白樺BpAMT基因家族鑒定及表達(dá)模式分析

楊海昕 劉曉瑩 詹亞光 范桂枝

關(guān)鍵詞：白樺；AMT;基因家族；基因表達(dá)模式

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，是核酸、蛋白質(zhì)和葉綠素等大分子物質(zhì)的重要組成成分。作為植物吸收無(wú)機(jī)氮素的低耗能方式，銨態(tài)氮的吸收利用效率直接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，吸收過(guò)量的銨對(duì)植物具有毒性，其吸收和代謝受到嚴(yán)格的調(diào)控。

銨態(tài)氮的吸收主要由銨根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ammoniumtransporter，AMT）調(diào)控，它將銨根離子從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而調(diào)節(jié)植株地上部分與地下部分的氮素平衡。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，基因AMT一般包括AMT1和AMT2兩個(gè)亞家族，亞家族成員之間具有相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)，但其基因結(jié)構(gòu)和成員數(shù)量不同。在基因結(jié)構(gòu)上，AMT1家族成員一般不含內(nèi)含子，多為高親和轉(zhuǎn)運(yùn)體；AMT2家族成員含多個(gè)內(nèi)含子且位置和大小基本保守，其親和性沒(méi)有明確規(guī)律；在基因數(shù)量上，AMT家族成員一般在6～16個(gè)之間。在基因表達(dá)上，AMT家族成員在根、莖和葉等的基因表達(dá)具有組織部位特異性，同時(shí)也受病毒和害蟲等生物以及氮素濃度、光照、植物激素和干旱等非生物因素的調(diào)控，如水稻（Oryza sativaL_）OsAMT1.3在根系維管束和側(cè)根原基中表達(dá)，百脈根（Lotusjaponicas Regel.）LjAMT2.1主要在根瘤細(xì)胞的原生質(zhì)膜上表達(dá)，柑橘（Citrus reticulata Blanco.）CitAMT1和棉花（Gossypium hirsutum L_）GhAMT1.3在低氮的條件下表達(dá)量大幅度提高，擬南芥（Arabidopsis thaliana L、）AtAMT1.1及轉(zhuǎn)錄水平隨日變化周期中光照強(qiáng)度的降低而下降。

在自然狀態(tài)下，土壤中的氮素受到限制或有效性降低都會(huì)限制植株的生長(zhǎng)、影響植株對(duì)碳同化物質(zhì)的分配格局以及抵抗脅迫的能力。白樺（Betula platyphyHa Suk.）是喜光耐寒的先鋒樹(shù)種，它對(duì)土壤適應(yīng)性強(qiáng)且生長(zhǎng)速度較快。研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)隨著供氮水平的增加，白樺幼苗根系、莖和口十中全氮濃度提高，其中，無(wú)機(jī)氮比有機(jī)氮更易于其生物量的積累。AMT作為氮代謝的關(guān)鍵基因之一，其家族成員在白樺中的研究還未見(jiàn)報(bào)道，尤其是其成員數(shù)量及功能還不清楚，有關(guān)AMT基因在非生物脅迫條件下表達(dá)的研究文獻(xiàn)有限。因此，本研究以10年生白樺樹(shù)、2年生白樺盆栽苗及白樺懸浮細(xì)胞為試驗(yàn)材料，基于最新公布的白樺基因組序列，篩選鑒定BpAMT家族成員，初步解析BpAMT家族成員在不同組織、不同氮素條件、日變化周期以及不同激素和非生物脅迫處理后的表達(dá)模式，該研究將為深入探究BpAMT家族成員的功能提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

白樺組培苗與懸浮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存材料，組培苗培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基附加蔗糖20g.L-1與瓊脂6.5g.L-1，每25～30d繼代1次；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基附加蔗糖20g.L-1、瓊脂8g.L-1、水解酪蛋白1g.L-1、TDZ0.6mg.L-1、6-BA 0.3mg.L-1與2，4-D0.5mg.L-1．每7d繼代1次；10年生白樺樹(shù)材料采集于東北林業(yè)大學(xué)主校區(qū)丹青樓前白樺林；2年生白樺盆栽苗培養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)逸夫教學(xué)樓旁。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析

