東勝鈾礦床中主要微生物成礦因素實驗研究

耿海波 付世騫 師明川 張加贏 郭會燦 安麗平

關(guān)鍵詞 細菌；成礦作用；砂巖型鈾礦；芽孢；硫酸鹽還原菌

0 引言

鈾作為高效清潔的能源，是一種關(guān)系到國家安全的戰(zhàn)略資源，因此越來越被人們所重視。砂巖型鈾礦因為具備規(guī)模大、地浸開采成本低、經(jīng)濟效益高、開采環(huán)保等特點，已成為所有鈾礦中占比最大的鈾礦類型，也是未來國內(nèi)鈾礦勘查的主攻方向[1]。過去對于成礦理論和找礦的研究工作更多側(cè)重于其中的物理因素和化學因素，人們普遍認為鈾成礦作用主要由硫化物、氫氣、硫化氫或其他還原劑，通過物理和化學作用還原U（VI）所致[2]。1991年4月4日出版的Nature 雜志公布了美國學者Lovley et al.[3]有關(guān)微生物還原鈾的實驗研究結(jié)果，揭示某些細菌能夠?qū)（VI）還原為U（IV），掀起了研究鈾和微生物相互作用的熱潮，研究熱點集中于修復鈾污染水環(huán)境的鈾—微生物作用實驗。

國內(nèi)科研團隊對于砂巖型鈾礦的生物成礦研究主要集中在十紅灘鈾礦床，筆者曾在國內(nèi)首次對十紅灘鈾礦床中的微生物分布做過研究[4]，其后多位學者的研究表明，礦床中微生物種類分布具備生物地球化學分帶性，并影響了礦床的形成[5?7]。截至目前，國內(nèi)科研工作者已對鄂爾多斯盆地北部東勝鈾礦的生物成礦進行了較多研究，已有的研究成果集中在鈾礦石中微化石推論[8]或脂肪酸生物標志間接推斷研究[9]，缺乏活體生物參與成礦的直接證據(jù)。本文對東勝鈾礦床中賦存的細菌類群進行分離鑒定，研究其分布規(guī)律以及和鈾之間的相互作用，力圖為成礦研究提供生物學證據(jù)，同時可為鈾污染水的微生物凈化提供技術(shù)參數(shù)。

1 成礦地質(zhì)背景

鄂爾多斯盆地東勝地區(qū)砂巖型鈾礦賦礦地層主要是中侏羅統(tǒng)直羅組河流相碎屑巖沉積，厚100～200 m，直羅組可分為上段與下段兩個巖性段[10]，其中上段以紫紅色泥巖、泥質(zhì)細砂巖為主，夾紫紅—黃褐色砂巖和灰綠色砂巖，砂體厚30～40 m，砂質(zhì)疏松。下段可分為兩個亞段，上亞段為灰綠色泥巖和灰綠色中粒細砂巖，富含有機質(zhì)，厚10～30 m；下亞段為灰色中砂巖，地層中富含有機質(zhì)、煤屑和植物殘骸，砂體厚30～60 m。鈾礦床主要存在于直羅組下段砂體?？氐V地層是多期辮狀河砂體[11]。含砂礦體自北向南依次發(fā)育了氧化帶—氧化還原帶—還原帶的巖石地球化學分帶。氧化帶在地表為褐黃色，氧化還原前鋒線平面上總體呈東西向展布，形態(tài)為復雜的蛇曲狀；氧化還原過渡帶呈灰色、淺灰色，富含有機質(zhì)和結(jié)核狀黃鐵礦；還原帶呈灰色，富含有機質(zhì)，可見結(jié)晶狀黃鐵礦。鈾礦化產(chǎn)于層間氧化還原帶前鋒線附近，鈾礦體呈卷狀、板狀和透鏡狀[12?13]（圖1）。

2 材料與方法

2.1 巖石采樣與處理

本研究所用巖石樣品為采自東勝地區(qū)中侏羅系直羅組不同亞帶的鉆孔巖心樣，巖心樣直徑7～8 cm，長10 cm，樣品的基本地球化學參數(shù)如表1所示。樣品采用無菌采樣裝置現(xiàn)場采樣后，放入無菌密封袋中保存避免污染，樣品取回后，在無菌室用紫外燈照射30 min后，剔除巖石表面2 cm厚覆蓋層，取巖心部分在無菌研缽中研磨至粉狀備用。

