異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌在海水養(yǎng)殖廢水脫氮中的研究進(jìn)展

周鵬　劉鷹　慕欣廷　蘇鑫　吳英?！№n蕊

摘要：異養(yǎng)硝化―好氧反硝化（heterotrophic nitrification-aerobic denitrification， HN-AD）脫氮技術(shù)可在好氧條件下同步實現(xiàn)硝化/反硝化過程，在海水養(yǎng)殖廢水生物脫氮處理中具有巨大應(yīng)用潛力。梳理海水環(huán)境中HN-AD菌的分離篩選研究進(jìn)展，結(jié)合關(guān)鍵功能基因和酶系分析了HN-AD脫氮途徑與機制，歸納了碳源、碳氮比、溶解氧、氮源、溫度、pH以及新型污染物等主要環(huán)境因子對HN-AD菌脫氮效果的影響。今后需進(jìn)一步通過常規(guī)和分子生物學(xué)手段獲得高效脫氮菌株，借助多組學(xué)手段闡明脫氮途徑與機制，厘清環(huán)境因素影響HN-AD菌的分子生物機制以獲得最優(yōu)工藝參數(shù)。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)殖廢水；脫氮菌；生物學(xué)機制；環(huán)境因子；工藝參數(shù)

中圖分類號：X55? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2023）06-0148-10

21世紀(jì)以來，海水養(yǎng)殖業(yè)由早期的粗放式養(yǎng)殖模式逐漸向高密度、集約化方向轉(zhuǎn)變（張志強等，2020）。在新型海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，氮濃度控制對于養(yǎng)殖生物和環(huán)境保護(hù)尤為重要（Huang et al，2020；馬洪婧等，2022）?，F(xiàn)有氮去除工藝幾乎均依托傳統(tǒng)的生物脫氮理論，即氨氮（NH4+-N）在好氧條件自養(yǎng)硝化細(xì)菌作用下先生成亞硝酸鹽氮（NO2--N）、硝酸鹽氮（NO3--N），接著在缺氧或兼性厭氧條件下進(jìn)行反硝化將氮從水體中去除（Yan et al，2022）。由于硝化和反硝化2個過程對有機底物和溶解氧（DO）的需求截然不同，除氮必須分段進(jìn)行，工藝操作復(fù)雜，反應(yīng)耗時且成本高（Zhang et al，2017）。

異養(yǎng)硝化―好氧反硝化（heterotrophic nitrification-aerobic denitrification， HN-AD）菌是近年來發(fā)現(xiàn)的新型生物脫氮菌，可在單一反應(yīng)器內(nèi)有氧條件下利用有機碳實現(xiàn)同步硝化/反硝化過程，將NH4+-N轉(zhuǎn)化為含氮氣體排出，且?guī)缀鯖]有中間產(chǎn)物積累，成為生物脫氮領(lǐng)域的研究熱點（Chen & Ni，2011；Chen et al，2016）。HN-AD菌為高DO的水產(chǎn)養(yǎng)殖水體在有氧條件下有效脫氮提供了一種嶄新的思路。蘇兆鵬等（2021）從海水養(yǎng)殖水體中分離出1株HN-AD菌Halomonas sp. GJWA3，該菌株分別以NH4+-N、NO2--N和NO3--N為唯一氮源，48 h氮去除率分別為96.44%、99.42%和78.27%，氮平衡結(jié)果表明該菌株能夠去除水體中大部分無機氮。成鈺等（2016）從刺參養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選出1株具有較強HN-AD能力的花津灘芽孢桿菌（Bacillus hwajinpoensis）SLWX2，24 h對NH4+-N、NO2--N和NO3--N的去除率分別達(dá)到100%、99.5%和85.6%。HN-AD菌在海水養(yǎng)殖廢水脫氮處理中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