利用擬南芥AtAMT1.1（CAA53473）. AtAMT1.2 （AAD54639）. AtAMT1.3（AAD54638）. AtAMT1.4 （CAB81458）. AtAMT1.5（NP_189072）和AtAMT2.1（NP_181363）6個(gè)AMT序列，在白樺基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)，數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址為https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank，登錄號(hào)為PRJNA285437，剔除重復(fù)序列后獲得BpAMT候選基因，進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定，確定BpAMT家族成員并進(jìn)行編號(hào)。通過(guò)在線分析軟件EXPASY進(jìn)行理化性質(zhì)分析；通過(guò)在線軟件WoLFPSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；使用MEGAX構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)樹(shù)方法選擇NJ法；使用GSDS2.0繪制基因結(jié)構(gòu)，使用在線MEME對(duì)白樺目標(biāo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)保守區(qū)進(jìn)行分析；通過(guò)在線軟件MG2C繪制基因在染色體上位置；使用TBtools進(jìn)行共線性分析；運(yùn)用SPDEv2.0確定啟動(dòng)子序列，plantcare進(jìn)行順式作用元件功能預(yù)測(cè)，導(dǎo)人TBtools進(jìn)行可視化。

1.2.2表達(dá)模式分析

1.2.2.1組織部位表達(dá)模式分析于2021年7月15日采集2年生白樺盆栽苗的根、莖和葉組織，每次取材進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，測(cè)量不同組織下BpAMT基因表達(dá)情況，采用改良的CTAB法提取總RNA，使用Takara公司ScriptTM RT試劑盒合成cDNA。使用Premier5.0設(shè)計(jì)定量引物（表1），引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，以白樺微管蛋白基因BpTu為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR分析基因表達(dá)模式，目的基因的相對(duì)表達(dá)量用：表示。運(yùn)用IBM SPSS Statistics 23軟件對(duì)BpAMT基因表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及顯著性差異分析。

1.2.2.2不同氮素處理下表達(dá)模式分析

以含不同氮源的B5培養(yǎng)液處理白樺懸浮細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照CK組（正常B5培養(yǎng)液），CKO組（CK組去除NH4N03試劑）、低濃度單一硝態(tài)氮組（CKO組添加0.1 mmoI.L-1KN03試劑）、高濃度單一硝態(tài)氮組（CKO組添加3mmoI.L-1KN03試劑）、低濃度單一銨態(tài)氮組（CKO組添加0.1mmoI.L-1NH4CI試劑）與高濃度單一銨態(tài)氮組（CKO組添加3mmoI.L-1NH4CI試劑）為實(shí)驗(yàn)組，分別培養(yǎng)白樺懸浮細(xì)胞，每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，在1d后取樣測(cè)量不同處理下BpAMT基因表達(dá)量的變化情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及顯著性差異分析。

1.2.2.3日變化表達(dá)模式分析于2020年8月3-4日1個(gè)日周期內(nèi)，每隔3h取樣1次，共9個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集主校區(qū)丹青樓前10年生白樺樹(shù)葉片，每次取材進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，對(duì)不同時(shí)間下BpAMT基因表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2.4不同激素處理下表達(dá)模式分析選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的白樺盆栽苗，分別用100umoI.L-1茉莉酸甲酯（MejA）、100mg.L-1赤霉素（GA3）和10umoI.L-1脫落酸（ABA）處理24h后取樣，每次取材進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，測(cè)量不同激素處理下BpAMT基因表達(dá)量的變化情況。

