基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)探討銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化的作用機(jī)制

摘要目的：借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，聯(lián)合分子對(duì)接及基因表達(dá)芯片分析驗(yàn)證，探討銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化的作用機(jī)制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)篩選銀杏葉-葶藶子的有效成分和靶點(diǎn)，通過(guò)人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）獲取心肌纖維化的靶點(diǎn)。將有效成分靶點(diǎn)與心肌纖維化靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、STRING平臺(tái)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，再利用Cytoscape自帶的網(wǎng)絡(luò)分析工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，分析獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)通過(guò)R軟件進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析。最后利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并利用AutoDock軟件進(jìn)行有效成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接，Pymol軟件繪制分子對(duì)接模式圖驗(yàn)證核心靶點(diǎn)。結(jié)果：通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得藥物有效成分39個(gè)，篩選出有效成分作用靶點(diǎn)116個(gè)，心肌纖維化靶點(diǎn)3 322個(gè)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析獲得轉(zhuǎn)錄因子P65（RELA）、雄性激素受體（AR）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1）、腫瘤蛋白質(zhì)P53（TP53）、核因子-κB（NF-κB）抑制劑α（NFKBIA）等關(guān)鍵靶點(diǎn)。GO分析主要涉及對(duì)化學(xué)應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)、對(duì)類(lèi)固醇激素反應(yīng)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活動(dòng)、泛素蛋白連接酶等過(guò)程，KEGG富集分析主要有脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路（MAPK）等信號(hào)通路?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)分析驗(yàn)證表明，前6個(gè)核心靶點(diǎn)中，AR、RELA、TP53、NFKBIA、PTGS1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。分子對(duì)接結(jié)果顯示主要活性成分與靶點(diǎn)均能自發(fā)結(jié)合且大部分結(jié)合能力良好。結(jié)論：銀杏葉-葶藶子可能通過(guò)NF-κB、MAPK、PI3K/AKT信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，抑制成纖維細(xì)胞相關(guān)增殖和活化過(guò)程，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而發(fā)揮延緩心肌纖維化作用。

關(guān)鍵詞心肌纖維化；銀杏葉；葶藶子；絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路；核因子-κB；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；基因表達(dá)

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.004

Ginkgo Biloba and Lepidii Semen Alleviate Myocardial Fibrosis Based on Network Pharmacology Combined with Gene Expression Omnibus Chip Analysis

HUANG Hao， YU Guangbin， CHEN Li， GU Jianhao， HONG Yongdun

Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangdong 510006， Guangzhou， China

Corresponding AuthorHONG Yongdun， E-mail： hongyongdun@163.com

AbstractObjective：To explore the mechanism of the Chinese herb ginkgo biloba and lepidii semen alleviate myocardial fibrosis based on network pharmacology analysis，molecular docking and gene expression omnibus（GEO） chip analysis and verification. Methods：The pharmacologic database and analysis platform of traditional Chinese medicine system were used to screen the effective ingredients and targets of ginkgo biloba and lepidii semen.The target of myocardial fibrosis was obtained by GeneCards and online Mendelian inheritance in man（OMIM）.The effective ingredients and myocardial fibrosis targets were introduced into Cytoscape 3.8.0 software to construct drug-ingredient-target network.The STRING platform builded protein-protein interaction（PPI） networks.The network analysis tools-Cytoscape was used to calculate network topology parameters，analyze and obtain key targets.The intersection targets were analyzed by R software for gene ontology（GO） enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment.The chip data of GEO was used for data analysis，and the molecular docking of effective ingredients and core targets was carried out by AutoDock software，and the molecular docking model diagram was drawn by Pymol software to verify the core targets.Results：Thirty nine effective ingredients were obtained，116 active ingredient action targets and 3 322 myocardial fibrosis targets were screened.Key targets such as transcription factor P65（RELA），androgen receptor（AR），prostaglandin G/H synthase 1（PTGS1），tumor protein P53（TP53），and nuclear factor-κB（NF-κB） inhibitor α（NFKBIA） were identified by network topology analysis.GO enrichment analysis mainly involved cellular response to chemical stress，response to steroid hormones，DNA binding transcription factor binding，nuclear receptor activity，ubiquitin protein ligase，and other processes.KEGG enrichment analysis mainly included lipid and atherosclerosis，phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/total protein kinase B（AKT） signaling pathway and mitogen-activated protein kinase（MAPK） signaling pathway，and other pathways.GEO gene chip analysis and verification showed that AR，RELA，TP53，NFKBIA，and PTGS1 were significantly different among the first 6 core targets（P＜0.05）.The results of molecular docking showed that the main effective ingredients and the target could spontaneously bind and most of the binding ability was better.Conclusion：Ginkgo biloba and lepidii semen shows anti-inflammatory and anti-oxidative stress effects through NF-κB，MAPK signaling pathway and PI3K/AKT signaling pathway，and other signaling pathways，by inhibiting fibroblast related proliferation and activation process，reducing extracellular matrix deposition，thereby alleviating myocardial fibrosis.