鹽度可以抑制脫氮菌的酶活性并影響其生長代謝（Li et al，2018），導(dǎo)致菌株脫氮能力下降，來自淡水等環(huán)境的菌株處理海水等高鹽度廢水無法有效發(fā)揮作用（Uygur & Kargi，2004；Duan et al，2015）。目前，關(guān)于海水HN-AD菌的研究逐漸增多（Liu et al，2019；Zhao et al，2019；Zhang et al，2020a），但該類菌系統(tǒng)性的綜述研究鮮見報道。本文從海水HN-AD菌的分離篩選、脫氮途徑及機制、脫氮影響因素等方面評述近年研究成果，并對今后研究方向進(jìn)行展望，以期為海水養(yǎng)殖水處理工程實際應(yīng)用提供參考。

1? ?海水環(huán)境中HN-AD菌的分離篩選

目前，對HN-AD菌的研究還處于實驗室階段，雖然一些菌株在反應(yīng)器中表現(xiàn)出良好的脫氮效果，但尚未達(dá)到實際應(yīng)用水平，主要原因是缺乏有效的菌株資源（Song et al，2021）。人工及自然環(huán)境中均能分離得到HN-AD菌，除少數(shù)歸類為真菌外，大多為細(xì)菌（Yao et al，2020）。近年來，研究人員利用不同培養(yǎng)基并在不同篩選條件下不斷從海水環(huán)境中分離出HN-AD菌株，已發(fā)現(xiàn)的有鹽單胞菌屬Halomonas sp.（蘇兆鵬等，2021）、假單胞菌屬Pseudomonas sp.（Zhang et al，2020a）、海洋桿菌屬Marinobacter sp.（Zheng et al，2012）、芽孢桿菌屬Bacillus sp.（Barman et al，2017）、發(fā)光桿菌屬Photobacterium sp.（Liu et al，2019）、克雷伯氏菌屬Klebsiella sp.（孫慶花等，2016）、弧菌屬Vibrio sp.（Duan et al，2015）、節(jié)桿菌屬Arthrobacter sp.（Zhang et al，2020b）、卓貝爾氏菌屬Zobellella sp.（白潔等，2018）、副球菌屬Paracoccus sp.（Zhang et al，2015）等。這些菌大多為革蘭氏陰性菌，也有少數(shù)為革蘭氏陽性菌（成鈺等，2016；Zhang et al，2020b）。培養(yǎng)基的成分主要包括無機銨鹽、亞硝酸鹽或者硝酸鹽、碳源以及微量元素等，表1列出了部分培養(yǎng)基成分及篩選條件。Yao等（2013）發(fā)現(xiàn)使用添加硝酸鹽的培養(yǎng)基可以有效富集好氧反硝化菌。由于反硝化過程產(chǎn)堿，可以使用添加溴百里酚藍(lán)（bromothymol blue，BTB）的固體培養(yǎng)基，對遇堿變藍(lán)色的菌株進(jìn)行初篩（Chen et al，2016）。另外，HN-AD菌在好氧條件下可同時利用O2和NO3-，在厭氧條件下可利用NO3-作為電子受體。根據(jù)這一特征，采用間歇曝氣法頻繁切換好氧、厭氧環(huán)境有利于其成為優(yōu)勢菌種，提高篩選效率（Huang et al，2013）。目前，嘗試從不同環(huán)境介質(zhì)、使用不同培養(yǎng)基和篩選方法得到高性能HN-AD菌是主要的研究方向。

2? ?HN-AD菌脫氮途徑、機制及相關(guān)酶

HN-AD菌的不確定代謝機制也限制了其實際應(yīng)用。HN-AD菌種屬繁多，不同菌株脫氮過程的催化酶系及其編碼基因各不相同，氮代謝過程復(fù)雜，環(huán)境條件也會影響菌株脫氮性能（Song et al，2021），再加上目前研究方法的局限性，導(dǎo)致對其脫氮途徑和機制尚不十分清晰，這也是HN-AD菌基礎(chǔ)研究和應(yīng)用面臨的主要挑戰(zhàn)（Yan et al，2022）。

2.1? ?氮代謝途徑

大多數(shù)研究是通過HN-AD菌的代謝產(chǎn)物、菌株生長來推測脫氮途徑。HN-AD菌可通過同化作用將無機氮（NH4+-N、NO2--N、NO3--N）轉(zhuǎn)化為生長所必需的細(xì)胞內(nèi)氮（生物量氮），以及通過異化作用將無機氮轉(zhuǎn)化為含氮氣體（NO、N2O、N2）（Zhang et al，2020a ；Cao et al，2022），通過研究氮平衡來推測同化與異化作用對脫氮的貢獻(xiàn)率。

