湖南新化多花黃精葉枯病病原鑒定及室內(nèi)毒力測(cè)定?

摘 要：為明確湖南新化多花黃精葉枯病病原菌種類組成及其致病力情況，采用組織分離法對(duì)19份多花黃精葉片病樣進(jìn)行分離、培養(yǎng)和純化，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，并通過離體葉片接種法對(duì)所獲得的菌株進(jìn)行致病力測(cè)定。結(jié)果表明：引起湖南省新化縣多花黃精葉枯病的病原菌為間座殼屬（Diaporthe）的Diaporthe hongkongensis、Diaporthe tulliensis和Diaporthe eres 這3個(gè)種；其中Diaporthe hongkongensis的致病力最強(qiáng)，Diaporthe eres次之，Diaporthe tulliensis的致病力最弱。選取了5種常見藥劑采用生長速率法對(duì)Diaporthe hongkongensis進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。結(jié)果表明：5種供試藥劑的EC50值大小表現(xiàn)為25%嘧菌酯懸浮劑＞32.5%苯甲–嘧菌酯懸浮劑＞75%百菌清可濕性粉劑＞10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑＞5%己唑醇懸浮劑，其中對(duì)該病菌毒力最強(qiáng)的殺菌劑為5%己唑醇懸浮劑，其EC50值為8.932 mg/L。綜上所述，湖南新化的多花黃精葉枯病是由間坐殼屬真菌侵染引起的，5%己唑醇懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)該病菌的殺菌效果較好，可作為防治藥劑。

關(guān)鍵詞：多花黃精；葉枯??；間座殼屬；鑒定；致病力測(cè)定；室內(nèi)毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S435.672 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）04-0061-05

Abstract：This study aims to clarify the pathogen composition of leaf blight of Polygonatum cyrtonema and their pathogenicities in Xinhua County of Hunan Province. Nineteen diseased leaf samples were isolated， cultured and purified by tissue separation method; the isolates were identified by morphological and molecular biological methods; and the pathogenicity of the isolates and their pathogenicity differences were determined by the inoculation method of in vitro leaves. The results showed that the pathogens were Diaporthe hongkongensis， Diaporthe tulliensis and Diaporthe eres of Diaporthe based on morphological characteristics and comparative analysis of gene sequences of 28S rDNA-ITS， β-tubulin and EF-1α. Among them， Diaporthe hongkongensis had the strongest pathogenicity， followed by Diaporthe eres， and Diaporthe tulliensis was the weakest. Thereafter 5 kinds of ordinary fungicides were selected for indoor toxicity test of Diaporthe hongkongensis by the growth rate method. The toxicity test result showed that EC50 values of the five tested agents ranked as azoxystrobin 25% SC gt; difenoconazole-azoxystrobin 32.5% SCgt; chlorothalonil 75% WP gt; difenoconazole 10% WG gt; hexaconazole 5% SC， among which hexaconazole 5% SC had the strongest toxicity to the pathogen， and its EC50 value was 8.932 mg/L. In sum， the leaf blight of Polygonatum cyrtonema in Xinhua County of Hunan Province is caused by infection of Diaporthe. Both hexaconazole 5% SC and" difenoconazole 10% WG" have good control effect on mycelial growth of the pathogen and can be used as control agents.

Key words：Polygonatum cyrtonema; leaf blight; Diaporthe; identification; pathogenicity determination; laboratory toxicity test

多花黃精（Polygonatum cyrtonema）為百合科黃精屬植物，是2020年版《中國藥典》中中藥黃精的基源植物之一，已有2000 a以上的藥用歷史，俗稱姜形黃精，為中國藥食同源植物[1]。多花黃精作為藥材時(shí)，以黃精多糖、甾體皂苷為主要有效成分，具有調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)免疫力、改善記憶以及抗衰老抗炎抗病毒抗腫瘤等作用，臨床上常用于治療冠心病、高血脂、糖尿病、高血壓、慢性支氣管炎、缺血性中風(fēng)等疾病[2-3]。隨著黃精藥用價(jià)值的不斷挖掘，其市場需求量不斷增加，野生黃精已難以滿足市場需求，目前市售的黃精主要以人工栽培的為主。

