黑皮果蔗中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因ShINV6的克隆與表達(dá)分析

李和平 張樹河 李瑞美 潘世明

摘? 要：在高等植物中，蔗糖轉(zhuǎn)化酶廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、生物和非生物脅迫應(yīng)答等過程，在控制光合產(chǎn)物在不同庫組織的分配上起重要作用，是決定作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。本研究以黑皮果蔗‘Badila’為實(shí)驗(yàn)材料，克隆了一個果蔗蔗莖中堿性轉(zhuǎn)化酶基因，并對其序列特征、表達(dá)特性及其編碼蛋白的酶學(xué)特征進(jìn)行了分析。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)基因cDNA全長共2859 bp，其中編碼區(qū)為1254 bp，共編碼417個氨基酸，其中精氨酸（Arg）含量最高，為12.7%，分子質(zhì)量為46.29 kD，理論等電點(diǎn)為10.89，進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)ShINV6蛋白與甘蔗、玉米、高粱等單子葉作物的中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶高度同源，具有典型的Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域，多重序列比對發(fā)現(xiàn)ShINV6蛋白的C端比其他轉(zhuǎn)化酶少約130個氨基酸，細(xì)胞定位和親水性分析預(yù)測ShINV6蛋白可能為細(xì)胞質(zhì)中的親水性蛋白。在果蔗生長發(fā)育過程中，觀測蔗莖中的蔗糖含量變化，發(fā)現(xiàn)隨著種植時間的延長蔗糖含量逐漸增加，其中10月至11月是糖分積累最多的月份。熒光定量PCR結(jié)果顯示9月份表達(dá)量達(dá)到最大值，結(jié)合果蔗生長期生物產(chǎn)量增長規(guī)律推測ShINV很可能參與了蔗莖生長旺盛期光合作用產(chǎn)物蔗糖在蔗莖（庫）中的卸載過程，把蔗糖轉(zhuǎn)化成己糖以供蔗莖快速生長。

關(guān)鍵詞：Badila;中堿性轉(zhuǎn)化酶;;基因克隆中圖分類號：S566.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Neutral / Alkaline Invertase Gene （） from ‘Badila’

LI Heping， ZHANG Shuhe， LI Ruimei， PAN Shiming

Institute of Subtropical Agriculture， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Zhangzhou， Fujian 363005， China

In higher plants， invertase is widely involved in regulating plant growth， development， biological and abiotic stress response， and plays an important role in controlling the distribution of photosynthates in different bank tissues. It is a key enzyme that determines crop economic yield. In this study， the neutral/alkaline invertase was cloned from the stem of ‘Badila’. The sequence characteristics， expression characteristics and enzymatic characteristics of its encoding protein were analyzed. Bioinformatics analysis found that the full length of cDNA was 2859 bp， including 1254 bp of ORF that encoding 417 amino acids， and the content of arginine （Arg） was 12.7%. The molecular weight of ShINV6 was 46.29 kD and the PI value was 10.89. Evolutionary relationship analysis showed that ShINV6 protein was highly homologous with the neutral / alkaline invertase of monocotyledon crops such as sugarcane， maize and sorghum. It has typical Glyco_hydro_100 domain， multiple sequence alignments revealed that the C-terminal of ShINV6 was about 130 amino acids less than other invertases. Cell localization and hydrophilic analysis predict that ShINV6 may be hydrophilic protein in cytoplasm. During the growth and development of sugarcane， the change of sucrose content in sugarcane stems was observed. It was found that the sucrose content increased gradually with the extension of planting time， and the most sugar accumulation month was from October to November. QRT-PCR results showed that expression reached its maximum in September， and combined with regulation of biological yield growth in sugarcane growing period， it was speculated that ShINV6 might be involved in the unloading process of sucrose which the product of photosynthesis in the peak growth stage of sugarcane stems （library）， and sucrose was transformed into hexaccharide for the rapid growth of sugarcane stems.

