植物病原細(xì)菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)研究進(jìn)展

夏雄飛　薄淑文　韓長(zhǎng)志

關(guān)鍵詞：植物病原細(xì)菌；T6SS；結(jié)構(gòu)域；功能；遺傳關(guān)系；研究綜述

中圖分類號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）04-0183-10

細(xì)菌可以引起植物、動(dòng)物以及人類嚴(yán)重的病害，在其侵染過程中，主要通過多種分泌系統(tǒng)以完成與宿主之間的互作。其中，Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS，Type Ⅵ secretory system）可以通過釋放效應(yīng)蛋白至鄰近靶細(xì)胞，包括對(duì)于宿主的攻擊性和種間競(jìng)爭(zhēng)的防御性等作用。此外，T6SS還具有參與生物被膜形成等能力，在細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、生存定殖、侵染宿主致病等過程中發(fā)揮著重要作用。

有關(guān)T6SS的研究可以追溯至1996年，當(dāng)時(shí)，學(xué)者對(duì)霍亂弧菌（Vibrio cholerae）中一個(gè)缺乏可識(shí)別信號(hào)肽的序列HCP（Hemolysin CoregulatedProtein）橫跨細(xì)胞內(nèi)外膜分泌蛋白開展研究，明確其對(duì)病原細(xì)菌的毒力、定殖能力以及環(huán)境適應(yīng)性等有重要影響。2006年，Pukatzki等人發(fā)現(xiàn)除HCP外，V.cholerae中的VgrG蛋白同樣存在胞外輸出現(xiàn)象，然而，其均不含信號(hào)肽且與T3SS或T4SS并不相同，因此，首次提出了T6SS概念。此后，2012年《Nature》論文系統(tǒng)闡述了T6SS分泌模型，即一個(gè)通過獨(dú)特的基座結(jié)構(gòu)與內(nèi)膜相連，往復(fù)于延伸或收縮構(gòu)象的長(zhǎng)管外包彈簧狀結(jié)構(gòu)鞘（主要由HCP、TssB/C組成），保持在組裝、快速收縮、釋放、拆卸和重新組裝之間循環(huán)，與T4噬菌體類似，基座結(jié)構(gòu)將收縮信號(hào)傳遞給鞘，并且擁有保守的觸發(fā)機(jī)制。通常細(xì)菌基于T6SS系統(tǒng)以接觸依賴性傳輸毒性蛋白，諸如肽聚糖酶、磷脂酶、ATP酶等效應(yīng)子，面對(duì)營(yíng)養(yǎng)壓力時(shí)通過T6SS將其輸送至競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。

學(xué)術(shù)界關(guān)于細(xì)菌中T6SS的研究多以銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為主，而有關(guān)植物病原細(xì)菌T6SS的研究，最早見于2010年關(guān)于梨火疫病菌（Erwinnia amylovora）的報(bào)道。鑒于丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）、青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、梨火疫病菌、稻生黃單胞菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzicola，Xoc）等5種植物病原細(xì)菌對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)危害的嚴(yán)重性，有關(guān)上述細(xì)菌T6SS的調(diào)控機(jī)制、作用機(jī)制以及結(jié)構(gòu)功能等研究報(bào)道逐年增加。然而，尚未見不同植物病原細(xì)菌中T6SS的系統(tǒng)性對(duì)比分析報(bào)道。因此，本研究以前人研究成果為基礎(chǔ)，對(duì)上述植物病原細(xì)菌中T6SS蛋白的數(shù)量、種類、遺傳分類以及結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行綜述，以期明確不同植物病原細(xì)菌中T6SS在其功能蛋白及遺傳關(guān)系等方面存在的差異性，并指出了T6SS研究中存在的一些問題。