2.2 各類細菌的富集、分離和純化

參照參考文獻對各類細菌進行富集、分離純化和計數(shù)[14?15]。

2.3 各類細菌的鑒定

按照《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）進行鑒定。

2.4 不同硫酸鹽還原菌對鈾的還原作用測定

為了檢測東勝鈾礦床中分離得到的硫酸鹽還原菌對U（VI）的還原沉淀能力，設計如下兩組實驗方案。

（1） 硫酸鹽還原菌組：所用實驗液為硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基（STK 培養(yǎng)基，不添加顯色劑硫酸亞鐵銨）1 L，加入1 000 μg UO2（NO3）2·6H2O后121 ℃滅菌30 min。然后分別接入不同的硫酸鹽還原菌，置于無氧恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃靜置培養(yǎng)。

（2） 無菌對照組：實驗液中不接種硫酸鹽還原菌，其他參數(shù)同上。

培養(yǎng)后對兩實驗組鈾的價態(tài)和分布情況分別進行檢測。

2.5 樣品中硫酸鹽還原菌芽孢的測定

每個巖石樣品分兩份，一份置90 ℃加熱1 min，以殺滅其中的營養(yǎng)體細胞，另一份不做加熱處理，兩份樣品分別經(jīng)系列梯稀釋后，加入STK培養(yǎng)基于試管中28 ℃深層厭氧培養(yǎng)，每個梯度系列平行做5根試管。培養(yǎng)后觀察實驗現(xiàn)象為陽性的試管數(shù)，其中陽性指試管中培養(yǎng)液產(chǎn)生黑色沉淀并伴有H2S產(chǎn)生。根據(jù)MPN計數(shù)法得出樣品中芽孢數(shù)量和硫酸鹽還原菌菌體總量。

2.6 鈾對硫酸鹽還原菌芽孢形成的影響

為模擬礦床中不同鈾濃度對菌體形態(tài)的影響，在配制的STK培養(yǎng)基中加入與鈾礦各巖石樣品中的鈾含量等量的UO2 （NO3）2·6H2O，121 ℃滅菌30 min后，定量接入營養(yǎng)菌體，用無菌液體石蠟液封隔氧后置28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)后對芽孢比例進行檢測[16]。

3 結(jié)果與分析

3.1 各類細菌分布規(guī)律

為考察東勝鈾礦床中細菌的分布規(guī)律，對不同亞帶巖石樣品中的各屬細菌進行定性定量測定（表2）。實驗數(shù)據(jù)表明，鈾礦各亞帶巖石中細菌的種類和數(shù)量分布均呈現(xiàn)明顯的地球化學差異性：氧化帶因氧氣含量豐富，細菌種類和數(shù)量較多，好氧的鐵細菌為其中的優(yōu)勢菌群，它們發(fā)育旺盛，增殖較快，在圍巖內(nèi)部創(chuàng)造了適合各類微生物生長繁殖的微環(huán)境，但是氧化帶有機碳和硫含量較低，無法為硫酸鹽還原菌提供足夠的營養(yǎng)，影響了硫酸鹽還原菌的分布。弱氧化帶隨著氧氣濃度的下降和鈾含量的增加，細菌的種類和總量有所減少，其中鐵細菌仍是此區(qū)域的優(yōu)勢菌群，而硫酸鹽還原菌在此亞帶數(shù)量卻呈增多趨勢，顯示與鈾和硫含量的正相關(guān)性；其他細菌數(shù)量很少或未檢出，可能與巖石樣品所處的地球化學區(qū)域環(huán)境特征密切相關(guān)。礦石帶巖樣中主要的細菌類群為厭氧的硫酸鹽還原菌，這是因為區(qū)域含鈾量高，同時含氧量較低，不利于普通細菌的生長，這也證實了硫酸鹽還原菌可以適應富含高濃度鈾的環(huán)境，同時礦石帶有機碳和硫元素含量較高，能為硫酸鹽還原菌生長提供足夠營養(yǎng)，是其可以廣泛分布的主要原因。還原帶氧氣含量的進一步下降導致需氧微生物無法存活，因此在還原帶僅檢測到厭氧性硫酸鹽還原菌的存在，其數(shù)量比礦石帶稍有增加，成為還原帶最為活躍的微生物類型。從以上結(jié)果也可看出，微生物和其生存的生態(tài)環(huán)境之間相互影響，鈾含量、氧氣含量、有機碳和硫含量等因素共同決定了微生物類群的分布。從氧化帶到礦石帶的各亞帶樣品中均分離得到鐵細菌和含芽孢硫酸鹽還原菌，說明它們是東勝鈾礦巖石中的優(yōu)勢菌群，根據(jù)前人的研究結(jié)論，硫酸鹽還原菌為鈾礦形成中除了理化因素外的重要生物因素，而鐵細菌與硫酸鹽還原菌具有伴生關(guān)系[2]。