Badila; neutral/alkaline invertase; ;ene cloning

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.006

在多數(shù)植物中，植物葉片（源組織）通過光合作用將CO固定成碳水化合物，然后運(yùn)向非光合組織（庫組織），在此過程中主要以蔗糖的形式完成碳水同化產(chǎn)物由源到庫的運(yùn)輸，在庫組織中，蔗糖只有降解為單糖后才能進(jìn)一步用于植物的生長發(fā)育。在植物中，蔗糖降解至少受兩類不同酶的催化，一類為蔗糖合成酶（SUS），其在尿苷二磷酸（UDP）存在下，可催化蔗糖裂解為尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖，這一反應(yīng)是可逆的;另一類為轉(zhuǎn)化酶（invertase， Inv），催化蔗糖不可逆地降解為葡萄糖和果糖，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶。在高等植物中，轉(zhuǎn)化酶是一個中等規(guī)模的基因家族，包含十幾個到二十幾個基因，其廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、生物和非生物脅迫應(yīng)答等過程，在控制光合產(chǎn)物在不同庫組織的分配上起重要作用，是決定作物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。

長期以來，蔗糖降解研究主要集中在酸性轉(zhuǎn)化酶（Ac-Inv）和蔗糖合酶上，而對中堿性轉(zhuǎn)化酶（A/N-Inv）的研究較少，認(rèn)為它們僅是在Ac-Inv和SUS活性低時維持蔗糖基礎(chǔ)代謝的酶。BARRATT等通過對擬南芥多個Sus基因和2個A/N-Inv基因的多重突變體植株的表型分析，發(fā)現(xiàn)A/N-Inv可能是控制碳源的不同庫組織分配信號通路中的重要靶標(biāo)，是植物正常生長所必需的基因，而SUS卻并非必需。Ac-Inv廣泛存在于動物、植物和微生物中，而N/A-Inv僅在可進(jìn)行光合作用的生物，如植物和藍(lán)細(xì)菌中。在甘蔗中，WANG等以比較基因組學(xué)為基礎(chǔ)克隆了6個中堿性轉(zhuǎn)化酶（ShN/AINVs）和8個酸性轉(zhuǎn)化酶（ShAINVs），在不同的非生物脅迫下，INVs均受到顯著抑制，且中堿性INVs受到抑制比酸性INVs更為突出;?？∑娴纫矎母收嶂锌寺〕?，并發(fā)現(xiàn)苗期根和葉片中基因都受PEG和NaCl誘導(dǎo)表達(dá)，ZHENG等（未發(fā)表）在NCBI數(shù)據(jù)庫登錄了3個中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，分別命名為、、，但其相關(guān)研究結(jié)果還未見發(fā)表。在黑皮果蔗中，中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶的研究還未見報道，本研究通過黑皮果蔗蔗莖轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了5個N/A-Inv基因，對其中一個新發(fā)現(xiàn)的中堿性轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行驗(yàn)證和細(xì)致分析，以期為果蔗蔗莖糖分累積規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

? 材料與方法

材料

供試材料為黑皮果蔗‘Badila’，2019年3月中旬種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗(yàn)基地，在果蔗生長3個階段的蔗莖中段進(jìn)行采樣，分別為7月初（生長初期）、9月初（拔節(jié)期）、11月中旬（成熟期），設(shè)置3個重復(fù)，蔗莖在實(shí)驗(yàn)室劈成小片后液氮速凍，–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

? 方法

1.2.1? 糖分測定? 使用WYF1（0-51）型糖量計(jì)對黑皮果蔗進(jìn)行田間錘度（Bx）測定，7—12月每月上旬固定測一次，每次測定生長良好且整齊的植株10株，記錄測定值，使用公式：蔗糖分=×1.0825–7.703，計(jì)算蔗糖分。

