 家族成員是魚類先天抗病毒反應的主要調節(jié)因子，主要參與IFN 和ISG 的轉錄表達[9]。IRF 家族蛋白結構均含有一個高度保守的N 端DNA 結構域（DNA binding domain,DBD）和一個C 端IRF 相關結構域（IRF-associated domain,IAD）。DBD 具有5或6 個色氨酸重復元件的特征，可形成螺旋-轉角-螺旋結構，使IRF 蛋白能夠識別并結合在ISRE基因的啟動子中[10]。IAD 目前確定具有IAD1 和IAD2 兩種類型，其中IAD1 存在于所有IRF 中，IAD2 存在僅存在于IRF1 和IRF2 中[11]。IAD 保守性較低，能夠與其他IRF 成員相互作用形成轉錄復合物，激活每個IRF 成員特定的生物活性，調控不同IFN 或ISG 的轉錄表達[10]。

2 IRF 的抗病毒作用

2.1 IRF1 亞家族

IRF1 亞家族包括IRF1、IRF2、IRF11，其 中IRF1 為IRF 家族中最初定義為調控IFN 轉錄表達的調控因子[5]。IRF1、IRF2 和IRF11 在魚類組織呈現(xiàn)組成型表達[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物和硬骨魚類的主要先天免疫信號通路是相對保守的，在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)參與先天免疫反應的IRF1、IRF2 和IRF11基因，其中IRF11 與IRF1 和IRF2 的遺傳距離相等[5]。硬骨魚類中IRF1、IRF2 和IRF11 均含有5 或6 個高度保守的色氨酸殘基（NH2-X10-W-X14-WX11-W-X7-W-X11-W-18-W）[14]。此外，發(fā)現(xiàn)魚類中IRF1 基因和IRF11 基因均與IFN 基因啟動子的同一段DNA 序列結合，但結合偏好性有所不同[8,16]。IRF2 蛋白結構中IAD2 中的含有一個IRF1 蛋白不具有的反式激活域，以上均導致了IRF1、IRF2 和IRF11 的功能多樣性。

魚類中IRF1、IRF2 和IRF11 的表達調控及抗病毒作用機制存在差異。魚類中IRF1 是抗病毒反應調控IFN 轉錄表達的正調節(jié)因子[16]，受到病毒、poly（I:C）刺激后能誘導IFN 及ISG 的轉錄表達[6,14,16,17]，在虹鱒（Salmo playtcephalus）中還確定了IRF1a 的存在[18]。但魚類IRF2 對病毒的抗性調節(jié)有所不同，鯉（Cyprinus carpio）受嗜水氣單胞菌和poly（I:C）刺激后IRF2 基因能夠抑制IFN 基因和ISG 基因的表達，但能夠激活NF-κB 信號通路并促進MyD88 介導和β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白（TIRdomain-containing adoptor inducing interfere-β，TRIF）介導的NF-κB 產(chǎn)生[12]。草魚（Ctenopharyngodon idella）中IRF2 能夠與IFN 的啟動子結合下調IFN的轉錄活性[19]。然而IRF2 在卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）中正調控IFNa3 和IFNγ 的轉錄表達[20]。在大黃魚（Larimichthys crocea）中IRF2 能夠既誘導IFNd 和IFNh 啟動子活性，又抑制IFNc 啟動子活性，能夠抑制上皮細胞中鯉春病毒血癥病毒（infection with Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV）的復制[21]。魚類IRF11 是I 型IFN 的正調節(jié)因子，能夠在培養(yǎng)魚細胞中建立抗病毒狀態(tài)以抵抗病毒感染[8]，曾因與IRF1 高度同源被錯誤地認為是IRF1[22]，斑馬魚（Danio rerio）和翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）中發(fā)現(xiàn)IRF11 能通過正調控IFN 或ISGs 基因的轉錄表達發(fā)揮抗病毒作用[8,22]。此外，魚類中IRF1 和IRF2 和IRF11 除單獨發(fā)揮抗病毒作用外，也互相協(xié)同或拮抗來調控IFN 或ISG 的轉錄表達進而使機體產(chǎn)生抗病毒免疫反應。大西洋鮭（Salmo salar）和草魚中均確定IRF2 能通過與IRF1 拮抗作用來作為IFN 和ISG 的負調控因子[19]。斑馬魚中IRF1 基因在病毒感染和poly（I:C）刺激后的表達倍增水平高于IRF11 基因，IFNγ 能夠誘導IRF1 基因的表達而與IRF11 基因的表達及啟動子活性無關[8,16]。