對東勝砂巖型鈾礦和十紅灘砂巖型鈾礦中細菌分布情況[5]橫向比較（表3）發(fā)現(xiàn)兩個鈾礦床各類細菌的種類與分布，尤其以硫酸鹽還原菌和鐵細菌的分布情況具有相似之處，即從氧化帶到礦石帶，硫酸鹽還原菌數(shù)量逐漸增加，而好氧性細菌類群種類和數(shù)量逐漸遞減，這些共性可在其他鈾礦研究工作中進一步分析、驗證和總結(jié)。

為了測定巖石樣品中各類硫酸鹽還原菌的分布情況，對不同亞帶巖石樣品用培養(yǎng)基在無氧環(huán)境下富集培養(yǎng)后，從產(chǎn)生黑色沉淀現(xiàn)象的樣品中分離純化得到98株典型菌株。它們?yōu)閰捬跣蜅U狀或弧狀菌，革蘭氏染色呈陰性，具備利用培養(yǎng)基中硫化物產(chǎn)生明顯的H2S氣體的特點。依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版），對分離得到的菌株進行理化性能測定并鑒定至屬（表4）。

對分離到的硫酸鹽還原菌菌株及其分布進行分析可以發(fā)現(xiàn)，不同巖石樣品中存在不同種類的具備活性的硫酸鹽還原菌，分別屬于脫硫弧菌屬和脫硫腸狀菌屬，這是東勝鈾礦床中存在硫酸鹽還原菌最直接的生物學證據(jù)。此結(jié)果和Cai et al.[8]對東勝鈾礦中微化石形態(tài)研究后得出礦石中含有硫酸鹽還原菌的推論一致，也和姜磊等[9]對東勝鈾礦砂巖檢測后發(fā)現(xiàn)存在豐富的脂肪酸，從另一角度推斷礦床中存在硫酸鹽還原菌的推斷相吻合。

分離到的硫酸鹽還原菌種類根據(jù)所處亞帶分布有所不同，其中普通脫硫弧菌只在氧化帶存在，脫硫脫硫弧菌在氧化帶和弱氧化帶有分布，而脫硫腸狀菌屬的Desulfotomaculum orientis 在各亞帶均有分布，三者分布具備一定的生物地球化學分帶性。從微生物學角度加以分析，脫硫腸狀菌在特殊環(huán)境下可以形成抗逆性極強的芽孢，有助于菌體適應各種環(huán)境，為菌體能在礦床的廣泛存在提供了保障，其他兩種硫酸鹽還原菌因不具備芽孢結(jié)構(gòu)，在遇到不適合自身生長的環(huán)境時，其適應力明顯不足[17]。

3.2 硫酸鹽還原菌對鈾試劑的還原作用

已有的實驗表明，硫酸鹽還原菌可能是影響鈾礦成礦的主要生物學因素[18?20]。為了檢測硫酸鹽還原菌在東勝鈾礦中的作用，在硫酸鹽還原菌培養(yǎng)系統(tǒng)中加入鈾試劑，經(jīng)培養(yǎng)后對還原鈾實驗液離心，收集菌體細胞，檢測鈾在菌體細胞內(nèi)外的攜帶量，以研究硫酸鹽還原菌在鈾富集過程中的機理，同時測定鈾試劑的前后濃度變化，對比它們對于鈾試劑的還原作用強度（表5）。