同化作用對脫氮的貢獻(xiàn)不可忽視（圖1）。Zhang等（2020a）從海洋沉積物分離的Pseudomonas bauzanensis DN13-1在以NO3--N為唯一氮源脫氮過程中，發(fā)現(xiàn)有39.38%的總氮（TN）被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)氮，21.88%的TN可能被轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮從培養(yǎng)基中脫除；比起異化作用，DN13-1更多地利用同化作用來轉(zhuǎn)化無機氮。Duan等（2015）分離的Vibrio diabolicus SF16，氮平衡表明有35.83% NH4+-N轉(zhuǎn)化為生物量氮。而H. GJWA3在不同氮源培養(yǎng)基中將無機氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮的比例均高于對氮的同化率，說明H. GJWA3具有顯著的反硝化能力（蘇兆鵬等，2021）。細(xì)菌死亡后分解產(chǎn)生新的含氮化合物（He et al，2016），這些生物量氮又回到環(huán)境中，可能導(dǎo)致脫氮效果受到影響。Huang等（2020）用初始濃度20 mg/L的NH4+-N作為唯一氮源，混合培養(yǎng)25株分離自海水養(yǎng)蝦池的HN-AD菌群，8～32 h期間，因死亡細(xì)胞的分解，NH4+-N濃度從7.0 mg/L上升到9.0 mg/L?？梢?，分離篩選出合成氣態(tài)氮轉(zhuǎn)化率高而生物量氮少的菌株可能更有益于提高總氮的去除率。但Hu等（2014）認(rèn)為，這些生物量氮可以豐富養(yǎng)殖動物的食物蛋白源，并以此減少含氮溫室氣體的排放。

異化作用中HN-AD菌將無機氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮而脫除，對水處理反應(yīng)器脫氮起主要作用（圖1）。目前普遍接受的脫氮途徑有2個：①完全HN-AD通路（Kuenen & Robertson，1994；Richardson et al，1998）；②羥胺氧化通路（Liu et al，2019；Yan et al，2022）。此外，HN-AD過程還會伴隨短程硝化―反硝化、厭氧氨氧化、硝酸鹽異化還原為銨等，需要進(jìn)行全面和深入的研究。

通路①中，在好氧條件下，NH4+-N經(jīng)硝化過程轉(zhuǎn)化為NO2--N、NO3--N后，再經(jīng)反硝化過程將NO3--N轉(zhuǎn)化為含氮氣體。反硝化過程中有機碳作為電子供體，NO3-（NO2-）和O2可同時作為電子受體（Huang et al，2013），菌株通過電子傳遞過程獲得能量。Zhang等（2020b）從海水養(yǎng)殖系統(tǒng)分離出Arthrobacter sp. HHEP5，利用基因組DNA為模板，成功擴增出基因amoA、hao、napA、narG、nirS、nosZ，并結(jié)合菌株的脫氮性能提出HHEP5的脫氮途徑遵循通路①。白潔等（2018）從膠州灣海底沉積物中分離到的Zobellella sp. B307，通過代謝產(chǎn)物的變化推測其脫氮途徑遵循通路①。通路①解決了傳統(tǒng)硝化/反硝化因為碳源、氧氣需求的差異不能在同一空間進(jìn)行的問題。對于富氧的水產(chǎn)養(yǎng)殖水處理具有巨大優(yōu)勢。但是如何穩(wěn)定反應(yīng)過程，避免中間產(chǎn)物積累還需要深入探索。