2.2 IRF3 亞家族

IRF3 亞家族包括IRF3 和IRF7，IRF3 和IRF7被作為是病毒感染細胞的主要調節(jié)因子，參與機體抗病毒防御反應[23]，因此在魚類中IRF3 和IRF7 的相關機制研究較為廣泛。目前IRF3 和IRF7 基因已在多種魚類中得到驗證，且均在組織呈現(xiàn)組成型表達[24,25]。IRF3 和IRF7 均包含三個結構域，分別為N端DBD、C 端IAD 和富含絲氨酸的結構域（serine-rich domain,SRD），IAD 參與除IRF1 和IRF2 外的其他IRF 的交互作用，DBD 是負責與IRF 元件結合的核心部位，IRF3 和IRF7 的結構域通過與基因調控區(qū)內的DNA 序列相互作用以調控自身轉錄[26]。此外，研究發(fā)現(xiàn)虹鱒IRF3 的DBD 區(qū)域包含五種色氨酸，但IRF7 僅含有4 種，且IRF3 主要存在于細胞質中并被病毒、ploy（I：C）和脂多糖（Liposome,LPS）激活，而IRF7 僅能被病毒激活[27-29]。在機體受病毒感染后，模式識別受體（Pattern recognition receptor,PRR）啟動信號轉導并激活Tank 結合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）來磷酸化IRF3 和IRF7 蛋白C 端富含絲氨酸區(qū)域的絲氨酸或蘇氨酸殘基，隨后磷酸化的IRF3 進入細胞核并介導IFN-α 和IFN-β以及其他IFN 誘導基因的轉錄[30,31]。

魚類和哺乳動物共享相同或相似的IFN 激活信號通路，IRF3 和IRF7 是機體應對可變致病性感染的信號級聯(lián)的核心參與者，對IFN 轉錄表達調節(jié)起關鍵作用[32]。大西洋鮭中髓樣分化因子（myeloiddifferentiationfactor88,MyD88）與IRF3 相互作用正向調節(jié)IFN 轉錄表達[33]。大黃魚中IRF3 能夠減弱核因子kappaB 抑制蛋白（nuclear factor kappa-B,IκBα 對核因子（nuclear factor kappa-B,NF-κB）活化的抑制作用[34]。病原體誘導宿主IRF3 表達正向調節(jié)MyD88 介導硬骨魚NF-κB 信號通路轉導[35]。然而趙雪妍等發(fā)現(xiàn)IRF3 在硬骨魚中負調控TRIF 介導的NF-κB 信號通路[36]。鯽（Carassius auratus）和斑馬魚受病毒感染后IRF7 基因參與IFN基因轉錄表達及磷酸化反應過程，是機體抗病毒反應的主要調控因子[37,38]。當細胞受到病毒感染后，IRF7 基因啟動IFNI 基因的轉錄并誘導ISG 基因表達以保護細胞免受病毒感染[28]。研究發(fā)現(xiàn)青魚（Mylopharyngodon piceus）受到草魚呼腸孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）和SVCV 感染后IRF3/7 基因在機體抗病毒免疫反應中發(fā)揮至關重要的作用[39]。IRF3/7 基因在尖吻鱸（Lates calcarifer）和虹鱒中均發(fā)現(xiàn)能夠誘導IFN、ISGs 基因和促炎因子的表達，在IFN 介導的抗病毒免疫反應中的發(fā)揮重要作用[ 40 ]。

2.3 IRF4 亞家族

IRF4 亞家族包括IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10。目前IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10 基因已在多種硬骨魚中被克隆完成[41]。硬骨魚中IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10 在組織中呈現(xiàn)組成型表達，且主要在富含淋巴細胞的組織中高表達[41,42]，IRF4 和IRF8、IRF9 和IRF10 蛋白均含有DBD 和IAD，不同的是除IRF10外，均含有一或兩個核定位信號（nuclea rlocalization signal,NLS），這些信號與IRF 在末端區(qū)域的核易位和保留有關[43]。IRF4 和IRF8 和IRF10 的DBD 區(qū)域均含有5 個色氨酸殘基，但IRF9 只有三個。IRF4 對靶基因轉錄調控和識別是通過形成與其他蛋白質或轉錄因子相互作用的二聚體來定義的[44]，IRF4 在進化上存在明顯的差異，該蛋白中富含絲氨酸的結構域目前僅在斑馬魚、河豚（Tetraodontidae）、青鳉（Oryzias latipes）、斑石鯛（Oplegnathuspunctatus）和斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）中存在，而在非洲爪蟾（Xenopus laevis）、虹鱒和亞洲沼澤鰻（Monopterus albus）中不存在。IRF8 通常與識別靶基因啟動子中的Ets-IRF-E 復合元件（ETS-IRF-E composite element,EICE）的Ets 家族成員PU.1/Spi-1相互作用以發(fā)揮其轉錄調節(jié)作用[45]。IRF9 能夠與信號轉導與轉錄激活因子1 和2（signal transducer and activator of transcription,STAT1-STAT2）異二聚體的結合后加強對ISRE 的特異性識別[46]，IRF10 蛋白結構在硬骨魚中相對保守，其中DBD 結構是IRF10發(fā)揮功能是不可或缺的[47]。

