假煙葉樹葉多酚物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化

陳 蓓，姚 慧，林海燕，陸 英,，譚 斌

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

假煙葉樹葉多酚物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化

陳 蓓1，姚 慧1，林海燕2，陸 英1,2，譚 斌2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計對假煙葉樹葉中的多酚物質(zhì)提取工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，各因素對假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)提取效果的影響從大到小排列依次為：乙醇濃度＞固液比＞提取時間＞提取溫度；最佳提取工藝為：乙醇濃度40%、提取溫度90℃、固液比1∶30、提取時間1.0 h，連續(xù)提取2次；該條件下多酚物質(zhì)的提取率為5.33%，提取物中多酚含量為24.98%，回收率達98.4%。

假煙葉樹；多酚；乙醇；提取工藝；優(yōu)化

假煙葉樹（Solanum verbascifolium L.），又名野煙葉、土煙葉、山煙、野茄樹，屬茄科茄屬植物。生于海拔300～2 100 m的向陽路邊、荒地，分布于福建、臺灣、廣東、海南、廣西、四川、貴州和云南等地；其根、葉、果均可入藥，具小毒，有解毒消腫、除風止痛、涼血止血的功效[1-4]。Adam等[5]的研究表明，假煙葉樹中含有澳洲茄堿、澳洲茄邊堿、薯蕷皂苷元等生物活性成分。目前，對假煙葉樹的商業(yè)化開發(fā)利用較少，基于民間對假煙葉樹的使用多為水提取物，而上述文獻中的化學物質(zhì)多為親脂性成分，它們在水中溶解度很小。因此，有必要對假煙葉樹中的親水性成分做進一步研究，以期明確其中的活性成分，為假煙葉樹的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，假煙葉樹葉中含有多種多酚類化合物，鑒于天然多酚類化合物具有的抗氧化作用以及強化血管壁、促進腸胃消化、降血壓降血脂、預(yù)防動脈硬化和血栓形成、增強人體免疫力、抑制細菌和癌細胞生長等多種功效[6-9]，筆者對假煙葉樹葉中的多酚物質(zhì)進行了提取，并對提取工藝進行了優(yōu)化，獲得活性成分含量較高的提取物，為假煙葉樹多酚物質(zhì)的后期開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試假煙葉樹葉于7月采自廣東省假煙葉樹種植基地，為當年新生莖葉，60℃恒溫干燥后粉碎備用。

供試試劑有色譜甲醇（國藥集團化學試劑公司），F(xiàn)olin-C試劑、沒食子酸標準品（成都曼思特生物技術(shù)有限公司，純度97%），95%食用乙醇（市購）。

主要儀器設(shè)備有LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）、WondasilTM Cl8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、UV-2600 紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠）、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）、DHG-9146A型電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 假煙葉樹葉乙醇提取物的HPLC檢測 取假煙葉樹葉原料用10倍甲醇60℃回流提取1 h，提取液進行HPLC分析。色譜條件為：甲醇（B相），水（A相），梯度洗脫：0 min（B：5%，A：95%）→30 min（B：30%，A：70%），輸出波長320 nm，流速1 mL/min，柱溫30℃。

1.2.2 假煙葉樹乙醇提取物中多酚含量的檢測方法

（1）標準曲線的繪制。精確稱取104 mg沒食子酸于100 mL容量瓶中，經(jīng)水超聲溶解，冷卻定容得母液1.0088 mg/mL，分別取母液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mL于100 mL容量瓶中，加50 mL水，再加5 mL Folin-C試劑，搖勻后再加入15 mL 20%Na2CO3溶液，用水定容至刻度，于30℃反應(yīng)2 h后以空白樣品調(diào)零，在765 nm波長下測定標準溶液的吸光度，以沒食子酸質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。（2）樣品含量的檢測。精確稱取0.5 g假煙葉樹樣品，加入100 mL 60%乙醇，80℃回流提取2 h，過濾，濾液定容至250 mL，吸取0.5 mL溶液，于100 mL容量瓶中，其他操作與標準品相同，于765 nm處測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算假煙葉樹中多酚含量。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 準確稱取0.5 g假煙葉樹粉末若干份，分別對乙醇濃度（0%、20%、40%、60%、80%）、固液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取溫度（60、70、80、90、100℃）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）進行單因素試驗，以多酚提取量為指標，考察4個因素對提取效果的影響。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 針對乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、固液比（C）、提取時間（D）4個因素，以單因素試驗確定的較佳條件為中心選擇3個水平，進行L9（34）正交試驗（見表1），對結(jié)果進行方差分析，確定各因素對假煙葉樹葉多酚物質(zhì)提取效果的影響，得到最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.5 提取次數(shù)的確定 精確稱取0.5 g假煙葉樹葉粉末4份，按正交試驗確定的最佳提取工藝分別提取1次、2次、3次、4次，濾液定容至100 mL， 吸取1 mL樣液，測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算多酚提取量，并以提取率為指標確定提取次數(shù)。

