?湖南郴州煙區(qū)一種新型煙草葉斑病病原菌的分離與鑒定?

摘 要：煙草葉部病害是煙草生產(chǎn)中的主要病害，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，易流行造成重大經(jīng)濟(jì)損失。2020—2021年對湖南省各煙區(qū)的煙草病害進(jìn)行了調(diào)查，在郴州煙區(qū)煙葉上發(fā)現(xiàn)了一種新的葉部病害。為了明確引起該葉部病害的病原菌，采集了具有典型癥狀的煙草病葉進(jìn)行病原菌的分離、純化、菌落形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定以及致病性測定。結(jié)果表明，該葉部病害是由高粱附球菌Epicoccum sorghinum 引起的葉斑病，該病害侵染煙草葉片，病斑形狀為橢圓形或不規(guī)則形，呈淡褐色或深褐色，病斑周圍有明顯的黃色暈圈。據(jù)查這是湖南省首次發(fā)現(xiàn)由E. sorghinum引起的煙草葉斑病。

關(guān)鍵詞：煙草；葉斑??；病原菌鑒定；高粱附球菌

中圖分類號：S432.44 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）04-0066-04

Abstract：Leaf diseases as an important disease on tobacco seriously affect the yield and quality of tobacco leaves and are easy to spread and cause heavy economic losses. During our investigation on tobacco diseases in Hunan Province from 2020 to 2021， a new tobacco leaf disease was found in Chenzhou tobacco-growing area. To clarify its pathogen， diseased leaves with typical symptoms were collected and subjected to pathogen isolation， purification， colony morphology observation， molecular identification and pathogenicity confirmation. Results showed that it was leaf spot disease caused by Epicoccum sorghinum. This pathogen mainly infected tobacco leaves， forming oval or irregular， light brown or dark brown spots surrounded with obvious yellow halos. To our knowledge， this was the first report of E. sorghinum causing leaf spot on tobacco in Hunan Province.

Key words： Nicotiana tabacum L.; leaf spot disease; pathogen identification; Epicoccum sorghinum

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是一種藥用植物。近年來，由于氣候環(huán)境的變化，加之種植品種單一、煙田連作比例高等因素，煙草病害也愈發(fā)嚴(yán)重，且種類多樣，除了常規(guī)的青枯病、黑脛病、病毒病等普遍發(fā)生以外，其他非主要病害也零星發(fā)生。由于診斷困難加大了防治難度，延誤了最佳防治時期，因此這些非主要病害極易發(fā)展為主要病害。例如：2019年在湖南發(fā)現(xiàn)煙草靶斑病零星發(fā)生[1]，而此后該病害在湖南各煙區(qū)流行發(fā)病，給煙農(nóng)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，及時了解煙草發(fā)病情況，明確病因及其流行規(guī)律是保障煙葉安全生產(chǎn)的重要舉措。

2020—2022年，在湖南省各煙區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)了一些葉部病害導(dǎo)致煙草嚴(yán)重減產(chǎn)和品質(zhì)下降，其中在湖南省郴州市桂陽縣煙區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種發(fā)生較普遍的葉部病害，由于田間現(xiàn)場鑒定困難，因此病因不明確，未能有效識別和防控，造成了較大的損失。基于此，筆者對該葉部病害進(jìn)行了病原菌的分離與鑒定，旨在為病害的診斷識別以及科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離與純化

2020至2021年，在湖南省郴州市桂陽縣煙區(qū)發(fā)病嚴(yán)重地塊采集煙葉病樣，將呈現(xiàn)水漬狀、具輪紋或壞死病斑的葉片樣本收集后，裝入干凈的塑封袋，帶回實驗室通過組織分離法進(jìn)行病原菌的分離鑒定[2]。剪取病健交界處約1 cm2大小葉片組織，先用70 %的乙醇處理30 s，再用2%次氯酸鈉處理1 min，用無菌水中漂洗3次后用無菌濾紙吸干水分并移入含有鏈霉素的PDA平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d。從長出的菌落邊緣打取菌餅轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，通過單孢分離進(jìn)行純化，純化后菌種用40 %的甘油于-80℃冰箱保存。