1.2.2.5不同非生物脅迫下表達(dá)模式分析選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的白樺盆栽苗，分別用50mmoI.L-1氯化鎘（CdC12）、10%（W/V）PEG6000和4℃環(huán)境模擬重金屬、干旱和低溫脅迫，處理24h后取樣，每次取材進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，測(cè)量不同非生物脅迫下BpAMT基因表達(dá)量的變化情況。

2結(jié)果與分析

2.1BpAMT家族成員鑒定及基本特征分析

從白樺基因組中篩選鑒定了9個(gè)BpAMT基因，分別編號(hào)為BpAMT1.1～1.4、BpAMT2.1～2.5（表2）。對(duì)BpAMT蛋白理化性質(zhì)分析表明：氨基酸殘基數(shù)范圍為384～522，分子量范圍為41.64～57.46kD，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)范圍為4.61～8.16。BpAMT蛋白親水系數(shù)均為正值，均為疏水性蛋白。此外，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：BpAMT主要定位于膜結(jié)構(gòu)上，多分布在葉綠體、質(zhì)膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這可能與BpAMT蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)。BpAMT基因成功定位于第3、5、8、13和14條染色體上，其中，第5號(hào)染色體上分布基因最多，有3個(gè)基因，且均分布在染色體下端。第8號(hào)和13號(hào)染色體上基因分布最少，均有1個(gè)基因。BpAMT2.1和BpAMT2.2在第14號(hào)染色體上的位置接近，并且二者的序列長(zhǎng)度和基因結(jié)構(gòu)相似，可能是BpAMT中的串聯(lián)復(fù)制基因。

2.2BpAMT系統(tǒng)發(fā)育分析

如圖1所示，將白樺BpAMT與擬南芥、柑橘、百脈根、楊樹(shù)（Populus trichocarpa Torr.＆Gray）、茶樹(shù)（Camellia sinensis L）和杜梨（Pyrusbetulifolia Bunge.）AMT氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示：BpAMT家族分為BpAMT1與BpAMT2兩個(gè)進(jìn)化支，在9個(gè)BpAMT基因中，其中4個(gè)屬于BpAMT1亞家族，5個(gè)屬于BpAMT2亞家族。其中BpAMT1.4與BpAMT1亞家族中其余3名成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與杜梨PbAMT1.3、PbAMT1.5及楊樹(shù)PtrAMT1.6聚類在一起。白樺BpAMT與楊樹(shù)PtrAMT聚類最多，親緣關(guān)系較近。

2.3基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

為了了解BpAMT基因的序列特征，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及保守基序進(jìn)行分析。圖2A表明：BpAMT1.1～1.3均含有—個(gè)1個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子；BpAMT1.4含有4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子；BpAMT2基因序列包含3～6個(gè)外顯子與3～5個(gè)內(nèi)含子，且具有未翻譯區(qū)結(jié)構(gòu)。

BpAMTs保守基序見(jiàn)圖2B，BpAMT兩個(gè)亞家族中均存在motif 4、5、6、7、9這5種保守基序。BpAMT2亞家族成員氨基酸序列中含有特定識(shí)別基序motif3，除BpAMT1.4外，BpAMT1亞家族成員氨基酸序列中含有特定識(shí)別基序motif10，motif 7在兩個(gè)亞家族中都存在，但是位置有很大差異，motif 7在BpAMT1的5端，而在BpAMT2的中段。BpAMT的保守性較高，同一個(gè)亞家族的BpAMT蛋白motif分布較相似，這些保守motif的存在保證了家族成員在轉(zhuǎn)運(yùn)銨鹽中發(fā)揮穩(wěn)定的作用。

2.4順式作用元件分析

提取BpAMT基因編碼區(qū)上游2000bp的核苷酸序列，根據(jù)BpAMT基因家族的性質(zhì)，去除一般性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和功能未知元件，圖3表明：發(fā)揮功能的元件主要分為3類：逆境脅迫響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件及植物激素響應(yīng)元件，從中選取了10種重要的順式元件進(jìn)行可視化。