1.2.2? 總RNA提取與cDNA合成? 果蔗蔗莖總RNA提取采用成都福際生物技術(shù)有限公司的植物總RNA提取試劑盒，RNA濃度用超微量核酸蛋白測定儀檢測。采用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，合成cDNA，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 果蔗基因克隆與生物信息學(xué)分析? 黑皮果蔗轉(zhuǎn)錄組由北京百邁客生物科技有限公司基于Illumina高通量測序平臺獲得，搜索注釋結(jié)果查找N/A-Inv基因，發(fā)現(xiàn)有5個N/A-Inv基因，通過網(wǎng)上比對后對其中一個新基因進(jìn)行克隆與序列驗(yàn)證，并將此基因命名為。將序列導(dǎo)入GENETYX軟件中，預(yù)測其ORF序列及氨基酸序列。用ProtParam工具預(yù)測分子質(zhì)量、分子式、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)指標(biāo)。利用ProtScale工具分析ShINV6蛋白的親/疏水性。通過Softberry網(wǎng)站中ProtComp程序預(yù)測ShINV6蛋白的定位。GOR4在線工具用于預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL在線工具用于預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4? qRT-PCR反應(yīng)? 根據(jù)驗(yàn)證過的基因序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），基因作為內(nèi)參。使用Analytikjena-qTOWER2.2型熒光定量PCR儀和成都丹鳳科技有限公司生產(chǎn)熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，程序及體系：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，58℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)，溶解曲線分析（60～95℃，+1℃/循環(huán)，保持時間4 s）。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，取平均值，各個樣品中目的基因相對表達(dá)量的計(jì)算通過儀器軟件qPCRsoft 3.2自動執(zhí)行，以為內(nèi)參，利用2計(jì)算各個樣品的基因相對表達(dá)量。

?結(jié)果與分析

2.1? 全長的獲得

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得的cDNA序列全長，然后經(jīng)過引物設(shè)計(jì)、基因擴(kuò)增和測序驗(yàn)證序列準(zhǔn)確性，得到2859 bp的cDNA序列（圖1），GENETYX軟件預(yù)測基因編碼區(qū)為1254?bp，共編碼417個氨基酸（圖2），其中精氨酸（Arg）含量最高，為12.7%。其次是亮氨酸（Leu），含量為10.3%。ProtParam工具預(yù)測分子質(zhì)量為46.29 kDa，分子式為CHNOS，理論等電點(diǎn)為10.89，其中帶有負(fù)電殘基（Asp+Glu）42個，帶有正電殘基（Arg+Lys）67個，不穩(wěn)定指數(shù)為47.02，表明該蛋白不穩(wěn)定。

蛋白生物信息學(xué)分析

用NCBI網(wǎng)上BLASTP程序?qū)hINV6蛋白進(jìn)行功能域分析，結(jié)果（圖3A）顯示ShINV6蛋白在17至161氨基酸位點(diǎn)間有Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是細(xì)菌和植物中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶的保守結(jié)構(gòu)域。利用ProtScale工具分析ShINV6蛋白的親/疏水性，結(jié)果（圖3B）顯示：27位丙氨酸（Ala）分值最大，為2.067，疏水性最強(qiáng);297位谷氨酰胺（Gln）分值最小，為–3.522，親水性最強(qiáng);從整個序列來看，親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸且序列整體分值為負(fù)，預(yù)測該蛋白是親水性蛋白。通過Softberry網(wǎng)站中ProtComp程序預(yù)測ShINV6蛋白的定位，發(fā)現(xiàn)最高分是細(xì)胞質(zhì)蛋白，得分7.1分，表明ShINV6蛋白較大可能是細(xì)胞質(zhì)中的中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶。ShINV6蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-螺旋含量為35.49%，延伸鏈為15.59%，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量達(dá)到48.92%（圖3C）。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測總共搜出來21個模板，建出1個Model，結(jié)果（圖3D）顯示，ShINV6蛋白晶體結(jié)構(gòu)與魚腥藻中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶接近，α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)較多。