通路②中NH4+-N氧化為羥胺后被直接轉(zhuǎn)化為含氮氣體。Liu等（2019）從海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)分離的Photobacterium sp. NNA4在好氧條件下羥胺氧化還原酶（hydroxylamine oxidoreductase，HAO）比活力為0.009 U/mg，可耐受10 mmol/L羥胺，并可高效地將羥胺直接轉(zhuǎn)化為N2O。菌株y6（王驍靜等，2017）以NH4Cl為唯一碳源脫氮過程中，沒有NO2--N和NO3--N的積累，推測遵循通路②。該通路優(yōu)點是不產(chǎn)生NO3--N以及對水產(chǎn)動物毒害較大的NO2--N，可提升反應(yīng)效率且不需要外源碳從而降低運行成本（Yan et al，2022）。羥胺是硝化過程的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，對微生物具有毒害作用（Ouyang et al，2020），快速去除羥胺對于提高脫氮效率有重要意義。

2.2? ?氮代謝相關(guān)酶

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在基因水平研究HN-AD過程中涉及到的相關(guān)酶學(xué)及分子生物學(xué)也成為近年來研究的熱點之一。已發(fā)現(xiàn)的HN-AD菌脫氮過程可能涉及的酶主要有：氨單加氧酶AMO、羥胺氧化還原酶HAO、丙酮肟雙加氧酶POD、亞硝酸鹽氧化還原酶NXR、硝酸鹽還原酶NAP/NAR、亞硝酸鹽還原酶NIR、一氧化氮還原酶NOR、一氧化二氮還原酶NOS等（Tsujino et al，2017；Liu et al，2018；Holmes et al，2019；Song et al，2021；Xi et al，2022）。

AMO（amo基因編碼）催化游離氨轉(zhuǎn)化為羥胺（Mevel & Prieur，2000），是硝化過程的第一步也是重要的一步，amo被認(rèn)為是好氧氨氧化的標(biāo)志基因（Dionisi et al，2002）。HAO（hao基因編碼）是1種具有多種催化功能的酶，除了可以將羥胺轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，近年的研究表明，其也與羥胺轉(zhuǎn)化為NO、N2O密切相關(guān)（Holmes et al，2019；Liu et al，2019）。POD（pod基因編碼）是羥胺轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的另一種酶（Tsujino et al，2017），探究羥胺氧化途徑時通常對這2種酶進(jìn)行研究。NAP（nap基因編碼）和NAR（nar基因編碼）是可以將NO3--N還原為NO2--N的2種酶。在好氧條件下，nap占主導(dǎo)地位，nar受到抑制（Holmes et al，2019）。NIR（nirS、nirK基因編碼）可催化NO2--N還原為NO，nirS和nirK通常不同時存在于同一菌株。有研究發(fā)現(xiàn)，與nirK相比，nirS在反硝化過程中發(fā)揮的作用更大（Sun et al，2018），特別在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，亞硝酸鹽對養(yǎng)殖動物毒害比較嚴(yán)重，研究NO2--N的轉(zhuǎn)化意義重大。NOR（nor基因編碼）可催化NO還原為N2O，NOS（nos基因編碼）可催化N2O還原為N2。其中，NOR活性較強，NO不容易積累（Fujiwara & Fukumori，1996），而NOS對氧氣敏感，DO的控制對于溫室氣體N2O的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要（Matsuzaka et al，2003）。HN-AD過程中酶的活性（基因表達(dá)）通常是通過添加特定的氮底物來測定，而這種分析方法并不適用于不確定特性或未知的酶（基因）（Xi et al，2022）。

雖然HN-AD菌在有氧條件下有許多共同的性狀，但由于其系統(tǒng)發(fā)育的多樣性和生理上的差異，它們在污水處理中的功能尚不明晰（Xi et al，2022）?？偨Y(jié)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，對于HN-AD過程的分子生物學(xué)研究主要集中在代謝相關(guān)酶和基因的功能及結(jié)構(gòu)方面，關(guān)于細(xì)胞內(nèi)電子傳遞機制、酶分子動力學(xué)等方面的研究極為有限。到目前為止，還沒有1株HN-AD菌可以通過多組學(xué)方法解讀普遍的分子信息（Xi et al，2022）。大多研究通過傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）來確定細(xì)菌種類和脫氮基因，但PCR不能全面反映氮轉(zhuǎn)化過程中的微生物結(jié)構(gòu)和功能的變化（Yang et al，2021）。另外，HN-AD過程有些功能基因或同源基因仍然未知（Zhang et al，2020a）。未來，應(yīng)通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)以及同位素技術(shù)的聯(lián)合分析，全面解讀HN-AD菌脫氮途徑和機理。