除BpAMT1.3外，其余BpAMT啟動(dòng)子區(qū)具有1～2個(gè)逆境響應(yīng)元件，包括TC-rich repeats元件、響應(yīng)干旱脅迫的MYB元件以及響應(yīng)低溫脅迫的LTR元件，說(shuō)明這些成員與逆境應(yīng)答密切相關(guān)。BpAMT啟動(dòng)子區(qū)的光反應(yīng)元件主要為G-box元件，除BpAMT1.2與BpAMT2.5不包含光反應(yīng)元件外，其余BpAMT啟動(dòng)子區(qū)具有1～3個(gè)光響應(yīng)元件，BpAMT2.3啟動(dòng)子區(qū)具有參與晝夜節(jié)律調(diào)控的元件。BpAMT啟動(dòng)子區(qū)激素響應(yīng)元件種類較多，主要有參與脫落酸反應(yīng)的ARBE元件、響應(yīng)生長(zhǎng)素的TGA-box元件、參與水楊酸反應(yīng)相關(guān)的TGA-motf元件以及響應(yīng)赤霉素的TATC-box元件，表明BpAMT可能受到各種不同激素的調(diào)控。以上結(jié)果表明，BpAMT可能與逆境應(yīng)答、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)。

2.5BpAMT的組織部位表達(dá)模式分析

如圖4所示，BpAMT家族基因在組培苗和盆栽幼苗根、莖和葉中的表達(dá)趨勢(shì)相同，均呈現(xiàn)葉>根>莖趨勢(shì)，其中，在盆栽苗和組培苗莖和葉部位BpAMT1.1的表達(dá)量最高，分別為153.05和377.41、267.88和253.06；在盆栽苗和組培苗根、莖、葉中BpAMT1.3的表達(dá)量均最低，分別為9.35、2.14、1和1、12.18、2.19。

2.6不同氮素條件下BpAMT的表達(dá)模式分析

如圖5所示，BpAMT家族基因在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮處理后的表達(dá)趨勢(shì)不同。在去除培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮源（CKO）的條件下，除BpAMT2.3之外的BpAMT表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)；在KN03與NH4CI處理下，BpAMT1.1和2.1表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，其余BpAMT在KN03處理下均呈下調(diào)趨勢(shì)，其余BpAMT1與BpAMT2在NH4CI處理下呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，其中，BpAMT2.1表達(dá)量在CKO、3mmoI.L-1 KN03.0.1mmoI.L-1NH4CI與3mmoI.L-1NH4CI處理下均呈上調(diào)趨勢(shì)，表達(dá)量分別為對(duì)照組的19、58、50和18倍。BpAMT1.3和1.4的表達(dá)量在不同氮素條件下的表達(dá)都比較低，這可能與其較大的基因家族有關(guān)系，表明家族基因之間存在功能冗余。

2.7BpAMT的日變化表達(dá)模式分析

如圖6所示，BpAMT1.1、1.3、2.1、2.2和2.3表達(dá)量在3：00-15：00時(shí)段呈上升趨勢(shì)，在18：00-0：00時(shí)段呈下降趨勢(shì)，BpAMT1.4和2.4的日變化規(guī)律與之相反。不同基因表達(dá)量達(dá)峰值的時(shí)間不同，BpAMT1.1和1.3表達(dá)量在18： 00達(dá)到峰值，BpAMT2.1、2.2和2.3表達(dá)量在15： 00達(dá)到峰值，BpAMT1.4表達(dá)量在00：00達(dá)到峰值，BpAMT2.4表達(dá)量在3：00達(dá)到峰值。