?多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化

在NCBI網(wǎng)站上用BLAST功能對ShINV6蛋白進(jìn)行同源蛋白搜索，并利用blast tree view工具，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)參加進(jìn)化樹構(gòu)建的蔗糖轉(zhuǎn)化酶蛋白可分為兩大類，ShINV6蛋白與甘蔗、玉米、高粱等單子葉作物的中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶高度同源，下載這些同源性較高的序列（甘蔗2個：ShA/NINV4，ShA/NINV5;玉米1個：ZmINV;高粱1個：SbINV1），利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)ShINV6與其他4個蛋白的中間有145個氨基酸相似性較高，而兩端與其他蛋白沒有相似性，且C端比其他少約130個氨基酸（圖5）。

在蔗莖發(fā)育過程中表達(dá)特性

在果蔗生長發(fā)育過程中，蔗莖中的蔗糖含量隨著種植時間的延長而逐漸增加（圖6A），3月種植的黑皮果蔗，在7月拔節(jié)初期時蔗糖分含量為1.43%，而到成熟期（12月）蔗糖分含量可達(dá)10.26%，糖分累積明顯，其中10—11月是糖分積累最多的月份。對7、9、11月3個時間點(diǎn)的基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示（圖6B），在9月表達(dá)量達(dá)到最大值，約是生長初期（7月）表達(dá)量的20倍，約是成熟期（12月）表達(dá)量的57倍。

討論

目前，關(guān)于甘蔗中堿性轉(zhuǎn)化酶的研究主要集中在基因克隆和誘導(dǎo)表達(dá)方面，對于生長發(fā)育中蔗莖的中堿性轉(zhuǎn)化酶研究鮮有報道。本研究克隆了一個果蔗蔗莖中堿性轉(zhuǎn)化酶基因，對其序列特征、表達(dá)特性及其編碼蛋白的酶學(xué)特征進(jìn)行了分析。多重序列比對發(fā)現(xiàn)ShINV6蛋白兩端與其他蛋白沒有相似性，且C端比其他少約130個氨基酸。WANG等克隆了14個甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，發(fā)現(xiàn)各基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)存在較大差異，最少的是211個氨基酸殘基，最多的是629個氨基酸殘基。SHEN等克隆了7個辣椒中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，同樣發(fā)現(xiàn)各基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)存在較大差異，最少的是286個氨基酸殘基，最多的是655個氨基酸殘基。ShINV6蛋白理化性質(zhì)指標(biāo)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在17至161氨基酸位點(diǎn)間具有典型的中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶特有的Glyco_hydro_100結(jié)構(gòu)域，分子質(zhì)量為46.29 kD，理論等電點(diǎn)為10.89，較大可能是細(xì)胞質(zhì)中的中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶。

轉(zhuǎn)化酶參與了蔗糖的裂解，從而改變園藝果實(shí)的糖組成和風(fēng)味品質(zhì)，參與了植物發(fā)育的許多過程，并響應(yīng)生物脅迫。在擬南芥中，一個胞液A/N-Inv基因的點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)化酶活性均明顯降低，造成主根變短、葉片和角果變小、花期提前。在豆科模式植物白脈根中，一個A/N-Inv基因LjINV1的功能缺失突變嚴(yán)重影響植株生長和花器官發(fā)育，植株明顯矮化并不能產(chǎn)生花粉，同時根部和葉片正常細(xì)胞的分裂和生長也受抑制。本研究中，9月表達(dá)量達(dá)到最大值，根據(jù)以往的觀測數(shù)據(jù)，7—9月是蔗莖生長最旺盛的月份，表明很可能參與了蔗莖生長旺盛期光合作用產(chǎn)物蔗糖在蔗莖（庫）中的卸載過程，把蔗糖轉(zhuǎn)化成己糖以供蔗莖快速生長。在庫爾勒香梨轉(zhuǎn)化酶與果實(shí)發(fā)育、成熟和糖的積累研究中，發(fā)現(xiàn)堿性轉(zhuǎn)化酶活性在果實(shí)發(fā)育過程中，其活性出現(xiàn)明顯的先升后降的趨勢，結(jié)果與本研究相似?；蚬δ芊治鰹檠芯抗嵴崆o生長發(fā)育過程中碳代謝提供了有價值的參考信息。

