丹東草莓脫毒與組培快繁技術(shù)試驗(yàn)研究

摘 要：為了提高丹東地區(qū)紅顏草莓產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性，為規(guī)?；S提供技術(shù)支持，更好的促進(jìn)丹東地區(qū)草莓種植業(yè)發(fā)展，我們以紅顏草莓匍匐莖尖為試驗(yàn)材料，草莓莖尖外植體為試驗(yàn)對象進(jìn)行了組培試驗(yàn)，研究外植體不同時間的消毒處理，外植體切取大小，不同培養(yǎng)基激素組合配比對繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的影響，同時探究移栽過程中不同基質(zhì)配比對草莓苗成活率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明紅顏草莓組培最佳切取生長點(diǎn)大小為0.2-0.3mm，污染數(shù)為0；最佳滅菌時間為7min，成活率最高達(dá)到82％；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L；繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L，叢生芽生長健壯，增殖系數(shù)最高，沒有玻璃化，無褐化現(xiàn)象；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L，草莓根系肥大、短粗，生根率達(dá)到95％；移栽后草莓苗成活率最高基質(zhì)配比為草炭土：蛭石=1：1，根系發(fā)達(dá)，生長旺盛，成活率達(dá)到89.5％，為草莓脫毒苗快繁體系的建立提供有力證據(jù)，為丹東地區(qū)紅顏草莓規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：紅顏草莓；莖尖；培養(yǎng)基；組培快繁；激素配比；基質(zhì)

丹東是我國最大的草莓生產(chǎn)區(qū)域，在我國草莓生產(chǎn)中占有非常重要的位置，也是丹東農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)十大經(jīng)濟(jì)支柱之一。丹東是我國最早引入草莓產(chǎn)業(yè)化地區(qū)，今年來我國政府出臺了一系列政策，來保證草莓行業(yè)得到持續(xù)性發(fā)展，草莓的產(chǎn)業(yè)得到進(jìn)一步提高。丹東地區(qū)是溫帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，氣候濕潤，降雨充沛，光照有余，晝夜溫差較大，年降雨量在900-1200mm，草莓的整個生長季占70％，不需人工澆水就能滿足草莓生長的需要[1]。草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是薔薇科多年生本草植物，屬于當(dāng)今世界七大水果之一[2]，其營養(yǎng)價值非常豐富，被譽(yù)為是“水果皇后”，草莓中的花青素、維生素E具有較強(qiáng)的抗氧化能力，有助于延緩衰老、改善皮膚狀態(tài)。草莓中的維生素C，其含量比蘋果、葡萄都高7-10倍，還可以達(dá)到美白效果，適當(dāng)食用有美容養(yǎng)顏的作用。另外，草莓有幫助調(diào)節(jié)食欲，消化的功能，深受大眾喜愛。

丹東九九草莓也叫日本紅顏，1999年由丹東市引進(jìn)，口感純正，非常適合中國人的口味。其果實(shí)長圓錐形，生長勢強(qiáng)，果個大，耐儲存，產(chǎn)量高[3]，香味濃，果皮十分亮澤，仿佛覆蓋了一層蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)，果粒排布均勻，耐低溫能力強(qiáng)，在低溫條件下連續(xù)結(jié)果性好，自然成熟的丹東九九草莓，甜度可達(dá)12％，口感軟甜，可達(dá)到入口即化?；ò贻^大，每個花絮4-5朵，花瓣易落，不污染果實(shí)[4]。

傳統(tǒng)的草莓繁殖方式一般是匍匐莖繁殖或分株繁殖，但繁殖速度慢，隨著繁殖代數(shù)的增加體內(nèi)病毒積累[5]，容易導(dǎo)致病蟲害的增加，植株感染病毒后，可以在無性繁殖的后代進(jìn)行遺傳，致使果實(shí)畸形，植株矮小，種苗退化，經(jīng)濟(jì)效益、產(chǎn)量和品質(zhì)直線下降，無法保持親本優(yōu)良性狀，植物組織培養(yǎng)技術(shù)可有效解決這一問題[6]。通過莖尖組培技術(shù)進(jìn)行草莓脫毒，可以快速獲得優(yōu)質(zhì)無毒苗，有利于品種更新和提純，有效提高草莓品質(zhì)，加快新品種推廣[7，8]。本試驗(yàn)以紅顏草莓匍匐莖尖為外植體，建立簡單易行的紅顏草莓快繁體系，為紅顏草莓的規(guī)?；S生產(chǎn)提供完整可行的技術(shù)支持，更好的促進(jìn)丹東地區(qū)草莓種植發(fā)展。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為栽種于丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所溫室的生長健壯、無病紅顏草莓幼嫩匍匐莖尖為試驗(yàn)材料。本試驗(yàn)時間為2021年6月-2022年5月，選擇晴天，最好是中午或下午，不要在雨天、陰天或露水未干時取材料，因?yàn)榍缣熘仓旯夂秃粑?，有自身消毒的作用，這種組織一般是無菌的。采摘生長健壯無病害的草莓匍匐莖，用低溫保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1取樣