Keywordsmyocardial fibrosis; ginkgo biloba; lepidii semen; mitogen-activated protein kinase signaling pathway; nuclear factor-κB; network pharmacology; gene expression

心肌纖維化是眾多心血管疾病的病理基礎(chǔ)，主要涉及成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、心肌成纖維細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積等過(guò)程，影響心肌信號(hào)傳導(dǎo)及收縮功能，可誘發(fā)心律失常、心力衰竭和猝死等疾?。?］。近年來(lái)，改善心肌纖維化預(yù)防和治療心血管疾病的研究日益增多，但集中于西藥開(kāi)發(fā)，禁忌證多且副作用大，臨床尚缺乏針對(duì)治療心肌纖維化的特效用藥。中藥作為我國(guó)的醫(yī)學(xué)瑰寶，禁忌證少且不良反應(yīng)小，有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)，可能為延緩心肌纖維化提供新的思路和方法。心肌纖維化屬中醫(yī)“心痹”“伏梁”等范疇，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)、久病入絡(luò)，治療上應(yīng)以調(diào)虛補(bǔ)實(shí)、活血化瘀、溫陽(yáng)解毒為法［2］。銀杏葉既能活血化瘀、通絡(luò)止痛，又能斂肺平喘、化濁降脂；葶藶子瀉肺平喘、行水消腫。兩藥配伍，一緩一峻，標(biāo)本兼治，正對(duì)心肌纖維化病機(jī)，從而延緩心肌纖維化進(jìn)展［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，銀杏葉、葶藶子都具有抑制心室重塑、保護(hù)心肌等作用，通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad蛋白（TGF-β1/Smad）信號(hào)通路的活化和抑制下游蛋白合成，減少心肌成纖維細(xì)胞的增殖及外基質(zhì)蛋白沉積，發(fā)揮延緩心肌纖維化的作用［4-6］。在臨床上，兩者對(duì)應(yīng)提取物常用于治療心血管疾病，研究表明，兩者可延緩心肌纖維化，藥理作用上具有潛在相輔相成機(jī)制，兩藥合用可能具有協(xié)同作用，比單藥藥效強(qiáng)［3-6］，但目前尚缺乏針對(duì)銀杏葉-葶藶子配伍延緩心肌纖維化的研究報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從藥物、化學(xué)成分、靶點(diǎn)、疾病間相互作用的整體性與系統(tǒng)性出發(fā)，預(yù)測(cè)藥物治療疾病的藥理學(xué)機(jī)制，與中醫(yī)的“整體觀”理論及中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用特點(diǎn)具有一致性［7］。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的驗(yàn)證大多基于文獻(xiàn)驗(yàn)證、分子對(duì)接等手段，雖然有借助細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，但并不能完全反映臨床實(shí)際情況?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）隸屬于美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心，是世界上存儲(chǔ)高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)較全面的開(kāi)源數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄了大量真實(shí)臨床樣本基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，能夠更加可靠、準(zhǔn)確、高效地反映疾病的本質(zhì)特征和規(guī)律。本研究擬采用分子對(duì)接聯(lián)合基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，從分子水平及基因水平對(duì)銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化的潛在機(jī)制進(jìn)行雙重驗(yàn)證，并探究基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證的可行性。

