假肺炎鏈球菌的鑒定及耐藥性分析

林曉暉 陳東科 簡夢華 陳偉明

摘要：目的 了解假肺炎鏈球菌的鑒定方法及耐藥性分析。方法 收集廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院4株假肺炎鏈球菌，用Optochin敏感試驗，膽汁溶菌試驗，肺炎鏈球菌的膠乳凝集試驗， Vitek2 Compact，Vitek MS質(zhì)譜儀， 16S rRNA基因測序進行鑒定。并對35株假肺炎鏈球菌進行藥敏試驗。結(jié)果 假肺炎鏈球菌的optochin敏感性試驗，Vitek2 ?Compact在不同培養(yǎng)條件下結(jié)果不盡相同；肺炎鏈球菌膠乳凝集試驗全部為陽性；在CO2條件下培養(yǎng)的菌株用Vitek MS質(zhì)譜儀鑒定全部為假肺炎鏈球菌；16S rRNA無法區(qū)分假肺炎鏈球菌，肺炎鏈球菌及緩癥鏈球菌三種菌群。35株假肺炎鏈球菌的藥敏試驗的結(jié)果阿齊霉素、紅霉素、克林霉素全部顯示為耐藥率為88，6%，85.7%及80%。左氧氟沙星等7種抗菌藥物全部顯示為敏感。結(jié)論 比較假肺炎鏈球菌的不同鑒定方法及其藥敏特點，為臨床鑒定和治療假肺炎鏈球菌的提供快速簡便準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞：假肺炎鏈球菌； 耐藥性；VITEK MS 質(zhì)譜儀；Optochin敏感試驗；膽汁溶菌試驗；16S rRNA基因測序

中圖分類號：R978.1 ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A ? ? ? ? 文章編號：1001-8751（2023）04-0276-05

Identification of Streptococcus pseudopnemoniae and Resistance Analysis

Lin Xiao-hui1， Chen Dong-ke2 ， Jian Meng-hua1， Chen Wei-ming1

（1 Guangzhou Panyu Central Hospital， ? Guangzhou ?511400; ?2 Beijing Hospital， ? ?Beijing ? 100730）

Abstract：Object To know the identification of Streptococcus pseudopnemoniae and resistance analysis. Methods To collect Streptococcus pseudopnemoniae of Guangzhou Panyu Central Hospital， Optochin susceptibility test， bule resolution est， Latex agglutination test and Vitek2 Compact， Vitek MS， and 16S rRNA were applied. To test the sensitivity of this drug， 35 Streptococcus pseudopnemoniae were proposed. Results The result of the Optochin susceptibility test is that， in different conditions， Vitek2 Compact is different. Latex agglutination test was positive， and Streptococcus pseudopnemoniae were identified by Vitek MS， when it grows in CO2. 16S rRNA cant divide Streptococcus pseudopnemoniae， Streptococcus pnemoniae and Streptococcus mitis. Azithromycin， erythromycin and clindamycin resistance rates were 88.6%， 85.7% and 80%. Levofloxacin and the other 7 kinds of antibiotic-sensitive rates were 100%. Conclusion Compared with different identification ways of Streptococcus pseudopnemoniae， the aim of this method is to find a more convenient， simple and accurate way for identification.

Key words：Streptococcus pseudopnemoniae； resistance；Vitek MS；optochin susceptibility；bule resolution test；16S rRNA

目前鏈球菌屬包含的菌種有100余種，草綠色鏈球菌（α-溶血的鏈球菌）可分為10余種，其中對人體致病有緩癥鏈球菌群，咽峽炎鏈球菌群，變異鏈球菌群，唾液鏈球菌群和牛鏈球菌群5個草綠色鏈球菌種群[1-2]。在α-溶血的鏈球菌當(dāng)中，假肺炎鏈球菌與肺炎鏈球菌高度類似，幾年前已從肺炎鏈球菌中劃分開，獨立成種[2-3]， 假肺炎鏈球菌的菌株常分離于下呼吸道感染的患者[2-4]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)假肺炎鏈球菌的藥敏試驗，因其在現(xiàn)有的商品MIC藥敏板上生長不良或不生長，只能選擇在血MH平板上進行紙片擴散法（K-B法），同時，其藥敏判斷折點的選擇為α-溶血的鏈球菌的藥敏折點；而肺炎鏈球菌無論在藥敏方法（MIC法）及藥敏折點的選擇均與之不同。因此，本研究對近年廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院分離的假肺炎鏈球菌進行了鑒定及藥敏分析，并以此找到假肺炎鏈球菌的鑒定及治療方法。