? 結(jié)論

本研究克隆了果蔗蔗莖中堿性轉(zhuǎn)化酶的一個成員，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)基因共編碼417個氨基酸，分子質(zhì)量為46.29 kD，理論等電點(diǎn)為10.89，進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)ShINV6蛋白與甘蔗、玉米、高粱等單子葉作物的中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶高度同源并聚為一類，細(xì)胞定位和親疏水性分析預(yù)測ShINV6蛋白可能為細(xì)胞質(zhì)中的親水性蛋白。熒光定量PCR結(jié)果顯示9月份表達(dá)量達(dá)到最大值，推測很可能參與了蔗莖生長旺盛期光合作用產(chǎn)物蔗糖在蔗莖（庫）中的卸載過程，把蔗糖轉(zhuǎn)化成己糖以供蔗莖快速生長。

參考文獻(xiàn)

1. BARRATT D H P， DERBYSHIRE P， FINDLAY K， PIKE M， WELLNER N， LUNN J， FEIL R， SIMPSON C， MAULE A J， SMITH A M. Normal growth of requires cytosolic invertase but not sucrose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2009， 106（31）： 13124-13129.
2. PAN L Z，?GUO Q W，?CHAI S L， CHENG Y， RUAN M Y， YE Q J， WANG R Q， YAO Z P， ZHOU G Z， LI Z M， DENG M H， JIN F M， LIU LC AND WAN H J. Evolutionary conservation and expression patterns of neutral/alkaline invertases in [J]. Biomolecules， 2019， 9（12）：763.
3. ZHANG S L， ZHANG Z， SUN X， LIU Z Q， MA M， FAN J B， LUO W Q， WANG L B， ZHANG S L. Identification and characterization of invertase family genes reveal their roles in vacuolar sucrose metabolism during Rehd fruit development[J]. Genomics， 2021， 113（3）： 1087- 1097.
4. SIEMENS J， GONZALEZ MC， WOLF S， HOFMANN C， GREINER S， YEJIE DU， RAUSCH T， ROITSCH T， LUDWIG-MüLLER J. Extracellular invertase is involved in the regulation of clubroot disease in [J]. Molecular Plant Pathology， 2011， 12（3）： 247-62.
5. PROELS R K， ROITSCH T. Extracellular invertase of tomato： a pivotal enzyme for integration of metabolic， hormonal， and stress signals is regulated by a diurnal rhythm[J]. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（6）： 1555-1567.
6. LIU S J， LAN J X， ZHOU B H， QIN Y X， ZHOU Y H， XIAO X H， YANG J H， GOU J Q， Q I J Y， HUANG Y C， TANG C R. HbNIN2， a cytosolic alkaline/neutral-invertase， is responsible for sucrose catabolism in rubber-producing laticifers of （para rubber tree）[J]. New Phytologist. 2015， 206（2）： 709-725.
7. ?？∑?， 王愛勤， 黃靜麗， 楊麗濤， 李楊瑞. 甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆和表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報， 2014， 40（2）： 253-263.NIU J Q， WANG A Q， HUANG J L， YANG L T， LI Y R. Cloning and expression analysis of sugarcane alkaline/neutral invertase gene [J]. Acta Agronomica Sinica， 2014， 40（2）： 253-263. （in Chinese）
8. QI X P， WU Z C， LI J H， MO X R， WU S H， CHU J， WU P. AtCYT-INV1， a neutral invertase， is involved in osmotic stress-induced inhibition on lateral root growth in [J]. Plant Molecular Biology， 2007， 64： 575-587.
9. WELHAM T， PIKE J， HORST I， FLEMETAKIS E， KATINAKIS P， KANEKO T， SATO S， TABATA S， PERRY J， PARNISKE M AND WANG T L. A cytosolic invertase is required for normal growth and cell development in the model legume， [J]. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（12）： 3353-3365.