1 T6SS的結(jié)構(gòu)

T6SS主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中，以P.aeruginosa為例，典型的T6SS裝配結(jié)構(gòu)與噬菌體尾部穿膜結(jié)構(gòu)類似，存在于內(nèi)外膜組織之間，是基于細(xì)胞接觸依賴性的多組件跨膜通道。筆者利用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（NCBI）數(shù)據(jù)庫，對(duì)5種植物病原細(xì)菌（P.syringae、R.solanacearum、A.tumefaciens、E.amylovora、Xoc;登錄號(hào)分別為：GCF_016694755.2、GCF_001587155.1、GCF_003667905.1、GCF_000091565.1、GCF001021915.1）中共138個(gè)T6SS蛋白序列進(jìn)行搜索下載、整理，利用蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析軟件SMART進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)19種T6SS蛋白存在于5種細(xì)菌中，且不同種細(xì)菌擁有蛋白的類別與數(shù)量不盡相同，具有一定多樣性。同時(shí)，除VgrG的蛋白序列長(zhǎng)度在不同細(xì)菌之間差異較大，為296～917 aa，其余同種T6SS蛋白之間長(zhǎng)度差別相對(duì)較小，具有一定保守性（圖1）。T6SS蛋白種類主要包括跨膜復(fù)合體TssM（ImcF）、TssJ（SciN）、TssL（DotU）；基座亞基TssE（GPW_gp25）、TssF、TssG、TssK（VasE）；彈簧狀伸縮鞘大亞基TssC（VipB）、小亞基TssB（VipA）、管狀蛋白HCP；尖端效應(yīng)子結(jié)合蛋白VgrG（Phage_GPD）；裝卸輔助蛋白TssA（ImpA_N）；調(diào)控蛋白TagF（DUF2094）、TagH（FHA）、TssH（Clp_N）；酰胺酶效應(yīng)蛋白Tae4、酰胺酶免疫蛋白Tai4。此外，E.amylovora與Xoc分別獨(dú)有IcmF（Vask）、CagE_TrbE_VirB等結(jié)構(gòu)域的T6SS分泌蛋白（蛋白ID分別為WP_004160264.1、WP_047340360.1）。通過對(duì)T6SS蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行解析，明確不同病原細(xì)菌具有相似的T6SS蛋白組成、不同的蛋白數(shù)量以及部分物種特有的結(jié)構(gòu)域，與前人明確R.solanacearum中HCP、VgrG蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分別與P.aeruginosa、大腸桿菌（Escherichiacoll）的HCP、VgrG相似等結(jié)果類似。

具體而言，VgrG是一個(gè)三聚體狀的尖端效應(yīng)子結(jié)合蛋白，是對(duì)靶細(xì)胞執(zhí)行毒性功能的核心蛋白，在5種植物病原細(xì)菌中均具有較多的數(shù)量（表1）；TssM/J/L是一個(gè)跨內(nèi)外膜復(fù)合體結(jié)構(gòu)，是效應(yīng)子等蛋白的膜運(yùn)輸通道；TssE/F/G/K是一個(gè)錨定于內(nèi)膜并鏈接TssM/J/L結(jié)構(gòu)的漏斗狀復(fù)合體基座，用以VgrG蛋白的識(shí)別與吸附；HCP是一個(gè)管狀蛋白，當(dāng)T6SS開始裝配時(shí)，其一端依附于VgrG，行使VgrG等尖端蛋白受力功能；TssB/C是一個(gè)空心彈簧狀蛋白復(fù)合體，包裹于HCP外側(cè)，是VgrG與HCP等結(jié)構(gòu)被執(zhí)行推力的來源；TssA是一個(gè)T6SS裝卸輔助識(shí)別蛋白，當(dāng)T6SS開始裝配時(shí)，其—側(cè)可分別粘連VgrG、TssB/C和HCP，并有序進(jìn)行組裝；TssH屬于AAA+ATP酶超家族和ClpV亞家族，主要在TssB/C鞘收縮釋放T6SS效應(yīng)子過程中起作用；TagF通過與TagH相互作用來調(diào)節(jié)T6SS效應(yīng)子的分泌過程；Tae4作為效應(yīng)子參與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)中對(duì)目標(biāo)細(xì)菌肽聚糖和膜脂的侵蝕；Tai4作為免疫蛋白用于抵御Tae4，它們與VgrG基因編碼相關(guān)聯(lián)。上述蛋白具有不同的功能，使T6SS在不同環(huán)境下執(zhí)行多種生存策略，分泌多種效應(yīng)蛋白，從而在結(jié)構(gòu)域之間以及結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)子之間具有相互緊密配合的特點(diǎn)，進(jìn)而適應(yīng)多變的細(xì)胞環(huán)境。