湖南新化是黃精的道地產(chǎn)區(qū)，其種植面積已近2 000 hm2。隨著當(dāng)?shù)攸S精產(chǎn)業(yè)發(fā)展，“新化黃精”已注冊(cè)中國地理標(biāo)志證明商標(biāo)，新化也被國家林學(xué)會(huì)授予“中國黃精之鄉(xiāng)”的稱號(hào)[4]。黃精在栽培過程中常受到葉斑病、炭疽病、根腐病等的侵害，發(fā)病率高，嚴(yán)重影響藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。遲惠榮[5]采用組織分離法對(duì)感病黃精植株進(jìn)行分離、鑒定，認(rèn)為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）可以導(dǎo)致葉枯病。鄒娟等[6]從分離后病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征、內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)（ITS）和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較等方面進(jìn)行了分析，認(rèn)為黃精葉斑病病原菌為草莖點(diǎn)霉（Phomaherbarum）。此外，黃精葉片病害中已報(bào)道交鏈孢菌（Alternaria sp.）可引起葉斑病[7]，鏈格孢屬可引起黑斑病[8]，刺盤孢屬真菌（Colletotrichum sp.）可引起炭疽病[9]。目前，國內(nèi)尚無對(duì)新化多花黃精葉枯病的相關(guān)研究，引發(fā)該病的病原菌尚不明確。為了探明新化多花黃精葉枯病的病原菌，筆者采集了病株樣品，進(jìn)行微生物分離、純化和鑒定，同時(shí)調(diào)查了多花黃精葉枯病害在湖南新化的發(fā)生、危害和流行規(guī)律，以期為黃精葉枯病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于湖南省婁底市新化縣天龍山農(nóng)林科技開發(fā)有限公司黃精種植區(qū)采集典型葉枯病病葉，病斑大小約0.5 cm，病斑中央為灰白色，邊緣為褐色，外有淡黃色暈圈。采集典型葉枯病樣品19份，裝入自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的分離純化 采用組織分離法[10]取患病多花黃精葉片，用75%乙醇擦拭表面并干燥，在病健交界處切下5 mm×5 mm小塊，于超靜工作臺(tái)用1%次氯酸鈉消毒1 min，再用無菌水沖洗3次，用濾紙干燥后接種到PDA平板，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，在水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上進(jìn)行單孢純化，將純化后獲得的菌株保存在PDA斜面上，置4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原微生物形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化的病原微生物接種到PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)箱中光照14 h、黑暗10 h培養(yǎng)10 d后，對(duì)菌落形態(tài)、色澤、大小以及分生孢子的特征進(jìn)行觀察，測(cè)量分生孢子梗、分生孢子的大小等指標(biāo)。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，挑選代表菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d，采用DNA提取試劑盒提取病原物DNA，采用引物ITS1/ITS4[12]、Beta-2a/Beta-2b[13]和EF1-983F/EF1-728F進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）25 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 20 μL至最終體積為50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，54～58℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。將不同引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后的基因序列經(jīng)校正后，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列（BLAST）搜索，比較供試菌株與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的同源程度。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 致病性測(cè)定 采用離體葉片接種法[11]進(jìn)行致病性測(cè)定。以健康多花黃精的離體葉片為材料，用滅菌的大頭針從葉片背面刺傷邊緣，然后分別用5 mm的打孔器打取不同病原菌PDA菌餅，放至葉片刺傷部位，有菌絲的一面緊貼傷口，每片葉接種4個(gè)菌餅，以接種無菌PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每個(gè)菌株3次重復(fù)。離體葉片接種后放置于鋪有保濕濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，葉柄處放置濕潤無菌棉花包裹保濕。將接種的多花黃精葉片置于人工氣候箱中28℃培養(yǎng)，逐日觀察記錄接種葉片的發(fā)病情況。

1.2.5 室內(nèi)毒力測(cè)定 選取致病力強(qiáng)的菌株，采用菌絲生長速率法對(duì)致病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。5種供試試劑分別為5%己唑醇懸浮劑、75%百菌清可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、25%嘧菌酯懸浮劑、32.5%苯甲–嘧菌酯懸浮劑。預(yù)試驗(yàn)后確定處理濃度設(shè)5個(gè)梯度，分別為稀釋500、1 000、2 000、4 000、8 000倍，用無菌水進(jìn)行稀釋。采用5 mm的打孔器打取病原菌PDA菌餅，置于PDA平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落縱橫直徑，計(jì)算相對(duì)抑菌率。以不同稀釋倍數(shù)藥劑濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)菌絲抑制率換算轉(zhuǎn)換的概率值作為縱坐標(biāo)，求出毒力回歸方程，并計(jì)算EC50和相關(guān)系數(shù)。

相對(duì)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

從19份黃精葉枯病病樣中分離得到5株分離物，分別為4Psl1-1、H-HJl3-2、H-HJl3-3、H-HJl4-6、H-HJl5-3（表1、圖1A～J）。經(jīng)近紫外線照射法誘導(dǎo)產(chǎn)孢[14]后，病原菌在顯微鏡下觀察有2種分生孢子，α型孢子無色，單孢，橢圓形至卵圓形，有2個(gè)明顯的油滴，大小為（5.8～8.6）μm ×（1.9～2.6）μm（圖1K）；β型孢子無色，單孢，呈線條形，一端呈鉤狀，無油滴，大小為（20～25）μm ×（0.4～1.3）μm（圖 1L）。根據(jù)形態(tài)特征5株分離物均初步鑒定為間座殼屬（Diaporthe）。

