肺泡灌洗液MP-DNA聯(lián)合血清特異性免疫球蛋白M檢測(cè)在兒童肺炎支原體感染診斷中的價(jià)值研究

【摘要】 目的 研究肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）" MP-DNA聯(lián)合血清特異性免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）檢測(cè)在兒童肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）感染診斷中的價(jià)值。方法 回顧性分析2019年1月—2022年1月于東阿縣人民醫(yī)院治療的116例MP感染患兒的臨床資料。患兒入院后24 h內(nèi)采集外周靜脈血2 mL并立即送檢，于入院后24～48 h經(jīng)喉罩或氣管插管將支氣管鏡置入氣管、支氣管內(nèi)，獲取BALF放置細(xì)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并快速送檢，分別進(jìn)行血清MP-IgM檢測(cè)、BALF MP-DNA檢測(cè)。對(duì)比BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項(xiàng)及聯(lián)合診斷MP效果。結(jié)果 BALF MP-DNA與血清MP-IgM聯(lián)合診斷MP陽性率（92.24%）高于BALF MP-DNA（77.59%）與血清MP-IgM（46.55%）單項(xiàng)診斷MP陽性率，BALF MP-DNA診斷MP陽性率高于血清MP-IgM檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)論 BALF MP-DNA聯(lián)合血清MP-IgM檢測(cè)診斷MP感染陽性率較高，可為MP感染早期診斷及用藥治療提供參考。

【關(guān)鍵詞】 肺炎支原體感染；肺泡灌洗液MP-DNA；免疫球蛋白

中圖分類號(hào)：R725" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-1721（2023）32-0070-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.32.024

肺炎支原體（MP）是學(xué)齡期兒童和青少年社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的主要病原體，需住院治療的肺炎患兒中MP感染占20%左右。近年來MP感染率有逐年上升趨勢(shì)，且少數(shù)MP感染所致的肺炎病程長(zhǎng)，癥狀嚴(yán)重，往往出現(xiàn)肺外表現(xiàn)，甚至遺留肺部損傷，重者危及生命[1]，故盡早診斷MP感染并進(jìn)行早期治療顯得尤為重要。MP感染早期肺部體征不明顯，臨床癥狀及胸部影像學(xué)檢查缺乏特異性，故明確診斷MP感染往往需要依賴病原學(xué)檢查。血清MP-IgM的測(cè)定方法簡(jiǎn)單且耗時(shí)較短，MP-IgM一般在感染后7～10 d內(nèi)才會(huì)出現(xiàn)，在體內(nèi)留存時(shí)間長(zhǎng)，但在早期輕度感染、存在免疫系統(tǒng)缺陷、發(fā)育不完善的患者中可能無MP-IgM抗體產(chǎn)生[2]。近年來，支氣管鏡檢查在兒科領(lǐng)域不斷應(yīng)用，通過支氣管鏡進(jìn)行氣道及肺泡灌洗，可從支氣管肺泡灌洗液（BALF）中獲取病原學(xué)及炎癥細(xì)胞分類等多種信息，為某些肺部疾病的診斷提供信息[3]。鑒于此，本研究探討了BALF MP-DNA聯(lián)合血清特異性IgM檢測(cè)在兒童MP感染診斷中的價(jià)值，以期為臨床早期診治MP感染提供指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年1月—2022年1月于東阿縣人民醫(yī)院治療的116例MP感染患兒的臨床資料?；純褐心行?7例，女性49例；年齡1～13歲，平均年齡（6.57±1.20）歲。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒臨床資料完整；患兒伴有呼吸道感染癥狀，且MP培養(yǎng)呈陽性；能夠耐受支氣管鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并先天性心臟病；合并出血性疾病；存在免疫缺陷或其他原發(fā)疾病、慢性疾??；合并哮喘、肺結(jié)核及慢性肺疾病等。

1.3 方法 支氣管鏡檢查及BALF留取的相關(guān)注意事項(xiàng)：向患兒家屬告知檢查的必要性及相關(guān)注意事項(xiàng)，詢問患兒家屬既往病史、近日是否有用藥史，核實(shí)有無檢查禁忌證，檢查前完成心電圖、凝血功能及血分析等相關(guān)檢查。術(shù)前6 h禁食、2 h禁水，詢問有無麻醉藥物過敏史，包括咪達(dá)唑侖、丙泊酚等，手術(shù)當(dāng)天完成血清特異性IgM檢測(cè)，告知患兒家屬在支氣管鏡檢查結(jié)束后至少留觀1 h。為了避免污染標(biāo)本，檢查中嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免對(duì)患兒氣道造成不必要的傷害，操作者要注意操作動(dòng)作。