IRF4 和IRF8 在硬骨魚中能夠被poly（I:C）、LPS 和各種細菌和病毒誘導，參與機體抗病毒免疫反應，最近研究發(fā)現(xiàn)IRF4 在斑馬魚、河豚和青鳉中存在兩個IRF4 旁系物（IRF4a 和IRF4b），受到GCRV 和SVCV 刺激后表達水平顯著提高[41]。卵形鯧鲹IRF8 基因能夠在體外上調IFNr 基因的表達[48]。草魚IRF8 基因下調IFN1 基因的表達[49]，（Miichthys miiuy）IRF8 基因下調MyD88 和MyD88介導的NF-κB 信號通路的表達，以防止體外過度免疫損傷[33]。在病毒微生物入侵鯽時，宿主中IFNs誘導STAT1 與IRF9 形成ISGF3 復合物，激活ISGs的轉錄以抵抗病毒入侵[50]。硬骨魚中IRF10 基因被病毒、poly（I：C）、細菌、LPS 等刺激下上調表達[85,105-108]。牙鲆（Paralichthys olivaceus）感染細菌或病毒出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）后IRF10 基因在腎臟組織中表達量升高，但斑馬魚和斜帶石斑魚中發(fā)現(xiàn)IRF10 為干擾素轉錄表達的負調節(jié)劑[51]。在大西洋鱈（Gadus morhua（Linnaeus,1758））和斜帶石斑魚中發(fā)現(xiàn)IRF10 基因具有兩個剪切體，在魚類抗病毒免疫反應中發(fā)揮功能有所不同[47]。IRF4 基因能夠在斜帶石斑魚的抗病毒反應中抑制抗粘性病毒基因（myxovims resistant 1,Mx1）的啟動子活性，促進病毒復制[51]。然而在鯉上皮瘤細胞（Epitheliomacells,EPC）細胞缺失IRF9 會抑制Mx1 和ISG15 的表達[52]。歐洲沼澤鰻被poly（I:C）、LPS 刺激后能夠誘導IRF4 和IRF10 基因的表達[41]。

2.4 IRF5 亞家族

IRF5 亞家族包含IRF5 和IRF6，目前IRF5 基因已在多種硬骨魚中報道[53-55]，而IRF6 基因目前在魚類中僅在斑馬魚、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、膨腹海馬（Hippocampus abdominalis）和團頭魴（Megalobrama amblycephala）中被發(fā)現(xiàn)[56]。IRF5 和IRF6 基因在硬骨魚組織中均呈現(xiàn)組成型表達，但表達水平因組織而異，IRF5 基因在鰓、頭腎和脾臟等免疫組織中有更高水平的表達[54]。IRF5 蛋白結構包括DBD、中間域（middle region,MR）、IAD、病毒激活域（viral activation domain,VAD），N 末端和C 末端含有在病毒感染細胞中發(fā)揮了至關重要的作用[43,54]，IRF6 蛋白的C 端IAD 參與抗病毒免疫反應[57]。