微生物菌體具有固定各類金屬的能力。其固定機制主要有：1）將代謝物沉淀到細胞表面或者細胞內(nèi)及胞外聚合物內(nèi)；2）與吸附有關(guān)的被動累積；3）與無機配體反應形成沉淀；4）促進不溶化合物沉淀于細胞外部；5）還原可溶性金屬形成無機礦物[21?23]。表5 數(shù)據(jù)表明菌體細胞中U（IV）攜帶量僅為沉淀中U（IV）的10%左右，扣除純化學作用在鈾沉淀中的影響，基本可以排除硫酸鹽還原菌對鈾的胞內(nèi)外吸附作用，進一步依據(jù)EJ 349.2—1988對沉淀中微量鈾進行檢測，得知實驗液沉淀中U（VI）含量隨著H2S濃度增加而遞增。這些實驗現(xiàn)象說明：在整個實驗作用過程中，硫酸鹽還原菌在增殖過程中將周圍的SO24 -還原為H2S，從中獲取其生長繁殖和代謝所需要的能量[24]，產(chǎn)生的H2S為鈾礦的形成提供還原的地球化學環(huán)境，進而將U（VI）還原為U（IV）并沉淀析出[25]。

這種菌和鈾之間的相互關(guān)系，不僅通過還原作用和溶解度來改變鈾的環(huán)境分布，而且保證了菌體能主動改變環(huán)境因素以利于自身的生存，這種相互作用的結(jié)果最終改變了鈾的存在形式，成為生物成礦的動力之一[26]。

對比表5中三組不同硫酸鹽還原菌實驗數(shù)據(jù)可以看出，在其他實驗條件相同的情況下，三種硫酸鹽還原菌最終檢測數(shù)量不同，其中Desulfotomaculum orientis的數(shù)量最多，同時產(chǎn)生的H2S的量最多，其對鈾的還原沉淀作用也最強。表4中Desulfotomaculum orientis 分布最廣泛，在礦石帶和還原帶仍大量分布，說明Desulfotomaculum orientis 是東勝鈾礦床成礦作用中的優(yōu)勢菌群，因此將其確定為后續(xù)實驗環(huán)節(jié)的主要研究對象。

3.3 主要生物成礦因素的確定

東勝鈾礦床中發(fā)現(xiàn)的硫酸鹽還原菌具備一定分布規(guī)律，從氧化帶到還原帶菌的種類分布越來越少，礦石帶和還原帶僅有Desulfotomaculum orientis 存在，早期已研究的新疆十紅灘鈾礦各亞帶菌體分布也符合此規(guī)律[5]。此結(jié)果是從已確定位置的礦床中研究細菌分布得出的規(guī)律，但是此規(guī)律并不能作為生物成礦的充分必要條件，因為許多環(huán)境中都會有脫硫腸狀菌的混合或單獨存在，因此有必要從中找到更加準確的證據(jù)。

3.3.1 間接證據(jù)

硫酸鹽還原菌參與砂巖型鈾礦成礦的間接證據(jù)是，與鈾礦物具有成因聯(lián)系的其他礦物所反映的能指示其參與成礦的依據(jù)[27]，如與鈾礦具有共生關(guān)系的黃鐵礦的δ34S。已有的研究表明，鄂爾多斯盆地東勝鈾礦床沙沙圪臺礦區(qū)氧化還原過渡帶部位黃鐵礦的δ34S介于-39.2‰～+15.8‰[28]，總體具有地層生物成因硫的特征，說明黃鐵礦的形成主要由硫酸鹽還原菌提供硫源，進而間接表明與黃鐵礦共生的鈾礦也形成于硫酸鹽還原菌的作用。其他研究包括東勝砂巖型鈾礦石中發(fā)現(xiàn)可參與還原硫酸鹽的微生物化石[8]，東勝鈾礦床中發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌和硫氧化菌類脂[9]等，這些研究結(jié)果也從側(cè)面證明了硫酸鹽還原菌曾參與鈾礦的形成。

3.3.2 正向證據(jù)

參考王紅梅等[16]研究微生物作為金礦找礦依據(jù)的思路，以鈾礦各亞帶普遍存在的Desulfotomaculumorientis為研究對象，對它們在各亞帶巖層中的天然分布狀態(tài)進行定性定量分析，以確定菌體是以營養(yǎng)體存在還是以芽孢形式存在、及其營養(yǎng)體和芽孢所占的比例（表6）。結(jié)果顯示，硫酸鹽還原菌的芽孢數(shù)目和樣品中鈾含量呈正相關(guān)性，隨著樣品中鈾含量的增加，芽孢所占比例越來越高，可推斷具有電離輻射屬性和化學毒性的鈾對Desulfotomaculum orientis 的形態(tài)具有明顯影響。然而，礦石帶Desulfotomaculum orientis依然有少部分以營養(yǎng)體形式存在，可見其在長期進化過程中不斷提高了自身適應力，而且還能通過不斷還原鈾，主動改變所賦存的環(huán)境中鈾的含量，以達到自我保護的效果。而抵抗力極強的芽孢可以幫助菌體在不良環(huán)境中存在，并通過自身代謝促進礦床的形成，隨著還原帶鈾含量的降低，芽孢又可以萌發(fā)成營養(yǎng)體繼續(xù)生長繁殖。本實驗數(shù)據(jù)表明，高濃度的鈾能促使細菌轉(zhuǎn)化成芽孢，這在微生物學上是一種常見現(xiàn)象。