標(biāo)本采集：患兒入院后24 h內(nèi)采集外周靜脈血2 mL并立即送檢，同時(shí)在患兒入院24～48 h經(jīng)喉罩、氣管插管將支氣管鏡置入氣管、支氣管內(nèi)，支氣管鏡到達(dá)病變處后，經(jīng)內(nèi)鏡工作孔道注入37 ℃ 0.9%氯化鈉注射液，通過負(fù)壓100～200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的吸引器吸引獲取BALF至細(xì)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并快速送檢，均為全麻下支氣管鏡檢查灌洗。

血清特異性IgM的檢測(cè)：采用1∶10歐蒙吸附劑稀釋患者樣本，以2 000 r/min離心5 min。加樣，即將歐蒙配套的加樣板放置在其支撐的泡沫板上，取30 μL稀釋后的樣本放于加樣板的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)區(qū)上；溫育，即從冰箱內(nèi)提前取出生物載片，恢復(fù)至室溫后撕開封袋，手持生物載片的兩端，將生物載片有生物薄片的一面朝下，載片左下邊沿有一凹進(jìn)卡槽可與加樣板上相對(duì)應(yīng)凸起設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)，凹槽緊密對(duì)合，將生物載片蓋在加有樣本的反應(yīng)板上，基質(zhì)完全浸泡于樣本中，室溫避光條件下溫育30 min；沖洗，即從反應(yīng)板上取下生物載片，沖洗載片上殘存的樣本，再將生物載片放置玻片放置槽內(nèi)，緩沖液浸泡5 min，浸泡時(shí)基質(zhì)面朝上，或立起，2張生物載片應(yīng)間隔放置，加熒光二抗，同第一步加樣相同，取30 μL FITC標(biāo)記的熒光二抗加至潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)，取出浸泡5 min的生物載片，再用吸水紙擦去生物載片背面和4個(gè)邊緣的水分，后迅速蓋于熒光二抗上，與加樣板上相對(duì)應(yīng)的凹槽緊密對(duì)合，室溫避光溫育30 min，再次沖洗浸泡；封片，即取出浸泡好的生物載片并用吸水紙去除多余的水分，同上步，后將基質(zhì)面朝上平放至工作臺(tái)，在各個(gè)反應(yīng)區(qū)滴加10 μL封片介質(zhì)，蓋玻片蓋上。

血清特異性IgM的結(jié)果判定：在熒光顯微鏡下判讀，主要在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)產(chǎn)生顆粒細(xì)到粗的滴狀熒光，根據(jù)感染的嚴(yán)重程度不同，在一些細(xì)胞中可出現(xiàn)細(xì)到粗顆粒狀熒光，感染比較嚴(yán)重的細(xì)胞可產(chǎn)生粗的滴狀熒光，有些部位可見平滑的熒光。

肺泡灌洗液MP-DNA的檢測(cè)：主要采用恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法，即DNA在65 ℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈的雙鏈結(jié)構(gòu)就會(huì)解離成單鏈。根據(jù)靶序列的封閉區(qū)域設(shè)計(jì)其特異的引物，MP的檢測(cè)選擇6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)出4條特異引物，包括2條內(nèi)引物和2條外引物，在DNA聚合酶的作用下，在恒定溫度下DNA不斷復(fù)制擴(kuò)增，其反應(yīng)過程包括啞鈴狀模板合成、循環(huán)擴(kuò)增、伸長(zhǎng)和再循環(huán)3個(gè)重要階段，最終形成DNA片段混合物。采用碟式芯片技術(shù)（博奧生物集團(tuán)設(shè)計(jì)生產(chǎn)），根據(jù)需要檢測(cè)的病原體種類、各病原體的特定檢測(cè)區(qū)域，每張碟式芯片上設(shè)有多個(gè)反應(yīng)池，根據(jù)檢測(cè)需要特異每個(gè)反應(yīng)池包埋固定一套引物用于一種病原體的特異核苷酸靶序列的擴(kuò)增與檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行前處理及DNA提取，加入擴(kuò)增試劑與提取的DNA混合后注入芯片，并通過離心方式均勻分配到各個(gè)反應(yīng)池。