1.2 病原菌菌落及孢子形態(tài)觀察

選取代表性分離純化的菌株Es-5接種到PDA平板上于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，7 d左右待菌落長滿平板后，觀察菌落的形態(tài)特征，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄菌絲和孢子形態(tài)特征，對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3 病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增及分析

提取菌株Es-5的基因組DNA，以引物ITS4/ITS5擴(kuò)增病原菌的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) （rDNA-ITS）基因。此外，利用引物對ACT-512F/ACT-783R和TUB2-T1/Bt2b分別擴(kuò)增Es-5肌動蛋白（ACT）和微管蛋白（TUB）基因的部分區(qū)域。所用引物如表1所示[3]。擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL（10 mmol/L）、ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃，3 min；95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，45 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標(biāo)DNA片段，交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的序列用BLASTn在GenBank進(jìn)行同源性比對，并上傳到GenBank獲得登錄號。采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）在MEGA 6軟件進(jìn)行多基因聯(lián)合系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，以自舉法（bootstrap）進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗[4]。

1.4 病原菌的致病性測定

通過孢子液進(jìn)行盆栽煙草活體接種測定菌株Es-5的致病性。將Es-5菌株接種到PD液體培養(yǎng)基中，在28℃下以180 r/min的速度振蕩培養(yǎng)5 d后，用滅菌紗布過濾收集孢子液，將孢子濃度調(diào)整到1×106個/mL。將生長健康、長勢相近的2月齡盆栽云煙87煙草葉片用70%酒精擦拭消毒后，噴灑菌株孢子液，處理3盆煙草，每盆煙草接種2片葉，對照組噴灑無菌水。將接種后的煙草盆栽置于提前用酒精擦拭消毒的接種盒中，保濕培養(yǎng)2 d后，置于溫室中培養(yǎng)（25℃，90%相對濕度，L∶D=12 h∶12 h），觀察并記錄發(fā)病情況。從發(fā)病葉片組織處再次進(jìn)行病原菌分離和鑒定，以完成科赫氏法則。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

由圖1可知，菌株Es-5在PDA平板上氣生菌絲發(fā)達(dá)，初為灰白色，后分泌色素，中心為黃褐色至深褐色，邊緣白色，整齊，略微往外凸起；其分生孢子為單孢，呈梭形或卵圓形，大小為（3.2～8.3）×（1.8～4.0） μm（n=50）；厚垣孢子為暗色，單細(xì)胞或多細(xì)胞連在一起、球形或近球形，大小為（8.5～17.5）×（6.0～15.0） μm（n=50）。

2.2 分離菌株的分子鑒定

以菌株Es-5的基因組DNA為模板，用通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得約503 bp大小的片段（登錄號：OP604274） （圖2）。序列測定后用BLASTn在NCBI/GenBank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，菌株Es-5的rDNA-ITS序列與高粱附球菌Epicoccum sorghinum（MT123053.1）具有99.8%的相似性。為了進(jìn)一步明確菌株的分類地位，擴(kuò)增了菌株Es-5的ACT和TUB基因部分區(qū)域。測序結(jié)果表明，Es-5的ACT和TUB基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為240和522 bp （圖2）。同源性比對顯示ACT和TUB序列分別與E. sorghinum的相應(yīng)基因具有100%和99.81%的相似性。

利用鄰接法構(gòu)建了基于ITS、ACT和TUB的多基因聯(lián)合樹，結(jié)果如圖3所示，Es-5聚類于高粱附球菌E. sorghinum所在的分支。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析結(jié)果可確定Es-5菌株為E. sorghinum。

2.3 病原菌的致病性測定

將菌株Es-5的孢子液進(jìn)行盆栽煙草活體接種。結(jié)果如圖4所示，接種Es-5的煙草葉片上產(chǎn)生了明顯的壞死病斑，在侵染初期，病部呈水浸狀，后顏色加深，造成穿孔，有明顯黃色暈圈，與田間發(fā)病葉片癥狀類似。清水對照接種煙葉未見侵染癥狀（圖4B）。從葉片上再次進(jìn)行病原菌分離鑒定，能從Es-5接種的葉片上得到相同的菌株，由此確定Es-5為煙草葉斑病的病原。