IRF5 可以在硬骨魚受到病毒、細菌感染后產(chǎn)生的抗病毒和抗菌反應中發(fā)揮作用[53-55]。IRF5 基因在草魚中參與LPS 誘導的IFN 信號通路，參與宿主先天免疫反應[58]。IRF5 基因能夠在卵形鯧鲹中正向調控IFNI、腫瘤壞死因子受體相關蛋白6（tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6）、Mx1、ISG15、毒蛇毒素（Viperin1）和Viperin2 抗病毒因子的表達[59]。魚類IRF6 是干擾素轉錄的正調節(jié)因子，并能夠被MyD88 和TBK1 磷酸化，進而參與抗病毒免疫反應[60]。斑馬魚中IRF6 能夠減少細胞中SVCV 病毒的復制，在膨腹海馬中IRF6 基因直接參與了宿主抗病毒防御機制，半滑舌鰨和團頭魴中IRF6 基因在細菌感染后肝臟、脾臟和頭腎組織中均顯著上調[16,56,60]。目前IRF5 基因在硬骨魚抗病毒免疫反應中的作用已被證實，但IRF6 基因在大多數(shù)魚類中的功能尚不清晰。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)魚類中存在相對保守IFN 天然抗病毒免疫系統(tǒng)[61]，而IRF 作為調控IFN 功能的主要轉錄因子，當前魚類中IRF 的功能研究多集中于表達及抗病毒免疫反應，且均在體外使用魚細胞系進行的[4-6]。盡管IRF 家族蛋白結構較為保守，能夠識別相似的DNA 序列，但每個IRF 都有不同的功能角色，其中C 端的IAD 的不同決定了家族成員的功能多樣性[57]。研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物和魚類中IRF數(shù)量均有所不同，其中家族成員IRF1-9 均保守存在但功能有所不同，IRF10 僅在魚類和鳥類中報道，IRF11 在魚類中特有[22]，表明IRF 家族成員在進化過程中可能相對獨立。此外，魚類中IRF 家族成員雖均為組成型表達，但在不同組織的表達具有差異性。如在卵形鯧鲹、鯉等中IRF5 基因在已知的富含淋巴細胞的組織（如頭腎和鰓）中表達豐富，而在肝臟、血液、脾臟和肌肉中較差，在斑馬魚中IRF5 基因在肌肉和卵巢中高表達[54,55]；IRF1 基因和IRF2基因在虹鱒的肝臟中不表達，推測不同硬骨魚中IRFs表達模式差異的原因可能是由于魚類的多種免疫系統(tǒng)導致[55]。

盡管魚類IRF 與哺乳動物的IRF 是同源的，但研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物和魚類相同IRF 家族成員在病毒感染過程中發(fā)揮功能有所不同，如哺乳動物中IRF3 組成型表達，而魚類IRF3 是典型的ISG，通過IFN 或病毒刺激而上調；哺乳動物IRF4 通過與IRF5 競爭與MyD88 相互作用而成為IFN 表達的負調節(jié)因子[62]，而魚類IRF4 可以作為正調節(jié)因子促進IFN 的轉錄[41]；IRF6 在哺乳動物中不受IFN 表達影響，魚類中IRF6 是IFN 轉錄的正調節(jié)因子[60]。盡管魚類IRF 的大部分功能在哺乳動物中是保守的，但仍然存在一些魚類特有的功能，需進一步體內研究數(shù)據(jù)支撐。

哺乳動物IRF1/3/5/7/9 主要在抗病毒免疫反應的調節(jié)中起激活劑的作用，而IRF4 起負調節(jié)劑的作用[62]。然而魚類中IRF1/3/6/7/9/11 主要作為轉錄激活因子不斷發(fā)揮作用，而IRF2/4/5/8/10 是雙功能因子，根據(jù)靶基因激活或抑制轉錄來發(fā)揮功能[63]。IRF2 屬于一類多功能轉錄因子，其在轉錄抑制或激活中的特定作用取決于細胞類型和炎癥狀態(tài)[10]，草魚IRF2 能夠與IFN 的啟動子結合下調IFN 基因的轉錄活性[19]，而卵形鯧鲹IRF2 基因正調控IFNa3和IFNγ 基因的轉錄表達[20]，而在青鳉中發(fā)現(xiàn)IRF2基于表達的持續(xù)時間而具有抗病毒或促進病毒復制的雙面性[64]。IRF3 既可以通過促進IκBα 降解來增強NF-κB 的活性[34]，又能夠負調控TRIF 進而抑制的NF-κB 信號通路[36]。魚類IRF8 具有多種功能，是IFN1 表達的負調節(jié)因子。在體外試驗中，IRF8 基因能夠在體外上調IFNr 基因的表達[48]，也能抑制NF-κB 信號通路的激活，以防止體外過度免疫損傷[33]。在斑馬魚和斜帶石斑魚中IRF10 基因能夠抑制IFNφ1 和IFNφ3 基因啟動子的激活，并負調控魚類抗病毒基因的表達，這是硬骨魚中IFN反應的獨特調節(jié)機制[47]。

4 問題與展望

顯然，哺乳動物和魚類中IRF 家族成員的作用和作用的多樣性需要一些澄清，尤其是關于IRF 家族成員在病毒或細菌感染后的免疫反應中所起的作用以及IRF 家族成員個數(shù)等的不同。當前越來越多的魚類IFN 負調節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)，說明魚類也存在一個龐大而復雜的IFN 反應平衡系統(tǒng)，保證了免疫的相對平衡，防止過度免疫造成嚴重損害，進一步研究IRF 家族的功能有助于促進魚類IFN 抗病毒免疫機制的理解。