2.8BpAMT在激素處理下的表達(dá)模式分析

如圖7所示，BpAMTs在MejA、GA3和ABA處理下呈現(xiàn)不同的表達(dá)特征。經(jīng)MejA處理后，除BpAMT1.3和BpAMT2.1外，其余7個(gè)BpAMT的表達(dá)量上調(diào)，其中，BpAMT1.4表達(dá)量在根部上調(diào)最明顯，為對(duì)照組的4.18倍，BpAMT2.7表達(dá)量在根部下調(diào)最明顯，為對(duì)照組的0.14倍。經(jīng)ABA處理后，BpAMT1.1、2.1、2.2和2.5的表達(dá)量上調(diào)，其余5個(gè)BpAMT的表達(dá)量下調(diào)，其中，BpAMT2.7表達(dá)量在Ⅱ十片中上調(diào)最明顯，為對(duì)照組的6.01倍，BpAMT1.3表達(dá)量在莖部下調(diào)最明顯，為對(duì)照組的0.18倍。經(jīng)GA3處理后，BpAMT1.1、2.2和2.4的表達(dá)量上調(diào)，BpAMT2.5的表達(dá)量下調(diào)，其余5個(gè)BpAMT的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，其中，BpAMT2.2表達(dá)量在根部上調(diào)最明顯，為對(duì)照組的6.17倍，BpAMT2.5表達(dá)量在葉片下調(diào)最明顯，為對(duì)照組的0.41倍。在MejA、GA3和ABA處理下，BpAMT1.1和2.2在葉、莖和根中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，BpAMT受多種激素的誘導(dǎo)表達(dá)，但對(duì)不同激素的響應(yīng)程度與響應(yīng)部位存在差異。

2.9BpAMT在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

如圖8所示，BpAMT在低溫、干旱和氯化鎘處理下呈現(xiàn)不同的表達(dá)特征。經(jīng)低溫處理后，BpAMT1.2、7.4、2.2、2.4和2.5的表達(dá)量上調(diào)，BpAMT1.1和2.3的表達(dá)量下調(diào)，其中，BpAMT2.4在莖部上調(diào)最明顯，為對(duì)照組的12.25倍，BpAMT1.1在根中下調(diào)最明顯，為對(duì)照組0.13倍。經(jīng)干旱處理后，BpAMT1.1、1.4、2.1和2.3的表達(dá)量上調(diào)，BpAMT1.2、1.3、2.2和2.5的表達(dá)量下調(diào)，其中，BpAMT1.4在莖部上調(diào)最明顯，為對(duì)照組的9.97倍，BpAMT2.5在莖部下調(diào)最明顯，為對(duì)照組的0.13倍。經(jīng)氯化鎘處理后，BpAMT2.1和2.4的表達(dá)量上調(diào)，BpAMT2.2和2.3的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，其余BpAMT的表達(dá)量下調(diào)，其中，BpAMT2.4的表達(dá)量在莖中上調(diào)最明顯，為對(duì)照組的9.74倍，BpAMT1.3在莖中下調(diào)最明顯，為對(duì)照組的0.09倍。在低溫、干旱和氯化鎘處理下，BpAMT2.1在葉、莖和根3個(gè)組織部位中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，BpAMTs在不同非生物脅迫中的表達(dá)情況存在差異，推測(cè)在逆境中發(fā)揮不同的作用。

3討論

銨是植物根系吸收的經(jīng)濟(jì)有效的一種氮素形式，AMT介導(dǎo)的高親和力銨跨質(zhì)膜運(yùn)輸是植物根系吸收銨的主要途徑。近年來(lái)，有關(guān)植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)銨態(tài)氮的分子機(jī)制有了較大突破，特別是隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，擬南芥、谷子（Setariaitalica Beauv.）、玉米（Zea maysL_）及甘蔗（Saccharum officinarum L-）等植物的AMT遺傳信息逐步被發(fā)掘。

白樺基因組數(shù)據(jù)的公布為系統(tǒng)解析BpAMT家族成員提供了可能。因此，本論文基于白樺基因組和本研究室獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共篩選了9個(gè)具有完整Ammonium-transp superfamily結(jié)構(gòu)域的BpAMTs，與已報(bào)道的植物AMT家族分為AMT1和AMT2兩個(gè)亞家族一致，9個(gè)BpAMTs也分為兩類，其中，4個(gè)屬于BpAMT1亞家族，5個(gè)屬于BpAMT2亞家族。