肺泡灌洗液MP-DNA的判定標(biāo)準(zhǔn)：芯片的各個(gè)反應(yīng)池相對(duì)獨(dú)立，并同時(shí)進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，在擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)的收集檢測(cè)，某反應(yīng)池若檢測(cè)到熒光信號(hào)的變化則能及時(shí)捕獲，將熒光信號(hào)的強(qiáng)弱記錄在擴(kuò)增過程的時(shí)間軸上，若熒光信號(hào)增強(qiáng)，各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)形成的擴(kuò)增曲線繪成標(biāo)準(zhǔn)的“S”形，提示該反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的特異病原體的特異核苷酸靶序列為擴(kuò)增陽性。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 對(duì)比BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項(xiàng)及聯(lián)合診斷MP效果，其中聯(lián)合診斷中BALF MP-DNA與血清MP-IgM中任意一項(xiàng)陽性即可判斷為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項(xiàng)及聯(lián)合診斷MP效果：BALF MP-DNA+血清MP-IgM聯(lián)合診斷MP陽性率高于BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項(xiàng)診斷MP陽性率，BALF MP-DNA診斷MP陽性率高于血清MP-IgM檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

3 討論

MP是目前所發(fā)現(xiàn)的最小原核微生物，它缺乏細(xì)胞壁，對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞有較高的親和性，MP主要通過飛沫經(jīng)呼吸道進(jìn)行傳播，全年均可發(fā)病，但以秋冬季較多，學(xué)齡期兒童的MP感染率較高[4]。MP感染不僅會(huì)引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病，還會(huì)誘發(fā)心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等肺外系統(tǒng)的損害[5]。近年來，隨著重癥或難治性的支原體肺炎的發(fā)生率不斷升高，引起了兒內(nèi)科醫(yī)師的廣泛關(guān)注，故實(shí)時(shí)、高效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法是診斷MP感染的主要依據(jù)。支原體感染早期治療至關(guān)重要，但目前尚不能通過臨床或影像學(xué)表現(xiàn)明確區(qū)分MP、衣原體肺炎以及病毒性肺炎[6]。

目前MP實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病原培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、免疫色譜測(cè)試（in-circuit test，ICT）及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)等[7]。MP培養(yǎng)被認(rèn)為是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6周的要求，讓專門的培養(yǎng)基和訓(xùn)練有素的技術(shù)人員限制了MP培養(yǎng)在臨床實(shí)踐中的使用[8]。病原體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生，是當(dāng)前臨床中使用最為廣泛的MP檢測(cè)方法，目前主要檢測(cè)IgA、IgM、IgG。MP-IgM是MP感染后機(jī)體最早產(chǎn)生的抗體，在感染MP后的1周可出現(xiàn)IgM抗體并在血中可檢測(cè)到，3～4周后達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，并可持續(xù)數(shù)月[9]。但MP-IgM的出現(xiàn)與多種因素有關(guān)，可能由于早期MP-IgM抗體水平不足，或患兒免疫功能低下，不足以產(chǎn)生足夠的抗體，導(dǎo)致早期診斷時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，故臨床單獨(dú)檢測(cè)血清MP-IgM具有一定的局限性。近年來電子支氣管鏡在臨床診療中不斷應(yīng)用，支氣管肺泡灌洗（BAL）已成為治療呼吸系統(tǒng)疾病的重要手段，有利于直觀觀察病變部位，并可進(jìn)行鉗夾、局部注藥，通過BAL促進(jìn)黏稠分泌物的排出[10]。同時(shí)還可直接采集灌洗液標(biāo)本進(jìn)行免疫學(xué)及病原學(xué)的檢查，獲取細(xì)胞學(xué)、可溶性蛋白酶類、細(xì)胞因子及生物活性介質(zhì)等多種信息，為診斷肺部感染性疾病等肺部疾病提供參考[11]。本次研究結(jié)果顯示，BALF MP-DNA+血清MP-IgM聯(lián)合診斷MP陽性率高于BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項(xiàng)診斷MP陽性率，BALF MP-DNA診斷MP陽性率高于血清MP-IgM檢測(cè)。提示BALF MP-DNA+血清MP-IgM聯(lián)合診斷MP陽性率較高，能夠彌補(bǔ)BALF MP-DNA與血清MP-IgM單項(xiàng)診斷MP的不足，臨床診斷MP感染證據(jù)更為充分，為臨床早期診斷MP感染提供雙重依據(jù)，使MP早期診斷及正確選擇抗生素治療成為可能。BAL手術(shù)簡(jiǎn)便、患兒耐受性好且并發(fā)癥少見，檢測(cè)結(jié)果不受機(jī)體免疫、年齡及感染程度的影響，有利于早期準(zhǔn)確檢測(cè)到MP感染[12]。但由于BALF獲取標(biāo)本方式屬于有創(chuàng)操作，臨床應(yīng)用受到了一定的限制。