1資料與方法

1.1藥物有效成分及靶點(diǎn)的檢索及篩選

為了保證數(shù)據(jù)的可靠性、規(guī)范性及合理性［8］，本研究選擇公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）。以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，獲取銀杏葉、葶藶子的有效成分，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充。再利用TCMSP預(yù)測(cè)模型獲得藥物有效成分的作用靶點(diǎn)。

1.2疾病靶點(diǎn)的篩選

以“myocardial fibrosis”為檢索詞，分別在人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）進(jìn)行關(guān)鍵詞檢索，將獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重，獲得心肌纖維化的疾病靶點(diǎn)。將檢索得到的心肌纖維化靶點(diǎn)與藥物有效成分靶點(diǎn)通過(guò)R軟件合并處理，取交集繪制韋恩圖。

1.3藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將銀杏葉-葶藶子的有效成分、藥物與疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中，剔除孤立的有效成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，獲得藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape自帶的網(wǎng)絡(luò)分析工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（degree）、介度中心性（betweenness centrality）及緊密度中心性（closeness centrality）對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時(shí)將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中，限定物種為人類(lèi)，取最低互作閾值為0.4，獲取蛋白之間相互作用的關(guān)系數(shù)據(jù)，繪制對(duì)應(yīng)蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4基因本體（GO）富集分析與京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）分析

將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)通過(guò)R軟件的ClusterProfiler包進(jìn)行GO分析和KEGG分析，以P＜0.05和Q＜0.05作為篩選條件，獲得具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物過(guò)程和靶點(diǎn)通路并繪制相關(guān)的柱狀圖。

1.5數(shù)據(jù)驗(yàn)證

1.5.1利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證

選用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE97358芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，該芯片數(shù)據(jù)包含168例人體心肌成纖維細(xì)胞樣本的基因測(cè)序數(shù)據(jù)，其中84例為對(duì)照組，84例為原對(duì)照組基礎(chǔ)上經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的心肌纖維化組。通過(guò)歸一法算法（robust multi-array average，RMA）背景校正及矩陣數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，剔除表達(dá)量為0的基因。獲取藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度值排名前6位的核心靶點(diǎn)及核因子-κB（NF-κB）抑制劑α（NFKBIA）的表達(dá)量（NFKBIA為已知心肌纖維化核心通路抑制靶點(diǎn)），經(jīng)Log2處理后，根據(jù)分組信息將對(duì)照組與心肌纖維化組進(jìn)行數(shù)據(jù)表達(dá)差異分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.2利用分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證

選擇度值排名前6位的有效成分作為配體，經(jīng)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的核心靶點(diǎn)作為受體，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載有效成分及靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的文件，采用Autodock軟件進(jìn)行分子模擬對(duì)接。

2結(jié)果

2.1藥物有效成分及靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP中檢索獲得化合物375個(gè)，剔除重復(fù)后共獲得39個(gè)有效成分（見(jiàn)表1），獲得藥物作用靶點(diǎn)2 815個(gè)，通過(guò)與有效成分進(jìn)行比對(duì)，剔除重復(fù)后獲得116個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.2心肌纖維化靶點(diǎn)的篩選

共獲得3 322個(gè)疾病靶點(diǎn)。將藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得87個(gè)交集基因靶點(diǎn)（見(jiàn)圖1），為銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化的潛在靶點(diǎn)。