BpAMT2亞家族成員的氨基酸序列中均具有特定識(shí)別基序motif 3，保守基序的數(shù)量和位置相同，其基因結(jié)構(gòu)中外顯子數(shù)目在3～6個(gè)之間，這與葡萄（Vitis vinifera L．）、水稻與百脈根等植物AMT2亞家族成員的報(bào)道一致; BpAMT1亞家族成員BpAMT1.1～1.3的氨基酸序列中保守基序的數(shù)量和位置相同，均含有特定識(shí)別基序motif10，基因結(jié)構(gòu)中不含內(nèi)含子，這也與大麥（Hordeum vulgare Ll）和楊樹(shù)等植物中大多數(shù)AMT1基因不含內(nèi)含子的報(bào)道一致。BpAMT1.4基因結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)內(nèi)含子，其氨基酸序列中缺失motif8和BpAMT1亞家族特定識(shí)別序列motif10，但其它保守基序的數(shù)目和位置都與BpAMT1.1～1.3相同；進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，BpAMT1.4與BpAMT1.1～1.3定位在同一分支上，故將其歸類于BpAMT1亞家族。BpAMT1.4氨基酸序列中缺失motif10可能與其結(jié)構(gòu)演化過(guò)程中內(nèi)含子的獲得有關(guān)，同時(shí)推測(cè)其可能參與特殊的銨轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

基因家族的進(jìn)化過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)基因復(fù)制、擴(kuò)展、丟失和漂移等事件，BpAMTs也出現(xiàn)了基因片段復(fù)制事件，且不均勻分布于5條染色體上。由此推測(cè)，為了適應(yīng)不同生境下的氮素種類及供給量，白樺在進(jìn)化過(guò)程中可能通過(guò)擴(kuò)展BpAMT基因家族來(lái)適應(yīng)環(huán)境。啟動(dòng)子順式式作用元件分析顯示：BpAMTs含有多個(gè)脅迫響應(yīng)元件、激素響應(yīng)以及光反應(yīng)元件等，表明BpAMTs基因潛在的重要功能。同一亞家族內(nèi)成員含有的元件類型和數(shù)量也各不相同，表明BpAMTs的表達(dá)調(diào)控方式具有一定的特異性。

植物AMT基因的表達(dá)具有組織特異性，如擬南芥在根中表達(dá)最高，在莖中表達(dá)最高，AtAMT1.4在花粉中專一性表達(dá)。同樣，在2種白樺材料中對(duì)BpAMTs的組織部位表達(dá)模式進(jìn)行了驗(yàn)證，不同組織部位的BpAMTs表達(dá)趨勢(shì)均為葉>根>莖。由此推測(cè)，BpAMTs基因表達(dá)主要受葉片中系統(tǒng)氮態(tài)信號(hào)以及根系中局部銨態(tài)信號(hào)的控制。在響應(yīng)光照的日變化中，菜心BcAMTs基因表達(dá)量在6：00-12： 00為上升趨勢(shì)，15：00-00：00呈下降趨勢(shì)，在中午12：00時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。同樣，BpAMT1.1、1.3與BpAMT2.1～2.3的在同一日周期內(nèi)的表達(dá)量也有相似的趨勢(shì)，而BpAMT1.4、BpAMT2.4日變化趨勢(shì)與之相反，表明在光照逐漸減少的情況下，白樺通過(guò)提高BpAMT1.4、BpAMT2.4基因的表達(dá)，維持植物夜間的銨根離子吸收。由此可見(jiàn)，BpAMTs表達(dá)受日變化光周期的影響，而銨根離子吸收速率是否具有日變化趨勢(shì)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