3? ?HN-AD脫氮的影響因素

適合的生長條件是水處理微生物發(fā)揮作用的重要因素。為了獲得適合實際應(yīng)用的菌株，需要探索HN-AD菌生長和代謝的影響因素。碳源、碳氮比（C/N）、溶解氧（DO）、溫度、氮源和pH是HN-AD菌的主要影響因素（表2）。

3.1? ?碳源

脫氮過程中，有機碳源為HN-AD菌提供必需的能源和反硝化反應(yīng)的電子，是HN-AD過程必不可少的關(guān)鍵因素。碳源的類型和含量都會對HN-AD速率產(chǎn)生顯著的影響（Obaja et al，2005）。

3.1.1? ?碳源類型? ?目前，常用的碳源多為可溶性碳源，如葡萄糖（Barman et al，2017）、琥珀酸鈉（Liu et al，2019）、檸檬酸鈉（王驍靜等，2017）、乙酸鈉（Pan et al，2020）等。HN-AD菌作為異養(yǎng)菌，必須依賴有機碳進(jìn)行細(xì)胞大分子的生物合成和能量生產(chǎn)（Xia et al，2020）。王驍靜等（2017）等從膠州灣海底沉積物中分離篩選出1株克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）y6，使用琥珀酸鈉、檸檬酸鈉為唯一碳源時NH4+-N去除率都高于92%。菌株V. SF16（Duan et al，2015）使用乙酸鈉、葡萄糖、琥珀酸鈉、蔗糖為唯一碳源，NH4+-N去除率均在88%以上，使用檸檬酸鈉時NH4+-N去除率只有40%左右，而檸檬酸鈉卻是Klebsiella sp.y5（孫慶花等，2016）的最適碳源。琥珀酸鈉、檸檬酸鈉等分子量小、化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單易于菌株利用（Xia et al，2020）。也有報道，琥珀酸、檸檬酸是三羧酸的中間體，可直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)供微生物利用（Borrero-de et al，2017；Xia et al，2020）。葡萄糖可支持芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）高效脫氮（Zhao et al，2019），可見，不同菌株對碳源有不同的偏好。

碳源投加不足會導(dǎo)致脫氮不徹底，而投加過量會造成出水COD（chemical oxygen demand，化學(xué)需氧量）過高等二次污染。因此，需要復(fù)雜的檢測和控制系統(tǒng)。此外，一些液態(tài)碳源，如甲醇、乙醇，由于其毒性和可燃性，在儲存、運輸和使用過程中會帶來安全風(fēng)險（Zhang et al，2017）。相比之下，生物可降解聚合物（Biodegradable Polymers，BDPs）可同時作為細(xì)菌生長的載體和碳源，具有釋碳穩(wěn)定、無需反復(fù)添加、易于控制等優(yōu)點，在近幾年吸引了大量學(xué)者的關(guān)注（Lopardo & Urakawa，2019），但因其經(jīng)濟(jì)成本高等原因還處在實驗室研究階段。目前，尋找適用于海水養(yǎng)殖污水處理的經(jīng)濟(jì)有效、穩(wěn)定緩釋的碳源是HN-AD方法應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的巨大挑戰(zhàn)。

3.1.2? ?碳氮比? ?針對發(fā)現(xiàn)的新HN-AD菌，研究碳氮比（C/N）對脫氮性能的影響十分重要。C/N過低，菌株因營養(yǎng)供應(yīng)不足生長會受到抑制（Yang et al，2019a），同時，因缺乏電子供體而導(dǎo)致反硝化不徹底（Zhao et al，2010）；C/N過高也會抑制脫氮速率、造成出水二次污染且浪費資源（Xia et al，2020）。應(yīng)根據(jù)菌株生理生態(tài)特征和環(huán)境因素選擇適當(dāng)?shù)腃/N。從目前海水HN-AD的研究結(jié)果來看，大多數(shù)菌株的最適C/N在10以上，只有少數(shù)菌株在10以下（表2）。菌株V. SF16在C/N為10時NH4+-N去除率達(dá)到最大值93%。菌株H. GJWA3（蘇兆鵬等，2021）利用葡萄糖作為碳源，C/N大于10 時，NH4+-N和NO2--N的去除率接近100%。而隨著C/N從10逐漸降低，氮的去除率也呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，當(dāng)C/N為0時，菌株對NH4+-N和NO2--N的去除率也降為0。Huang等（2017）從對蝦海水養(yǎng)殖池塘分離出的海濱芽孢桿菌（Bacillus litoralis） N31，使用乙酸鈉為碳源，C/N為5～20時NH4+-N去除率均穩(wěn)定保持在90%左右，相比于H. GJWA3（蘇兆鵬等，2021）具有更寬泛的C/N耐受性。