2.2 分子鑒定

提取分離菌株的DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各菌株的DNA片段約為2 000 bp。利用ITS、β-tubulin和EF-1α這3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得大小約為550、820、330 bp的清晰條帶。將5個(gè)典型菌株的28S rRNA ITS序列登錄NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，登錄號(hào)分別為MZ617453.1、MZ617454.1、MZ617455.1、MZ618642.1、MZ618643.1，采用MEGA 7.0軟件的自展法（bootstrap）對(duì)其和數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)明確的相關(guān)菌株基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。3株代表菌株（4Psl1-1、H-HJl4-6、H-HJl3-2）與Diaporthe hongkongensis聚在同一分支上，親緣關(guān)系最近；1株代表菌株（H-HJl5-3）與Diaporthe eres聚在同一分支上，親緣關(guān)系最近；1株代表菌株（H-HJl3-3）與Diaporthe tulliensis聚在同一分支上，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，該試驗(yàn)分離獲得的5株典型菌株分別被鑒定為Diaporthe hongkongensis、Diaporthe eres和Diaporthe tulliensis。

2.3 分離菌株的致病性測(cè)定

健康多花黃精葉片接種分離菌株4 d后，接種點(diǎn)處出現(xiàn)棕色水漬狀病斑；接種5 d后，病斑沿接種點(diǎn)處上下擴(kuò)展，形狀不規(guī)則，病斑呈棕褐色（圖3A～C），接種發(fā)病癥狀與多花黃精田間自然發(fā)病較為一致（圖3E～F），無傷接種及 PDA 瓊脂塊對(duì)照接種枝條均未發(fā)病（圖3D）。同時(shí)，從試驗(yàn)結(jié)果還可看出，不同菌種之間的致病力存在差異，以Diaporthe hongkongensis 的致病力最強(qiáng)，其次是Diaporthe eres，最后是Diaporthe tulliensis。將病菌進(jìn)行再分離，原接種菌株和再分離菌株的形態(tài)學(xué)特征、分子生物學(xué)序列一致，表明原菌株是多花黃精葉枯病的致病病原菌。

2.4 室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

選擇代表菌株Diaporthe hongkongensis進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果如表2所示，5種供試藥劑的EC50值大小表現(xiàn)為25%嘧菌酯懸浮劑＞32.5%苯甲–嘧菌酯懸浮劑＞75%百菌清可濕性粉劑＞10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑＞5%己唑醇懸浮劑；其中，5%己唑醇懸浮劑的殺菌效果最好，EC50值為8.932 mg/L；25%嘧菌酯懸浮劑的殺菌效果最差，EC50值為922.941 mg/L；Diaporthe hongkongensis對(duì)5%己唑醇懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、32.5%苯甲–嘧菌酯懸浮劑、25%嘧菌酯懸浮劑4種殺菌劑敏感性較高，回歸方程斜率大于1，對(duì)75%百菌清可濕性粉劑敏感性較低，斜率為0.232。

3 結(jié)論與討論

依據(jù)形態(tài)學(xué)特征以及ITS、β-tubulin、EF-1α這3個(gè)基因序列比對(duì)結(jié)果，明確了引起湖南省新化縣多花黃精葉枯病的病原菌為間座殼屬（Diaporthe）的Diaporthe hongkongensis、Diaporthe tulliensis和Diaporthe eres 這3個(gè)種。其中Diaporthe hongkongensis的致病力最強(qiáng)，Diaporthe eres次之，Diaporthe tulliensis的致病力最弱。5%己唑醇懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)Diaporthe hongkongensis的毒力作用較強(qiáng)，可作為化學(xué)防治多花黃精葉枯病的藥劑。

間座殼屬（Diaporthe）真菌是擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）真菌的有性型，是很多植物的致病菌及內(nèi)生菌[15]。間座殼屬真菌寄主范圍廣泛，作為植物病原菌通常可以引起植物的根系和果實(shí)腐爛、枝枯、枝干潰瘍、葉斑、枯萎，甚至植株死亡[16]。據(jù)報(bào)道，Diaporthe hongkongensis可以引起桃果實(shí)腐爛病，嚴(yán)重影響桃產(chǎn)量[17]。Diaporthe eres可以侵染藍(lán)莓，造成藍(lán)莓莖稈潰瘍、枯枝、芽枯癥狀，引起芽枯病[18]。此外，Diaporthe eres亦可侵染獼猴桃，造成果實(shí)腐爛，引起獼猴桃黑斑病，嚴(yán)重制約獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展[19]。Tao等[20]在我國茅山的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由Diaporthe eres引起的葉枯病對(duì)黃精苗圃的生產(chǎn)力和壽命構(gòu)成了潛在威脅。而Diaporthe hongkongensis 、Diaporthe tulliensis是在我國新發(fā)現(xiàn)的可以引起黃精葉片病害的病原菌種類。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）