一般情況下，缺氮或低氮條件對(duì)銨根離子的吸收有促進(jìn)作用，不同的氮源對(duì)銨根離子的吸收也有影響，硝酸根作為氮代謝過(guò)程中氮元素吸收同化的源頭，可以在酶促反應(yīng)下合成銨根離子，作為銨根離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因，BpAMTs表達(dá)的規(guī)律性有待明確。BpAMTs在不同氮素處理下呈現(xiàn)不同的表達(dá)特征。在缺氮條件下，除BpAMT2.3外，其余BpAMTs表達(dá)量均上升，這與柑橘、地錢（Marchantiapolymorpha L-）及小麥[29]在缺氮后AMT基因表達(dá)趨勢(shì)相似；在高濃度單一硝態(tài)氮為氮源的條件下，BpAMT2.1、1.1與2.5表達(dá)量顯著提高，推測(cè)這可能與高濃度單一硝態(tài)氮對(duì)懸浮細(xì)胞產(chǎn)生了脅迫有關(guān)系，使之趨向于吸收耗能更低的銨根離子。

研究表明，氮素形態(tài)影響植物體內(nèi)部分激素的合成和運(yùn)輸，同時(shí)通過(guò)外施激素也可以增加植物的氮素利用率。外源激素是影響AMT基因表達(dá)的重要因素，MejA和ABA處理杜梨后，發(fā)現(xiàn)PbAMT1.5的表達(dá)顯著上調(diào); GA3和NAA處理毛竹后，多個(gè)PeAMTs顯著上調(diào)，PeAMT4顯著下調(diào)。BpAMT對(duì)激素的響應(yīng)存在差異，BpAMT1.1、2.1、2.2、2.4和2.5對(duì)MejA、GA3和ABA處理均具有敏感性，其中，BpAMT1.1和2.2在葉．莖和根中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，且在根部響應(yīng)最強(qiáng)烈，推測(cè)白樺根部銨根離子的吸收過(guò)程與激素互相作用，共同調(diào)節(jié)白樺的根系發(fā)育。

非生物脅迫是影響植物銨根吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因素。干旱脅迫下楸子（Malus prunifolia Borkh.）MpAMT1.2和4.2的表達(dá)顯著上調(diào)；茶樹(shù)在鹽脅迫下CsAMT1.3b和3.1表達(dá)顯著下調(diào)，CsAMT1.1a、2.1a和3.3表達(dá)顯著上調(diào)。BpAMT對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)存在差異，BpAMT1.1、1.2、2.1和2.5對(duì)低溫、干旱和鎘脅迫處理均具有敏感性，其中，BpAMT2.1在葉、莖和根3個(gè)組織部位中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，且在莖部響應(yīng)最強(qiáng)烈，可能由于脅迫處理改變了不同組織部位對(duì)銨態(tài)氮的利用度，打破了銨根離子在根與莖之間運(yùn)輸過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致BpAMT在莖部的表達(dá)改變。鎘脅迫下的下調(diào)基因數(shù)量最多，可能因?yàn)镹H4+與Gd2+同為陽(yáng)離子，白樺通過(guò)抑制銨根離子的吸收降低植物對(duì)Cd2+的吸收，對(duì)植物本身起保護(hù)作用。由此認(rèn)為，BpAMT基因可能通過(guò)在逆境環(huán)境中調(diào)節(jié)銨態(tài)氮的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，從而保證氮代謝的穩(wěn)定性。以上結(jié)果為白樺氮素吸收代謝與激素以及非生物逆境之間的互作研究提供了參考思路。

4結(jié)論

從白樺基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了9個(gè)BpAMT家族成員，定位到白樺5條染色體上，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系和結(jié)構(gòu)特征分為2個(gè)亞家族。BpAMT基因表達(dá)具有組織部位特異性，受日變化、不同氮素、激素和非生物脅迫等影響，其中，BpAMT1.1與BpAMT2.1響應(yīng)較強(qiáng)。以上結(jié)果為BpAMT家族成員的功能研究提供了有價(jià)值的信息和可靠的候選基因。