1 對象和方法

1.1 研究對象

廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院35株住院送檢的痰標(biāo)本中分離的假肺炎鏈球菌。

1.2 試劑來源

藥敏紙片，膠乳試劑由英國Oxoid公司提供。血M-H平板購自廣州迪景公司，鑒定試劑為法國生物梅里埃公司的質(zhì)譜儀及相應(yīng)配套靶板和基質(zhì)液以及Vitek2 Compact及相應(yīng)配套的GP鑒定卡。E試驗試條購自溫州康泰生物公司。

1.3 儀器設(shè)備

法國生物梅里埃公司的質(zhì)譜儀Vitek MS以及Vitek2 Compact、藥敏紙片分配器、恒溫培養(yǎng)箱。

1.4 細菌培養(yǎng)與鑒定

細菌分離培養(yǎng)嚴格按照《第四版全國檢驗操作規(guī)程》進行。細菌鑒定由法國生物梅里埃公司的Vitek MS質(zhì)譜儀或Vitek2 Compact進行。

1.5 Optochin敏感試驗

配制0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?，用無菌棉簽均勻涂布于含5%羊血MH平板上，10 min貼Optochin紙片，放35 ℃孵箱或35 ℃ CO2孵箱溫育過夜。抑菌環(huán)直徑≥14 mm為敏感。

1.6 膽汁溶菌試驗

試管法：分別取1 mL 6麥?zhǔn)蠁挝痪河?個試管中，于1管菌液中加0.1 mL 10%膽鹽溶液，另一管加0.1 mL無菌生理鹽水，混勻后，置35 ℃孵箱溫育 ? ?15 min，搖勻觀察結(jié)果，加鹽水管菌液濁度不度，加膽鹽溶液管菌液變澄清，判為膽汁溶菌試驗陽性[5]。

1.7 肺炎鏈球菌的膠乳凝集試驗

取幾個菌落與1滴緩沖液在試驗紙板上試驗區(qū)域充分均勻研磨，將此菌液與結(jié)合在紙板上的膠乳試劑充分均勻研磨，出現(xiàn)細沙粒凝集為陽性。

1.8 16S rRNA基因測序

將4株純培養(yǎng)的假肺炎鏈球菌進行16S rRNA基因測序。

1.9 藥敏試驗

假肺炎鏈球菌的藥敏試驗均使用紙片擴散法（K-B法）進行。取分純后的假肺炎鏈球菌配制成0.5麥?zhǔn)媳葷岬木海鶆蛲坎加谘狹-H平板上，再使用藥敏紙片分配器貼上左氧氟沙星、阿齊霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、利奈唑胺、喹奴達丁/達福普汀、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、氯霉素、萬古霉素、頭孢吡肟等藥敏紙片，青霉素則用E試驗試條進行藥敏試驗，置35 ℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后量取抑菌環(huán)的直徑，藥敏標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2021版CLSI判斷結(jié)果。

1.10 質(zhì)控菌株

質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619和金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.11 數(shù)據(jù)處理