綜上所述，學(xué)齡期兒童的MP感染率最高，采用BALF MP-DNA聯(lián)合血清MP-IgM檢測(cè)可提高M(jìn)P感染診斷陽性率，降低MP感染的漏診率，為MP感染早期診斷及用藥治療提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]" "李偉玲，唐代煒，陳麗麗，等.肺炎支原體肺炎患兒血清維生素A、E水平及其與肺外并發(fā)癥的相關(guān)性[J].廣西醫(yī)學(xué)，2021，43（14）：1695-1699.

[2]" "LEE H Y，SUL S，LEE J Y，et al.Comparison of nucleic acid amplification and IgM tests for the diagnosis of mycoplasma pneumoniae infection in children during a recent korean outbreak[J].Lab Med，2021，52（2）：181-187.

[3]" "龐衛(wèi)花，劉永濤，曹智麗，等.支原體肺炎患兒肺泡灌洗液MP-DNA載量、免疫炎性指標(biāo)與治療效果的關(guān)系研究[J].河北醫(yī)藥，2020，42（6）：857-860.

[4]" "CHOO S，KIM S H，LEE E.Clinical significance of Mycoplasma pneumoniae specific IgM titer in children hospitalized with Mycoplasma pneumoniae pneumonia[J].BMC Infect Dis，2022，22（1）：470.

[5]" "杜春艷，張妮妮，江遜.小劑量與常規(guī)劑量糖皮質(zhì)激素輔助治療小兒難治性肺炎支原體肺炎合并肺外并發(fā)癥臨床效果及安全性觀察[J].貴州醫(yī)藥，2021，45（7）：1097-1098.

[6]" "張寧，陸東明，顧猛.肺炎支原體抗體IgG、IgM和DNA檢測(cè)在兒童呼吸道感染中的診斷價(jià)值[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2020，17（10）：1398-1400.

[7]" "顧婷婷，尚莉麗.基于血清抗體檢測(cè)分析2017—2019年合肥地區(qū)支氣管肺炎患兒肺炎支原體感染的單中心流行病學(xué)特征[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2021，38（9）：839-841.

[8]" "許華，熊麗丹，文鵬.單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞檢測(cè)、顆粒凝集法、膠體金法診斷兒童肺炎支原體感染的價(jià)值比較[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2020，24（17）：19-23.

[9]" "HE X T，WANG C C.Applying clinical and laboratory features associated with Mycoplasma pneumoniae （Mp）infection with the new diagnostic test of mp-specific Immunoglobulin M （IgM） antibody-secreting cells to Mp-IgM seroconversion in mp-positive children with community-acquired pneumonia[J].Clin Infect Dis，2021，73（5）：937-938.

[10]" "鄧曉慧，田巍，葛曉竹，等.纖維支氣管鏡吸痰聯(lián)合肺泡灌洗對(duì)高齡慢性阻塞性肺疾病合并重癥肺炎患者的療效觀察[J].中國醫(yī)藥，2021，16（4）：535-539.

[11]" "劉宇焓，張晗，尚云曉.難治性肺炎支原體肺炎患兒肺泡灌洗液中肺炎支原體-DNA載量檢測(cè)在病情評(píng)估中的臨床意義[J].中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2020，27（6）：447-451.

[12]" "陳丹，張娜麗，張婷，等.難治性肺炎支原體肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液中肺炎支原體耐藥基因檢測(cè)分析[J].中國當(dāng)代兒科雜志，2021，23（7）：707-712.