1.2.6 最佳提取工藝驗證 根據(jù)上述確定的假煙葉樹中多酚最佳提取方法，取5 g原料進行提取，平行制備兩次，測定產(chǎn)品得率、多酚含量及回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 假煙葉樹葉乙醇提取物的HPLC圖譜分析

假煙葉樹葉60%乙醇提取液的HPLC圖譜見圖1，PDA紫外掃描顯示色譜圖中保留時間在8～20 min內(nèi)的7個主要組分均具有相似的紫外吸收光譜（見圖2），在320和220 nm 左右有較大吸收，具有明顯的酚酸類化合物的紫外吸收特征。

2.2 假煙葉樹葉乙醇提取物中多酚物質(zhì)含量的測定

以沒食子酸的吸光值（A）為縱坐標，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見圖3，得線性回歸方程為y=17.058 x-0.065（R2= 0.999 2），可見沒食子酸質(zhì)量與吸光度有良好的線性關(guān)系。按1.2.1中的方法提取，測得假煙葉樹葉中多酚含量為13.53 mg/g。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 乙醇濃度對假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)提取的影響

由圖4可知，在0～60%的濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)的提取量緩慢增加；其中，在40%與60%的乙醇濃度下，多酚物質(zhì)的提取量相當；而當乙醇濃度大于60%時，多酚物質(zhì)的提取量反而下降。因此，綜合考慮后確定乙醇濃度為40%。

2.3.2 固液比對假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)提取的影響

由圖5可知，多酚物質(zhì)的提取量隨固液比的增大而緩慢增加。但是，提取時溶劑用量越大，后續(xù)工作量也隨之增加。因此，選擇1∶20的固液比較為合適。

2.3.3 提取溫度對假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)提取的影響

由圖6可知，隨著提取溫度的升高，假煙葉樹中的多酚提取量緩慢增大；當提取溫度達80℃時，總多酚物質(zhì)的提取量最高；而當溫度繼續(xù)上升時，提取量反而下降。因此，宜選擇80℃為提取溫度。

2.3.4 提取時間對假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)提取的影響

由圖7可知，假煙葉中的多酚提取量隨著提取時間的延長而緩慢增大，不同提取時間之間的多酚物質(zhì)提取量差異不大。因此，考慮到生產(chǎn)效率、生產(chǎn)成本等因素，研究確定假煙葉樹中多酚物質(zhì)的提取時間為1 h。

2.4 正交試驗結(jié)果

從表2中的極差項可以看出，各因素對假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)提取效果的影響從大到小排列依次為：乙醇濃度＞固液比＞提取時間＞提取溫度；由均值可以看出，假煙葉中多酚物質(zhì)的最佳提取工藝為即乙醇濃度40%，提取溫度90℃，固液比1∶30，提取時間1.0 h。

2.5 提取次數(shù)對假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)提取效果的影響

從表3中可以看出，增加提取次數(shù)，假煙葉樹中多酚類物質(zhì)的提取量有所提高，提取2～4次，多酚類物質(zhì)的提取量比僅提取1次的高1.36～1.43 mg/g，其提取率也比僅提取1次的高10.02～10.58個百分點；但是，提取2次、3次或4次，之間的差異不明顯，且多酚類物質(zhì)的提取量及得率均以提取2次的最高。因此，確定假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)的提取次數(shù)以2次為宜。