采用Excle進行統(tǒng)計及分析。

2 結(jié)果

2.1 患者資料

共收集2017—2021年廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院住院感染假肺炎鏈球菌35株，菌株分離自35例患者，全部來自痰標(biāo)本。35株假肺炎鏈球菌分別來自ICU，16株；呼吸內(nèi)科，6株；兒科，4株；心胸外科，3株；感染疾病科，3株；血液科，1株；急診科，1株；綜合病區(qū)1株。其中年齡>80歲有7株，>60歲有21株，<1歲4株。男性有29株，女性6株。痰涂片的結(jié)果均顯示為合格的標(biāo)本，上皮細胞<10個/低倍視野，鏡下可見成雙，矛頭狀，鈍端相對的革蘭陽性球菌且部分有白細胞吞噬現(xiàn)象。35株假肺炎鏈球菌全部用Vitek MS質(zhì)譜儀進行鑒定，其中4株用于鑒定比較假肺炎鏈球菌，其中2株來自于呼吸內(nèi)科，另外兩株分別來自ICU及兒科。4例患者有呼吸道感染，其中兩例為慢性阻塞性肺病的患者。上述4株菌株是采用Vitek MS質(zhì)譜儀在2017年9月至2018年1月初次分離的4株符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的假肺炎鏈球菌。因這是本院微生物室首次從臨床上分離此菌，為了明確準(zhǔn)確地鑒定結(jié)果，從而找出快速簡便準(zhǔn)確的方法，所以本研究對此4株菌進行不同條件下用6種方法地進行比較鑒定。另外，在進行藥敏試驗時，提示假肺炎鏈球菌如采用常規(guī)肺炎鏈球菌的藥敏方法，發(fā)現(xiàn)其生長不良或不生長，遂改用了α-溶血的鏈球菌的藥敏方法。為了得到更多的藥敏數(shù)據(jù)，收集了35株假肺炎鏈球菌進行統(tǒng)計。

2.2 菌落鏡下形態(tài)

痰涂片革蘭染色直接鏡檢：痰涂片的結(jié)果顯示上皮細胞<10個/低倍視野，均為合格的標(biāo)本，鏡下可見成雙，矛頭狀，或呈短鏈排列的革蘭陽性球菌（白色箭頭所指，見圖1）。菌落形態(tài)：鈍端相對的革蘭陽性球菌且部分有白細胞吞噬現(xiàn)象。血平板上可見α-溶血，草綠色溶血環(huán)較寬大，48 h可見臍窩狀菌落（見圖2）。

2.3 CO2環(huán)境及大氣環(huán)境下Optochin敏感試驗

4株假肺炎鏈球菌的Optochin敏感試驗的結(jié)果，4株菌株在CO2環(huán)境培養(yǎng)的Optochin敏感試驗均顯示為耐藥（9～13mm），但在大氣環(huán)境培養(yǎng)的菌株的Optochin敏感試驗卻有3株顯示為敏感，一株顯示為耐藥（10mm）。結(jié)果見表1。

2.4 膽汁溶菌試驗的結(jié)果

4株假肺炎鏈球菌的膽汁溶解試驗均為加膽鹽溶液管菌液與鹽水對照管相比有50%濁度變化，不能確定膽汁溶解試驗的陰陽性。結(jié)果圖3及表1。

2.5 肺炎鏈球菌的膠乳凝集試驗

4株假肺炎鏈球菌的肺炎鏈球菌膠乳凝集試驗均呈現(xiàn)凝集試驗陽性（結(jié)果見表1）。

2.6 厭氧環(huán)境及CO2環(huán)境下Vitek2 Compact的鑒定結(jié)果

4株假肺炎鏈球在厭氧環(huán)境及CO2環(huán)境下35 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，用Vitek2 Compact的GP卡進行鑒定，厭氧環(huán)境下鑒定為毗鄰顆粒鏈，多動物鏈球菌肺炎鏈球菌麻疹孿生球齲齒羅斯菌等菌種，CO2環(huán)境下培養(yǎng)的菌株鑒定的結(jié)果有緩癥/口腔鏈球菌，肺炎鏈球菌，星座鏈球菌咽峽炎亞種等菌種，鑒定結(jié)果見表1。