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物的有效成分、藥物與疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中，剔除孤立的節(jié)點(diǎn)，獲得藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2），包含102個(gè)節(jié)點(diǎn)、562條邊，其中，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)有87個(gè)，有效成分節(jié)點(diǎn)12個(gè)。利用Cytoscape的網(wǎng)絡(luò)分析工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，其中排名前6位的有效成分為槲皮素（quercetin，度值＝136），山柰酚（kaempferol，度值＝68），木犀草素（luteolin，度值＝68），β-谷甾醇（beta-sitosterol，度值＝48），異鼠李素（isorhamnetin，度值＝37），豆甾醇（stigmasterol，度值＝24）。排名前20位的靶點(diǎn)信息見(jiàn)表2。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將87個(gè)交集基因?qū)隨TRING平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，取最低相互作用閾值為0.4，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。把PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，經(jīng)過(guò)分析獲得網(wǎng)絡(luò)平均度值為20.5，排名前10位的靶點(diǎn)分別為T(mén)P53（度值＝59）、IL6（度值＝58）、HSP90AA1（度值＝52）、CASP3（度值＝51）、ESR1（度值＝50）、PPARG（度值＝49）、HIF1A（度值＝48）、MYC（度值＝47）、EGFR（度值＝46）、CCND1（度值＝42），度值越大，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)是關(guān)鍵成分或關(guān)鍵靶點(diǎn)的可能性越大。詳見(jiàn)圖3。

2.5GO分析和KEGG分析

經(jīng)過(guò)GO功能富集分析獲得1 464個(gè)條目，其中包含生物過(guò)程（BP）1 318個(gè)、細(xì)胞組分（CC）39個(gè)、分子功能（MF）106個(gè)。按P-adjust值從小到大選取每個(gè)分類(lèi)的前10個(gè)條目繪制柱形圖（見(jiàn)圖4）。BP主要涉及對(duì)化學(xué)應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)、酮類(lèi)響應(yīng)、對(duì)氧氣水平反應(yīng)、對(duì)類(lèi)固醇激素反應(yīng)等；CC則涉及脂筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、基底質(zhì)膜等；MF涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活動(dòng)、泛素蛋白連接酶結(jié)合等。經(jīng)過(guò)KEGG富集分析共獲得140條通路，按富集到通路上的靶點(diǎn)數(shù)目選取排名前20條的通路繪制氣泡圖（見(jiàn)圖5），其中，最主要的有與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的通路、化學(xué)致癌-受體活化、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路（MAPK）、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染等。

2.6利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證

在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GSE97358芯片數(shù)據(jù)中，獲取網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前6位的核心靶點(diǎn)和NFKBIA的表達(dá)量，根據(jù)分組信息進(jìn)行表達(dá)差異分析（見(jiàn)圖6）。結(jié)果表明，TP53、PTGS1在心肌纖維化組呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明TP53、PTGS1可能在心肌纖維化的形成過(guò)程中起到促進(jìn)作用；RELA、AR、NFKBIA在心肌纖維化組呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明RELA、AR、NFKBIA可能在心肌纖維化形成過(guò)程中起到抑制作用。而IKBKB在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.48），由于缺少CHRNA7的表達(dá)數(shù)據(jù)，因此未能對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.7利用分子對(duì)接驗(yàn)證

利用AutoDock軟件對(duì)度值排名前6位的有效成分與RELA、AR、PTGS1、TP53、CHRNA7、NFKBIA進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示分子與靶點(diǎn)最低結(jié)合能均＜5.0 kJ/mol，表明配體與受體均可進(jìn)行自發(fā)結(jié)合（見(jiàn)圖7）。最低結(jié)合能≤－5.0 kJ/mol即表明藥效分子與蛋白對(duì)接效果良好，結(jié)合能越低，表明分子與蛋白結(jié)合能力越強(qiáng)，其中，木犀草素的結(jié)合能均＜－5.0 kJ/mol，結(jié)合能力最強(qiáng)。作為度值最高的有效成分，槲皮素與AR、PTGS1、TP53、CHRNA7、NFKBIA的結(jié)合能均＜－5.0 kJ/mol，結(jié)合能力較強(qiáng)。TP53、CHRNA7、NFKBIA與6個(gè)有效成分結(jié)合能力均良好，尤以NFKBIA的結(jié)合能力最強(qiáng)。