3.3.3 反向證據(jù)

按2.6實驗方法模擬與各巖石樣品中相同鈾濃度的實驗環(huán)境，加入同等起始濃度的Desulfotomaculumorientis 營養(yǎng)細胞，培養(yǎng)后觀察芽孢所占比例（表7）。實驗數(shù)據(jù)表明，即使排除了背景因素差異干擾，僅改變實驗環(huán)境中的鈾濃度、其他采用相同的初始條件的實驗情況下，環(huán)境中鈾濃度越高，實驗結(jié)果中芽孢所占比例越大，鈾濃度影響了芽孢的形成率。同時對表6和表7數(shù)據(jù)進行比較作圖，分析含巖石實驗系統(tǒng)和含鈾試劑模擬實驗系統(tǒng)中的芽孢比例（圖2）。

含巖石實驗系統(tǒng)中的Desulfotomaculum orientis芽孢比例和含鈾試劑模擬實驗系統(tǒng)培養(yǎng)出的菌體芽孢比例擬合度較高，說明兩組實驗數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)合鈾礦巖石樣品中Desulfotomaculum orientis 形態(tài)分布的數(shù)據(jù)說明，鈾含量和菌體形態(tài)之間的關(guān)系可能是相互的，即巖石中鈾含量的不同可以影響菌體的存在狀態(tài)，而Desulfotomaculum orientis 也可以通過適應環(huán)境，保證自身生存的同時，影響鈾礦的形成。模擬實驗系統(tǒng)中脫硫腸狀菌狀態(tài)分布數(shù)據(jù)則從反向進一步表明，環(huán)境中不同的鈾濃度確實可以影響Desulfotomaculum orientis 的存在狀態(tài)。由于Desulfotomaculum orientis 在礦床各亞帶普遍存在，因此通過檢測不同區(qū)域Desulfotomaculum orientis 的分布以及芽孢所占比例，可作為鈾礦分帶和定位的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

（1） 東勝砂巖型鈾礦床中細菌的分布呈現(xiàn)明顯的地球化學差異性：氧化帶菌體數(shù)量和種類均較多，該區(qū)域礦石中各類元素供給充裕，它們發(fā)育旺盛，增殖較快，在圍巖內(nèi)部創(chuàng)造了適合各類微生物生長繁殖的微環(huán)境；弱氧化帶受圍巖中含鈾量增加等因素影響，細菌種類和總量開始減少；礦石帶菌體種類單一，主要的菌體種類為硫酸鹽還原菌和伴生的鐵細菌；還原帶環(huán)境中無氧氣，環(huán)境中僅有厭氧的硫酸鹽還原菌存在。細菌類群的分布與巖石樣品所處的地球化學區(qū)域環(huán)境相關(guān)，此分布規(guī)律與新疆十紅灘鈾礦床中細菌類群的分布規(guī)律類似。

（2） 硫酸鹽還原菌能利用環(huán)境中的硫產(chǎn)生H2S，形成的還原環(huán)境有利于將U（VI）還原為U（IV）并沉淀析出，是有利于鈾礦床形成的主要微生物因素，具有芽孢結(jié)構(gòu)的Desulfotomaculum orientis 相對于其他種屬的硫酸鹽還原菌適應能力和還原能力更強，是礦床形成中的主力菌群。

（3） 天然狀態(tài)和模擬狀態(tài)的Desulfotomaculumorientis 均受高濃度鈾的影響，使其由營養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?，芽孢形成的比例和鈾濃度正相關(guān)。由此可推論，含鈾量高的礦體，Desulfotomaculum orientis 大部分轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎咝问酱嬖冢虼丝赏茰y具備芽孢的Desulfotomaculum orientis 是成礦作用中的主要生物因素，其兩種生命形態(tài)的分布規(guī)律，對于生物找礦工作同樣具有指導意義。