選擇生長健壯的紅顏草莓植株，不要帶有傷口或有病蟲的植株，剪取4-5cm左右植株頂芽飽滿且小葉未展開的匍匐莖放到燒杯中備用。

1.2.2外植體不同時間消毒處理

剝?nèi)ベ橘肭o頂端的葉片，用軟毛刷輕輕刷去紅顏草莓匍匐莖表面的塵土，再用流水沖洗1h以上，沖洗時要用干凈的紗布包裹好瓶口，用繩子或皮筋扎好瓶口，以防莖段在沖洗時溢出。在超凈工作臺上，將沖洗好后的莖段用滅菌后的鑷子裝入無菌的燒杯中備用。加入75％的酒精浸泡20s，無菌水沖洗3遍，再使用0.1％的升汞分別處理5min、7min、9min，浸泡期間要不斷搖晃，用無菌水沖洗3-4遍，進(jìn)行莖段滅菌。實(shí)際操作過程中莖尖清洗時間的長短根據(jù)莖尖幼嫩程度來判斷，適當(dāng)增減。

1.2.3 不同大小接種材料培養(yǎng)

用滅菌后的鑷子和刀片，剝?nèi)デo尖的外包葉，留取內(nèi)部莖尖備用，迅速準(zhǔn)確的切下帶有1-2個葉原基的生長點(diǎn)，分別切取0.2-0.3mm、0.4-0.5mm、0.6-0.7mm的莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L），放到培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)室光照為2000lx-2500lx，光照時長14h，溫度在23-25℃，濕度45％-50％的條件下培養(yǎng)，30d后觀察外植體誘導(dǎo)分化成活情況。誘導(dǎo)率=（萌發(fā)出芽的莖尖/接種的莖尖）×100％。

若操作不當(dāng)，組培瓶在進(jìn)入培養(yǎng)室后4-7天會出現(xiàn)污染情況，如發(fā)現(xiàn)及時將污染的組培瓶拿出培養(yǎng)室進(jìn)行滅菌處理，減少培養(yǎng)室內(nèi)污染源的傳播。剝離草莓莖尖過程中有可能誤將草莓葉原基當(dāng)做莖尖生長點(diǎn)，在一周左右的時間內(nèi)會發(fā)現(xiàn)葉片展開，無組織分化，也應(yīng)及時將該組織剔除掉。

1.2.4不同繼代培養(yǎng)基擴(kuò)繁培養(yǎng)

將紅顏草莓長勢一致的不定芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)一致，培養(yǎng)室光照為2000lx-2500lx，光照時長14h，溫度在23-25℃。按照需求生根或者二次繼代培養(yǎng)，一般繼代培養(yǎng)不超過5次，否則幼苗生長容易弱化。不同培養(yǎng)基處理的增殖倍數(shù)差異明顯，本試驗(yàn)中設(shè)置3個6-BA濃度，分別使用MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L、MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L、MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L三種培養(yǎng)基對照。培養(yǎng)30-40d后，觀察增殖情況，統(tǒng)計數(shù)據(jù)。增殖系數(shù)=不定芽總數(shù)/接種的莖尖數(shù)。

1.2.5 不同生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)

在草莓生根培養(yǎng)過程中大多數(shù)會研究用1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]，當(dāng)生長良好的紅顏組培幼苗長到3-4cm時，接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根，pH=6.0，分別使用1/2MS+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L、MS+IBA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L、MS+IBA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5.5g/L三種生根培養(yǎng)基對照。培養(yǎng)20d后，觀察其生根情況，統(tǒng)計生根率。

1.2.6 馴化移栽

草莓脫毒苗是在恒溫、高濕、無菌的培養(yǎng)基長出來的，對外界的適應(yīng)能力差，直接移栽成活率很低，所以得在煉苗室內(nèi)適應(yīng)外界生長環(huán)境，適當(dāng)?shù)牟僮鲗γ摱久绲鸟Z化及移栽起到?jīng)Q定性的作用[10]。將紅顏草莓幼苗長有5-6片正常葉子時，連苗帶瓶轉(zhuǎn)移到煉苗室中，前3d遮陰、少通風(fēng)，之后每日增加光照時間，練苗7-9天后打開瓶蓋，使幼苗逐漸適應(yīng)室內(nèi)溫度[11]。用清水清洗掉幼苗根部帶有的培養(yǎng)基，移栽到不同配比的72孔穴盤基質(zhì)中，栽植深度為“深不埋心，淺不漏根”為宜，栽后立刻澆一次水，并覆蓋塑料薄膜保持濕度，以后每隔1-2d澆一次水，直到緩苗結(jié)束?；|(zhì)配比分別是草炭土：蛭石=2：1、草炭土：蛭石=1：1、草炭土：蛭石=1：2，正常水肥管理，20d后統(tǒng)計成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體消毒處理時間