本研究先選取結(jié)合能最低的有效成分與核心靶點(diǎn)在Pymol軟件繪圖，繪圖時(shí)發(fā)現(xiàn)某些有效成分與核心靶點(diǎn)無(wú)法形成氫鍵（如β-谷甾醇與RELA、豆甾醇與TP53等），因此，選擇能夠形成氫鍵的有效成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行繪圖（見(jiàn)圖8）。大部分有效成分都能形成氫鍵，結(jié)合能力尚可，以木犀草素結(jié)合能力最強(qiáng)。

NFKBIA，即NF-κB抑制劑α，研究表明NF-κB是促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路［1］。本研究選其抑制劑NFKBIA與有效成分進(jìn)行分子對(duì)接繪圖以驗(yàn)證有效成分能否抑制NF-κB通路的信號(hào)傳導(dǎo)。如圖9所示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇與NFKBIA的結(jié)合能力均良好，尤以異鼠李素結(jié)合能力最強(qiáng)。

心肌纖維化作為多種心血管疾病的共同病理表現(xiàn)，可誘發(fā)心律失常、心力衰竭、心源性猝死等心血管疾?。?］。據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020概要》［9］顯示，我國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，推算心血管病現(xiàn)患人數(shù)約3.30億人，其死亡率仍居首位，平均每5例死亡病人中就有2例死于心血管疾病，遠(yuǎn)高于腫瘤及其他疾病，給經(jīng)濟(jì)和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，針對(duì)改善心肌纖維化預(yù)防和改善心血管疾病的研究日益增多，研究表明，賴(lài)諾普利、氯沙坦、維立西呱對(duì)延緩心肌纖維化可能有一定獲益，但研究樣本量較少，存在諸多禁忌證和不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用存在一定限制［10-12］。中醫(yī)藥在預(yù)防和治療心血管疾病中發(fā)揮了重要作用，禁忌證少且不良反應(yīng)小，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)。銀杏葉具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂之功效；葶藶子瀉肺平喘、行水消腫，兩藥配伍，一緩一峻，標(biāo)本兼治，正對(duì)心肌纖維化病機(jī)，暗示其延緩心肌纖維化的作用［3］。

現(xiàn)代藥理研究表明，銀杏葉能通過(guò)下調(diào)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的活化，抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖，延緩心肌纖維化［4］；Li等［5］研究顯示，銀杏葉提取物通過(guò)抑制TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2、MMP9的表達(dá)減輕心肌細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而改善小鼠的心室重構(gòu)。相關(guān)臨床研究也進(jìn)一步表明，銀杏葉能逆轉(zhuǎn)慢性心力衰竭病人的心室重塑，改善心肌功能，對(duì)于延緩心肌纖維化有一定療效［6］。研究發(fā)現(xiàn)，葶藶子具有抑制心室重塑、保護(hù)心肌細(xì)胞等藥理作用，可明顯抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成增加，同時(shí)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，下調(diào)TGF-β1蛋白mRNA表達(dá)，延緩心肌纖維化的發(fā)展［13］。李敏［14］研究顯示，葶藶子可通過(guò)MAPK信號(hào)通路下調(diào)心肌細(xì)胞中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、p38及應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）的磷酸化水平，抑制心肌成纖維細(xì)胞活化，從而發(fā)揮延緩心肌纖維化作用。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法獲得銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化有效成分共39個(gè)，涉及抗氧化、抗炎、保護(hù)心臟等藥理作用。槲皮素作為度值最高的有效成分，藥理作用廣泛。研究表明，槲皮素可清除自由基和超氧銀離子，發(fā)揮抗氧化作用，減輕H2O2介導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，下調(diào)心肌NF-κB表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)心臟［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素的應(yīng)用能明顯上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）的表達(dá)，促進(jìn)NF-κB復(fù)合物RelA/p65亞基去乙?；?，抑制其與NF-κB啟動(dòng)子結(jié)合，干擾NF-κB通路傳導(dǎo)，發(fā)揮延緩心肌纖維化的作用［16-17］。木犀草素具有抗氧化、抗炎等作用，通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗纖維化作用［18-19］；山柰酚、異鼠李素均具有抗炎、抗氧化、降血脂等作用，可通過(guò)多種藥理作用抑制成纖維細(xì)胞增殖和活化途徑，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，延緩心肌纖維化，發(fā)揮保護(hù)心臟的作用，揭示了銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化具有多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)［20-22］。