3 結(jié)論與討論

該研究通過病原真菌分離純化、形態(tài)學(xué)觀察、基于ITS、ACT和TUB基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定了從郴州發(fā)現(xiàn)的煙草葉斑病病原菌為高粱附球菌Epicoccum sorghinum。該病害侵染煙草葉片后，病斑形狀為橢圓形或不規(guī)則形，呈淡褐色或深褐色，病斑周圍有明顯的黃色暈圈。據(jù)查這是湖南省首次發(fā)現(xiàn)由E. sorghinum引起的煙草葉斑病。

E. sorghinum曾被命名為Phoma sorghina，最初是從波多黎各的高粱（Sorghum vulgare）上分離獲得[5]。除了煙草外，該病原菌在茶樹、百合、白及、七葉一枝花、卷心菜、馬唐、紅花酢漿草等多個植物上被報道引起葉斑病[5-11]。已有研究發(fā)現(xiàn)E. sorghinum可引起煙草葉斑病[12]，然而目前除了廣西以外，還沒有在我國其他地區(qū)引起煙草病害的報道。

Epicoccum latusicollum是2017年發(fā)表的新種，被認(rèn)為屬于內(nèi)生菌、腐生菌或半寄生菌。Guo等[13]報道了貴州由附球菌屬引起的煙草葉斑病，通過多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將其病原菌鑒定為E. latusicollum；同年云南報道了由E. latusicollum引起的煙草根腐病[14]，且E. latusicollum引起的葉斑病與該研究中E. sorghinum引起的葉斑病癥狀相似。因此，該研究結(jié)果為煙草葉斑病的診斷提供了重要參考。

近年來，烤煙種植中各種葉部病害頻繁發(fā)生，且發(fā)生概率呈逐年上升趨勢，對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了重要威脅。該研究對湖南煙區(qū)煙草上出現(xiàn)的一種新的葉斑病進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果將為該病害進(jìn)一步的檢測、診斷、預(yù)測以及流行規(guī)律與防治技術(shù)研究提供基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 肖艷松，鐘 權(quán)，吳文信，等. 湖南煙草靶斑病的病原鑒定及分子檢測[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020，46（6）711-715.

[2] 方中達(dá). 植病研究方法（3版）[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[3] WHITE T J，BRUNS T，LEE S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[A]. In：Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR Protocols[M]. New York：A Guide to Methods and Applications，Academic Press，1990. 315-322.

[4] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[5] CHEN Q，HOU L W，DUAN W J，et al. Didymellaceae revisited[J]. Studies in Mycology，2017，87：105-159.

[6] BAO X T，DHARMASENA D S P，LI D X，et al. First report of Epicoccum sorghinum causing leaf spot on tea in China[J]. Plant Disease，2019，103（12）：3282.

[7] ZENG H，LU Q，LI R. First report of leaf spot of lily caused by Epicoccum sorghinum in China[J]. Plant Disease，2018，102（12）：2648.

[8] ZHOU H，LIU P P，QIU S，et al. Identity of Epicoccum sorghinum causing leaf spot disease of Bletilla striata in China[J]. Plant Disease，2018，102（5）：1039.

[9] YANG H M，ZHANG R Q，LI J X，et al. First report of Epicoccum sorghinum causing leaf spot on Paeonia suffruticosa in China[J]. Plant Disease，2023，107（1）：219.

[10] YU L，SHE X M，LAN G B，et al. First report of leaf spot caused by Epicoccum sorghinum on Chinese flowering cabbage（Brassica parachinensis）in China[J]. Plant Disease，2019，103（11）：2966.

[11] KANG Y，ZHANG J X，WAN Q，et al. First report of leaf brown spot caused by Epicoccum sorghinum on Digitaria sanguinalis in China[J]. Plant Disease，2019，103（7）：1787.

[12] YUAN G Q，LIAO T，TAN H W，et al. First report of leaf spot caused by Phoma sorghina on tobacco in China[J]. Plant Disease，2016，100（8）：1790.

[13] GUO Z N，YU Z H，WANG H C，et al. Leaf spot caused by Epicoccum latusicollum on tobacco in China[J]. Plant Disease，2021，105（2）：501.

[14] GAI X T，JIANG N，LU C H，et al. First report of Epicoccum latusicollum causing root rot on Nicotiana tabacum in China[J]. Journal of Plant Pathology，2020，102（4）：1291.

（責(zé)任編輯：成 平）