2.6 最佳提取工藝的驗證

以正交試驗確定的最佳工藝條件對5 g假煙葉樹葉中多酚物質(zhì)連續(xù)提取2次，提取液經(jīng)濃縮干燥獲得假煙葉多酚干粉，兩次制備平均得0.266 7 g，提取率為5.33%，提取物中多酚含量為24.98%，回收率達98.4%。這表明該提取工藝穩(wěn)定、可靠，回收率高。

3 結(jié) 論

通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，假煙葉樹葉的乙醇提物具有多酚類化合物的光譜特征，因此研究通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計優(yōu)化了假煙葉樹葉多酚物質(zhì)的提取工藝，為假煙葉樹多酚物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，在乙醇濃度40%、提取溫度90℃、固液比1∶30、提取時間1.0 h的條件下連續(xù)提取2次，多酚物質(zhì)的提取率為5.33%，提取物中多酚含量為24.98%，回收率達98.4%。

假煙葉樹在我國分布廣泛，尤其在華南地區(qū)生長旺盛，野生資源較豐富。目前，關(guān)于該植物的開發(fā)利用報道較少，隨著人們對植物多酚物質(zhì)生物活性（例如護肝益腎、抗動脈硬化、防治冠心病等心血管疾病）的關(guān)注，假煙葉樹的開發(fā)前景廣闊。該研究結(jié)果為假煙葉樹多酚物質(zhì)的后期開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)，同時對促進我國民族藥用植物資源開發(fā)利用也有重要意義。

[1] 陳封懷. 廣東植物志第二卷[M]. 廣州：廣東科學技術(shù)出版社，1991.

[2] 江蘇新醫(yī)學院. 中藥大辭典（下冊）[M]. 上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1977.

[3] 吳修仁. 廣東藥用植物簡碼[M]. 廣州：廣東高等教育出版社，1989.

[4] 南京藥學院《中草藥學》編寫組. 中草藥學（下冊）[M]. 南京：江蘇科學技術(shù)出版社，1980.

[5] Adam G，Huong H T，Knoi N H. Solaverbascine - a new 22，26-epiminocholestane alkaloid from Solanum verbascifolium[J]. Phytochemistry，1980，19（5）：1002-1003.

[6] 左麗麗，王振宇. 植物多酚類物質(zhì)及其功能研究進展[J]. 中國林副特產(chǎn)，2012，（5）：39-43.

[7] 左 玉. 多酚類化合物研究進展[J]. 糧食與油脂，2013，26（4）：6-7.

[8] 陳曾三. 植物多酚功能性及其開發(fā)利用[J]. 糧食與油脂，2000，（3）：40-41.

[9] 宋立江，狄 瑩. 植物多酚研究與利用的意義及發(fā)展趨勢[J]. 化學進展，2000，12（2）：161-170.

（責任編輯：成 平）

Process Optimization of Polyphenols Extraction from Solanum verbascifolium L. Leaves

CHEN Bei1，YAO Hui1，LIN Hai-yan2， LU Ying1,2，TAN Bin2

（1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University , Changsha 410128, PRC; 2.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, PRC）

This study investigated optimal conditions of extracting polyphenols from Solanum verbascifolium L.leaves with single factor and orthogonal experiment designs. The results showed that the effect of polyphenols extraction from Solanum verbascifolium L. leaves was infuenced by such factors in the decreasing-degree order as concentration of ethanol＞ the ratio of raw materials to solvent ＞ extraction time＞ extraction temperature. The optimum extraction conditions included the ethanol concentration at 40%, temperature at 80℃, ratio of solid to liquid at1:20, and extraction for1.5h and 2 times, under which the yield of polyphenols could reach as high as 5.33%, the content of the extract was 24.98% and the recovery rate of polyphenols was 98.4%.

Solanum verbascifolium L.; polyphenol; ethanol; extraction process; optimization

Q946.82

A

1006-060X（2015）08-0083-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.026

2015-07-17

湖南農(nóng)業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新項目（2015年）

陳 蓓（1995-），女，湖南郴州市人，本科，專業(yè)為植物資源工程。

譚 斌