草莓外植體表面附著大量微生物，這是組織培養(yǎng)的一大障礙，因此材料接種前必須要消毒處理，消毒一方面要求把外植體表面各種微生物殺滅，同時又不能損傷組織材料而不影響其生長。因此，外植體消毒是組織培養(yǎng)工作中的重要環(huán)節(jié)。從表1可知，在消毒過程中同樣濃度的生汞滅菌7min草莓外植體成活率最高，可達(dá)到82％，滅菌效果最好。消毒時間過短，污染率高，消毒時間過長，會破壞莖尖的生長點(diǎn)，導(dǎo)致外植體死亡。

2.2 不同接種材料的影響

從表2可以看出，切取莖尖的大小直接影響誘導(dǎo)率，隨著切取莖尖長度的增加，誘導(dǎo)率也隨之增加，但是污染數(shù)也隨之增加。切取0.2-0.3mm大小的莖尖污染數(shù)為0，從而可以看出最佳切取莖尖大小為0.2-0.3mm，且沒有污染。

2.3 不同繼代培養(yǎng)基的影響

從表3可以看出，不同培養(yǎng)基處理的增殖系數(shù)差異顯著，經(jīng)20d左右可達(dá)到小植株增殖效果，植株的增殖倍數(shù)與培養(yǎng)基不同而有所不同。在NAA濃度相同的條件下，隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)越來越低，生長狀況越來越差。當(dāng)激素配比為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L的條件下，叢生芽生長健壯，增殖系數(shù)最高，沒有玻璃化，無褐化現(xiàn)象，從而看出6-BA可以促進(jìn)草莓不定芽的增值，但是濃度不易過高，過高增殖系數(shù)降低，苗容易出現(xiàn)玻璃化。

2.4 不同生根培養(yǎng)基的影響

從表4可以看出，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同的情況下，隨著IBA濃度的增加，紅顏草莓苗的生根率逐漸下降，根數(shù)有所下降，根長有所變短。從而可以看出加入激素IBA有利于根的發(fā)生，紅顏草莓的最佳的生根培養(yǎng)基配比為1/2MS+IBA 0.1mg/L，添加生根激素后，草莓植株根系肥大、短粗，生根率達(dá)到95％，平均根數(shù)為6.4根，平均長度為4.8cm。但是培養(yǎng)時間超過25d根部異常，說明該培養(yǎng)基不適合幼苗的長期生長。在幼苗生根培養(yǎng)超過30d會發(fā)現(xiàn)，草莓植株葉片發(fā)黃，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)室溫度17℃，葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，生長正常。說明草莓苗培養(yǎng)后期要降低室內(nèi)溫度，溫度過高草莓苗葉片失水變黃不利于生長。

2.5 不同基質(zhì)配比對草莓苗的影響

草莓苗成活率低的因素有很多，主要原因是基質(zhì)配比不當(dāng)，保水性過強(qiáng)，通透性不足。從表5可以看出，在不添加任何底肥的情況下，當(dāng)草炭土：蛭石=1：1時，草莓苗的成活率最高，20d后成活率可達(dá)到89.5％，生長健壯，根系發(fā)達(dá)。

3 結(jié)論

紅顏草莓組培快繁中，外植體切取大小，外植體滅菌時間，培養(yǎng)基接種、繼代、生根的培養(yǎng)基配方，成苗后基質(zhì)配比的選擇，是草莓組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素。外植體選用匍匐莖莖尖，選取莖尖0.2-0.3mm，培養(yǎng)基污染數(shù)為0，用0.1％生汞消毒7min，滅菌效果最好成活率達(dá)到82％。繼代培養(yǎng)時，激素配比MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L的條件下，增殖系數(shù)最高，沒有玻璃化。當(dāng)生根培養(yǎng)基激素配比為1/2MS+IBA 0.1mg/L時，添加IBA生根激素后，草莓植株根系肥大、短粗，生根率高達(dá)95％，平均根數(shù)為6.4根，平均根長為4.8cm，是最佳的生根培養(yǎng)基配比，組培苗的生根質(zhì)量直接影響馴化移栽的成活率。生根期間不易超過25d，超過25d草莓苗根部出現(xiàn)異常，超過30d，葉片邊緣發(fā)黃，把培養(yǎng)室溫度調(diào)到17℃，組培苗顏色恢復(fù)正常，說明草莓苗培養(yǎng)后期要降低室內(nèi)溫度，溫度過高草莓苗葉片失水變黃不利于生長。

馴化移栽階段，基質(zhì)的保水和通氣性能與組培苗的成活率和幼苗的初期成長密切相關(guān)[12]。在不添加任何底肥的情況下，最適宜的移栽基質(zhì)為草炭土：蛭石=1：1，每隔1-2d澆一次水，直到緩苗結(jié)束，其成活率最高可達(dá)到89.5％，根系發(fā)達(dá)，生長健壯。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的草莓培養(yǎng)基不同激素的配比，直接影響紅顏草莓愈傷誘導(dǎo)組織及生根的發(fā)生，這將為紅顏草莓快速的繁殖，規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

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