2.7 厭氧環(huán)境及CO2環(huán)境下Vitek MS質(zhì)譜儀的結(jié)果

4株菌株的用Vitek MS質(zhì)譜儀厭氧環(huán)境下培養(yǎng)下的菌株為假肺炎鏈球菌，緩癥/口腔鏈球菌及肺錟鏈球菌等菌種，在CO2環(huán)境下培養(yǎng)的菌株全部鑒定為99%的假肺炎鏈球菌，結(jié)果見表1。

2.8 16S rRNA基因測序的結(jié)果

4株假肺炎鏈球菌16S rRNA基因測序的結(jié)果是假肺炎鏈球菌，肺炎鏈球菌，緩癥鏈球菌無法區(qū)分，結(jié)果見表1。

2.9 35株假肺炎鏈球菌的藥敏結(jié)果

35株假肺炎鏈球菌在體外藥敏試驗中對13種抗菌藥物敏感性，其中阿齊霉素、紅霉素、克林霉素全部顯示為耐藥率為88.6%，85.7%及80%。而左氧氟沙星、利奈唑胺、頭孢曲松、頭孢噻肟、萬古霉素、氯霉素及青霉素全部顯示為敏感，則具體藥敏結(jié)果詳見表2。

3 討論

近年在微生物檢驗工作中發(fā)現(xiàn)了一種α-溶血，48 h后可見臍窩狀，但菌落較正常肺炎鏈球菌干燥的菌株。痰涂片結(jié)果顯示為合格標(biāo)本，同時存在白細胞吞噬現(xiàn)象，證明此菌為感染菌。只有正確的鑒定才能以此為依據(jù)選擇相應(yīng)的藥敏標(biāo)準(zhǔn)進行藥敏試驗。為此，本研究收集了菌株進行了一系列的實驗對它們進行鑒定，以便找出臨床上簡單方便準(zhǔn)確的方法。

從表1可以看出，對于Optochin敏感試驗，4株菌株在 CO2環(huán)境培養(yǎng)的Optochin敏感試驗均顯示為耐藥，但在大氣環(huán)境培養(yǎng)的菌株的Optochin敏感試驗卻有3株顯示為敏感，一株顯示為耐藥。大氣環(huán)境培養(yǎng)下的Optochin敏感性試驗則已作為假肺炎鏈球菌的初篩試驗。但因日常肺炎鏈球菌的Optochin敏感試驗要求在CO2環(huán)境下進行，即使本研究中CO2環(huán)境培養(yǎng)的Optochin敏感試驗均顯示為耐藥，但其抑菌環(huán)直徑介乎于9～13mm之間，結(jié)合菌落特征，我們也不能忽視其可作為假肺炎鏈球菌的初篩試驗的可能性。而膽汁溶菌試驗的結(jié)果則顯示為加膽鹽溶液管菌液與鹽水對照管相比有50%濁度變化。不能確定膽汁溶菌試驗的陰陽性，這與Keith等[4]的報道不盡相同。故本研究中的膽汁溶菌試驗不能作為假肺炎鏈球菌的鑒定試驗。

同時本研究對4株菌株進行了的肺炎鏈球菌的膠乳凝集試驗，4株菌株結(jié)果均顯示為陽性?？梢姺窝祖溓蚓哪z乳凝集試驗不能區(qū)分肺炎鏈球菌及假肺炎鏈球菌。另外，表1顯示用Vitek2 Compact 的GP卡進行鑒定為緩癥/口腔鏈球菌或其他鏈球菌屬，但在厭氧培養(yǎng)及CO2環(huán)境培養(yǎng)用Vitek2 Compact 鑒定的結(jié)果卻不盡相同。說明GP卡并不能很好鑒定肺炎鏈球菌及假肺炎鏈球菌，緩癥/口腔鏈球菌或其他鏈球菌屬。本研究用Vitek MS質(zhì)譜儀進行鑒定，在CO2環(huán)境培養(yǎng)的菌株結(jié)果全部顯示為99%假肺炎鏈球菌；但這4株菌株在厭氧培養(yǎng)24 h后再Vitek MS質(zhì)譜儀進行鑒定，則會出現(xiàn)50%為假肺炎鏈球菌，50%為緩癥/口腔鏈球菌或其他鏈球菌屬的結(jié)果，說明不同條件培養(yǎng)對質(zhì)譜的結(jié)果也有一定的影響。本研究中顯示在CO2環(huán)境培養(yǎng)的菌株對Vitek MS質(zhì)譜儀的鑒定假肺炎鏈球菌更為合適。