然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體C/N較低，通常只有2～3（Schneider et al，2006），不足以維持HN-AD過程，碳源不足是導(dǎo)致海水養(yǎng)殖廢水脫氮不徹底的主要原因（鄭冰冰等，2020）。額外添加碳源會增加水處理的成本，篩選或馴化出低C/N的HN-AD菌是生物脫氮的一個重要方向。

3.2? ?溶解氧

溶解氧（DO）是影響HN-AD的又一個重要因素。水產(chǎn)養(yǎng)殖用水通常具有較高DO濃度，HN-AD菌雖然具有一定的DO耐受性，但亞硝酸鹽還原酶對O2敏感，高濃度DO可能會導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累（K?rner & Zumft，1989）；低濃度DO又抑制菌株的快速生長，導(dǎo)致NH4+-N的去除受到影響。因此，DO濃度的高低對HN-AD脫氮效果至關(guān)重要（Zhao et al，2019）。

段金明等（2019）將海洋菌株（Vibrio diabolicus）SF1接種到曝氣生物濾池中，隨著DO濃度的升高，NH4+-N去除率呈增強趨勢，當(dāng)DO濃度為4～5 mg/L時，NH4+-N去除率達(dá)到最高99%，但再提高DO濃度時，NH4+-N去除率開始下降，同時NO2--N、NO3--N積累量上升，推測原因可能是過高的DO濃度抑制了脫氮酶的合成和活性。與此不同，也有菌株耐受高濃度DO，Zhao等（2019）從養(yǎng)蝦池分離的Bacillus subtilis H1是1株典型的好氧菌，在DO飽和度為91.1%（6.65 mg/L）接近飽和水平時，NH4+-N和NO2--N的去除率都達(dá)到最高90%左右。由此可見，不同HN-AD菌對DO的適應(yīng)性不盡相同，即使同一菌株在不同DO水平下的脫氮能力也可能有所差異。確定菌株最適DO是基礎(chǔ)研究和未來應(yīng)用的重要前提。

3.3? ?溫度

大多數(shù)HN-AD菌對溫度敏感，在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度升高，菌株生長和脫氮能力會顯著提高（Ren et al，2014）。而在高溫或低溫條件下，它們的生長和代謝會受到明顯的抑制（Song et al，2021）。P. NNA4（Liu et al，2019）最適溫度范圍為30～37℃。當(dāng)溫度從16℃上升到30℃時， NH4+-N去除率和菌株生長都顯著上升，而當(dāng)溫度進(jìn)一步從37℃增加到45℃時， NH4+-N濃度從50 mg/L急劇上升到160 mg/L，細(xì)胞光密度（OD600）從1.6幾乎下降到0。GJWA3對高溫具有很好的耐受性，40℃時，NH4+-N和NO2--N的去除率仍高于70%。對于一般的HN-AD菌，最適溫度范圍為28～37℃（何環(huán)等，2017），已發(fā)現(xiàn)的海洋HN-AD菌也基本位于這個范圍（表2）。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，考慮到低溫季節(jié)和冷水魚的需要，嗜冷HN-AD菌的篩選尤為重要。