本研究篩選出核心靶點(diǎn)87個(gè)，如AR、RELA、PTGS1、ESR1、NFKBIA、IKBKB等。AR、ESR1為雄激素及雌激素受體，研究表明，雄激素治療能增加心排血量，減少炎癥介質(zhì)，減輕左心室纖維化；而雌激素治療可以抑制血管損傷反應(yīng)，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)心血管也有保護(hù)作用［23-24］。上述激素作用都需要對(duì)應(yīng)受體的介導(dǎo)，AR、ESR1作為對(duì)應(yīng)受體，在保護(hù)心血管方面發(fā)揮了重要中介效應(yīng)［25］。RELA也稱(chēng)NF-κB/p65，為活化的NF-κB，其與p50的異二聚體是NF-κB通路最豐富的復(fù)合物［26］。研究表明，RELA參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過(guò)程，并誘發(fā)心室重塑，與心功能分級(jí)呈正相關(guān)［27-28］。而NFKBIA、IKBKB能通過(guò)屏蔽核定位信號(hào)將復(fù)合物易位于細(xì)胞質(zhì)中，抑制NF-κB/REL復(fù)合物的活性，阻斷上述途徑［25］。此外，Zhu等［29］研究發(fā)現(xiàn)，敲除PTGS1基因后，對(duì)心臟有保護(hù)作用的前列腺素E2表達(dá)會(huì)受到抑制，表明PTGS1對(duì)心臟可能有間接保護(hù)作用。本研究還通過(guò)對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GSE97358芯片進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)TP53、PTGS1在心肌纖維化組中呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明TP53、PTGS1可能促進(jìn)了心肌纖維化的形成過(guò)程；RELA、AR、NFKBIA在心肌纖維化組呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明RELA、AR、NFKBIA可能在心肌纖維化形成過(guò)程中起到抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的結(jié)論。

GO分析顯示，銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化主要通過(guò)對(duì)化學(xué)應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)、酮類(lèi)響應(yīng)、對(duì)類(lèi)固醇激素反應(yīng)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活動(dòng)、泛素蛋白連接酶結(jié)合等生物過(guò)程發(fā)揮作用，而這些過(guò)程與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展有著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，KEGG富集分析表明，脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、化學(xué)致癌-受體活化、PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡是銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化的主要通路。研究表明，MAPK信號(hào)通路及PI3K/AKT信號(hào)通路是涉及心肌纖維化的重要通路，與GO分析結(jié)果相互印證，是心肌纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)［29-31］。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化的作用機(jī)制，從藥物有效成分、疾病靶點(diǎn)相應(yīng)關(guān)系出發(fā)，構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，獲得一系列可能作用于緩解心肌纖維化的成分、靶點(diǎn)、通路。與其他同類(lèi)型研究相比，本研究立意于心肌纖維化，以期從病理角度探討心血管疾病的防治；采取基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，能夠更加可靠、準(zhǔn)確、高效地反映疾病本質(zhì)特征和規(guī)律，更好地反映臨床情況，驗(yàn)證本研究觀點(diǎn)。結(jié)果顯示，銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化主要基于抗氧化、抗炎、下調(diào)NF-κB、TGF-β1/Smads等相關(guān)通路和功能實(shí)現(xiàn)，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。本研究結(jié)果為銀杏葉-葶藶子延緩心肌纖維化的作用機(jī)制研究提供了參考，為臨床延緩心肌纖維化提供了新思路及新方法，但結(jié)論基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)，雖然采用了分子對(duì)接及基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)雙重驗(yàn)證，但文中相關(guān)數(shù)據(jù)基于已有數(shù)據(jù)庫(kù)，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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（收稿日期：2022-05-29）

（本文編輯鄒麗）