16S rRNA基因測序的結(jié)果為緩癥鏈球菌，假肺炎鏈球菌及肺炎鏈球菌，三者相似率大于>99%，16S rRNA 區(qū)分菌種的標(biāo)準(zhǔn)>99%被認為屬于同一菌種，說明16S rRNA目前無法區(qū)分這三種菌群[6]。

患者資料顯示35株菌株均分離自下呼吸道感染的患者，其中年齡>80歲有7株，>60歲有21株， <1歲 4株，顯示假肺炎鏈球菌的感染可能與年齡及呼吸道感染等易感因素有關(guān)。另外，從表2我們可以看到，藥敏的結(jié)果顯示阿齊霉素、紅霉素、克林霉素全部顯示為耐藥率為88.6%，85.7%及80%，而左氧氟沙星、利奈唑胺、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、萬古霉素、氯霉素及青霉素全部顯示為敏感，這與文獻[7]報道的肺炎鏈球菌對青霉素、頭孢曲松頭及孢噻肟的藥敏結(jié)果不同，故準(zhǔn)確的菌種鑒定及正確的藥敏試驗對臨床治療是很有參考依據(jù)的。

綜上所述，比較幾種不同的假肺炎鏈球菌的鑒定方法的特點及結(jié)果，幾種方法各有優(yōu)劣，但相同的是不同的培養(yǎng)條件對假肺炎鏈球菌的鑒定有一定的影響。本研究中，Optochin敏感性試驗可以作為假肺炎鏈球菌的初篩試驗，而CO2環(huán)境培養(yǎng)的菌株Vitek MS質(zhì)譜儀的全部鑒定為假肺炎鏈球菌。兩者結(jié)合為現(xiàn)時臨床中快速簡便準(zhǔn)確鑒定假肺炎鏈球菌的最適方法。但由于用于比較的菌株較少，還有待更多的驗證。與此同時，這也說明細菌鑒定的臨床微生物檢驗應(yīng)綜合多種方法，并找到合適的條件，才能準(zhǔn)確鑒定到種。另外，也只有準(zhǔn)確地鑒定到種，才能以此選擇正確的藥敏試驗，為臨床用藥提供準(zhǔn)確的依據(jù)。

參 考 文 獻

Kawamura Y， Hou X G， Sultana F， et al. Determination of 16 S rRNA sequences of Streptococcus mitis and Stretococcus gordonii and phylogenetic relationships among members of the genus Streptococcus[J]. Int J syst bacteriol， 1995，45：406-408.

James H J， Michacal A P. 臨床微生物手冊（第11版）. [M].北京：中華醫(yī)學(xué)電子音像出版社， 2017：469-470

Arbique J C， Poyart C， Trieu-Cuot P， et al. Accuracy of phenotypic and genotypic testing for identification of Streptococcus pnemoniae and description of Streptococcus pseudopnemoniae sp.nov[J]. Clin Microbiol， 2004，42：4686-4689.

Keith E R. Podmore R G. Anderson T P， et al. Characteristics of Streptococcus pseudopnemoniae isolated from purulent sputumn sample[J]. J Clin Microbiol， 2006， 44： 923-927.

陳東科， 程燕， 張秀珍， 對奧譜托欣耐藥肺炎鏈球菌的鑒定[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志， 2005， 28（11）： 1140-1142.

Kilian M， Poulsen K， Blomqvist T， et al. Evolution of Streptococcus pnemoniae and its close commensal relatives[J]. PloS One， 2008， 3： e2683

劉青華， 王金文， 張穎， 等. 202株肺炎鏈球菌感染的臨床分布及耐藥性分析[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊， 2020， 41（1）： 61-63.