3.4? ?氮源

作為反應(yīng)底物，氮源的種類和含量也會影響HN-AD菌株生長和脫氮效果（Song et al，2021）。Huang等（2017）在考察菌株B.N31的硝化速率與NH4+-N初始濃度關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，硝化速率隨NH4+-N初始濃度（10～250 mg/L）的增加而增加?？赡茉蚴窍趸磻?yīng)酶需要足夠的NH4+-N含量進(jìn)行激活，較低濃度的氮不能保證HN-AD菌的脫氮效果（蘇兆鵬等，2021）?；旌系粗校琀N-AD菌往往優(yōu)先利用NH4+-N（Huang et al，2017）。孫慶花等（2016）從海底沉積物中分離的Klebsiella sp.y5，分別以NH4+-N、NO2--N、NO3--N為唯一氮源時，36 h的氮去除率分別為77.07%、64.14%和100%。而將3種氮源混合時，36 h的總氮去除率達(dá)到100%。這個結(jié)果與B307類似，B307在混合氮源中NH4+-N去除率達(dá)98.35%，顯著高于NH4+-N為唯一氮源的67.23%，推測可能是NO3--N加快了電子傳遞速率，促進(jìn)了NH4+-N的代謝（白潔等，2018）。NH4+-N、NO2--N、NO3--N是阻礙海水循環(huán)水養(yǎng)殖的重要污染，菌株選擇應(yīng)當(dāng)全面考察對這3種氮素的去除能力。

3.5? ?pH

HN-AD過程中大多伴隨著pH值的變化，當(dāng)pH值超出菌株適應(yīng)范圍時會降低菌株的酶活性，抑制菌株的生長代謝，進(jìn)而影響菌株的脫氮性能（Nancharaiah & Reddy，2018）。大多數(shù)從海水養(yǎng)殖系統(tǒng)分離的HN-AD菌最適脫氮pH值范圍為7.0～9.0（表2）。菌株SF16（Duan et al，2015）具有良好的硝化作用，在弱堿性環(huán)境中（pH 7.5～9.5） NH4+-N去除率達(dá)到93%以上，可能游離氨對異養(yǎng)硝化有一定的促進(jìn)作用。氨單加氧酶利用的底物是游離氨而非銨離子，故弱堿性水環(huán)境含有更多的氨對異養(yǎng)硝化作用是有利的（Mevel & Prieur，2000）。有研究報道海水養(yǎng)殖水體的pH值為7.0～9.0（Tsukuda et al，2015），適合大多數(shù)HN-AD菌株的生態(tài)特性。

除了以上因素，抗生素、微塑料以及重金屬等也影響到HN-AD菌的脫氮性能。抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用來防治養(yǎng)殖動物疾病，然而其殺菌作用會抑制微生物的脫氮能力。25 mg/L的氨芐青霉素可以明顯抑制HN-AD菌株的活性，達(dá)到50 mg/L時，總氮去除率和有機物去除率分別下降至48.6%和50.9%（Wang et al，2020）。另外，微塑料（史文超等，2021）、重金屬（Yang et al，2019b）也被發(fā)現(xiàn)會影響微生物脫氮性能。海水養(yǎng)殖廢水HN-AD脫氮處理研究也應(yīng)對這些新型污染物等影響因素進(jìn)行探索。

環(huán)境因素會影響基因的表達(dá)和酶的活性，目前，關(guān)于HN-AD菌影響因素的研究大多集中在脫氮性能方面，而對其內(nèi)在機制的探索較少。生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)是菌株適應(yīng)環(huán)境的重要因素，因此，有必要對更多菌種進(jìn)行研究總結(jié)出生化機制，從而為實際應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。此外，現(xiàn)有海水HN-AD菌影響因素研究幾乎均為單因素研究，單因素研究為菌株應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)，但實際工程應(yīng)用需要對多個因素交互作用進(jìn)行評價，通常采用生物學(xué)領(lǐng)域常用的響應(yīng)曲面法優(yōu)化脫氮條件（司圓圓等，2020；Xu et al，2021）。海水HN-AD菌多因素復(fù)合影響的研究有待加強。

4? ?問題及展望

HN-AD作為1種新型的生物脫氮工藝，可以僅在有氧條件下同步完成硝化和反硝化，對于海水養(yǎng)殖廢水中氮去除具有明顯的優(yōu)勢和較大應(yīng)用潛力。當(dāng)前，對HN-AD的研究已經(jīng)取得了一些成果，但HN-AD技術(shù)距離實際應(yīng)用仍存在一些“瓶頸”問題需解決。如尚不明確脫氮機理和途徑、缺乏經(jīng)濟(jì)有效的碳源、不明晰多因素共同影響機制等。目前，有不少學(xué)者進(jìn)行模擬反應(yīng)器中的HN-AD過程研究，但大部分僅限于實驗室規(guī)模。今后需重點從以下幾個方面開展研究：

（1）繼續(xù)通過常規(guī)和分子生物學(xué)手段獲得適合海水養(yǎng)殖廢水的高效脫氮HN-AD菌株。篩選耐鹽、脫氮能力高的HN-AD菌株，利用宏基因組測序技術(shù)對養(yǎng)殖環(huán)境中的菌群進(jìn)行全面分析；通過基因編輯等方法重新設(shè)計關(guān)鍵基因，提高HN-AD過程的電子傳遞效率，強化HN-AD菌株脫氮性能。

（2）采用組學(xué)方法（如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)）多層次深入闡明海水養(yǎng)殖廢水HN-AD脫氮途徑機制。通過酶的體外表達(dá)、功能基因敲除等方法深入解析HN-AD菌的特征酶和功能基因；通過代謝組學(xué)分析不同碳源、氮源在HN-AD過程中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的變化。除了深入研究HN-AD菌代謝機制以外，還需進(jìn)一步構(gòu)建穩(wěn)定的HN-AD菌群，以便更好地應(yīng)用于工程實踐。

（3）深入考察海水養(yǎng)殖廢水中單一因素對HN-AD過程的影響和分子生物學(xué)機制，探索新型污染物對HN-AD過程的影響。明晰多個因素對HN-AD過程的復(fù)合影響和生化反應(yīng)調(diào)節(jié)機制，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)。

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（責(zé)任編輯? ?張俊友? ?熊美華）

Research Progress on Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification

Bacteria in the Denitrification of Mariculture Wastewater

ZHOU Peng1，2， LIU Ying2，3， MU Xin‐ting2， SU Xin2， WU Ying‐hai4， HAN Rui2

（1. College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian? ?116023， P.R. China;

2. Key Laboratory of Environment Controlled Aquaculture， Dalian Ocean University，

Dalian? ?116023， P.R. China;

3. College of Biosystems Engineering and Food Science， Zhejiang University，

Hangzhou? ?310058， P.R. China;

4. College of Marine and Civil Engineering， Dalian Ocean University，

Dalian? ?116023， P.R. China）

Abstract：Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification （HN-AD） technology can simultaneously produce nitrification and denitrification under aerobic conditions， a significant advantage for the biological denitrification of marine aquaculture wastewater. In this study， we reviewed recent research on the isolation and screening HN-AD bacteria in seawater， the denitrification pathway and mechanism of HN-AD bacteria， and the key functional genes and enzymes guiding denitrification. The effects of primary environmental factors （carbon source， carbon-nitrogen ratio， dissolved oxygen， nitrogen source， temperature， pH and emerging contaminants） on nitrogen removal by HN-AD bacteria were also summarized. Finally， prospects for future research were discussed for optimizing the biological denitrification of marine aquaculture wastewater. Promising research directions include obtaining high-efficiency denitrification strains by conventional and molecular methods， elucidating the mechanism of nitrogen removal using a multi-omics approach， and clarifying the molecular mechanism of environmental factors affecting HN-AD bacteria. Our study provides a reference for the practical application of HN-AD bacteria in treating wastewater from mariculture.

Key words： mariculture wastewater; denitrification bacteria; biological mechanism; environmental factors; process parameter

收稿日期：2022-08-22? ? ?修回日期：2023-08-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32273186）；國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFD0900501）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目（2021JH2/10200012）；大連市支持高層次人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2020RQ111）；設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室開放課題項目（202211）。

作者簡介：周鵬，1979年生，女，碩士，研究方向為水處理微生物。E-mail：zpzpzzq@163.com

通信作者：韓蕊。E-mail：hanrui@dlou.edu.cn