一般而言，T6SS中的TssM/J/L、TssE/F/G/K分別被組裝成跨膜通道和基座復(fù)合體，隨后TssB/C彈簧鞘的收縮推動(dòng)HCP管、VgrG突刺和效應(yīng)子并通過T6SS跨膜通道離開細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境或附近的另一個(gè)細(xì)胞（圖2），毒性效應(yīng)子發(fā)揮作用從而導(dǎo)致靶細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡。

2 T6SS蛋白的遺傳分類

基于MEGA11軟件并根據(jù)序列同源性對(duì)上述5種植物病原細(xì)菌中138個(gè)T6SS蛋白進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，明確其可以分為3個(gè)亞家族，分別命名為A、B、C，其中TssB、TssC、TssH、Tai4等蛋白聚為A類，而TssF、TssK等聚為B類，TssM、TagH聚為C類（圖3）。在遺傳關(guān)系方面，一些蛋白同時(shí)存在于上述兩種或3種亞家族中，如TssE、TssJ、TagF等蛋白存在于A、B兩大類中；TssA、TssL、Tae4存在于A、C兩大類；TssG在A、B、C類中則分別存在1、6、1個(gè)蛋白，其中A類中僅包含A tumefaciens的TssG，C類中僅包含E.amy/ovora的TssG，這一現(xiàn)象與T6SS基因可以通過水平轉(zhuǎn)移所獲得的特性相一致，又或許是單菌種具有多個(gè)T6SS基因簇導(dǎo)致，例如，P.aeruginosa攜帶H1、H2和H3-T6SS3個(gè)基因簇，而V.cholerae只攜帶一個(gè)。對(duì)上述病原細(xì)菌T6SS蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步預(yù)測(cè)分析，顯示C類中A tumefaciens的TssL包含OmpA結(jié)構(gòu)域（蛋白ID為WP 080867199.1），不同于A類中E.amylovora的TssL，其余蛋白聚類差異均與其保守結(jié)構(gòu)域無關(guān)。HCP與VgrG聚為一類，說明HCP與VgrG具有一定的共進(jìn)化特性。

3 T6SS蛋白的功能

3.1侵染宿主的毒性功能

植物病原細(xì)菌通過T6SS中VgrG綁定毒性效應(yīng)子（細(xì)胞壁降解酶、核酸酶、膜穿孔蛋白、磷脂酶和NADase等）傳遞至鄰近宿主細(xì)胞，通常在寄主組織內(nèi)大量定殖，引起寄主細(xì)胞質(zhì)壁分離、細(xì)胞器降解等，以達(dá)到營(yíng)養(yǎng)汲取的目的。當(dāng)前，已經(jīng)明確P.syringae、R.solanacearum、E.amylovora等細(xì)菌中有較多T6SS蛋白參與侵染宿主植物的過程。P.syringae可以對(duì)豆科、茄科、薔薇科以及十字花科等300多種經(jīng)濟(jì)作物致病，是當(dāng)前變種最多的植物病原細(xì)菌之一。前人對(duì)P.syringae中T6SS參與侵染過程的研究多集中于TssM、TssJ蛋白以及RetS、LadS和GacS/GacA調(diào)控途徑。就其蛋白功能而言，當(dāng)TssM、TssJ沉默時(shí)該菌致病性分別下降了78.7%和71.3%，同時(shí)伴隨生物膜形成與蛋白水解能力下降，然而其胞外多糖的分泌及運(yùn)動(dòng)性不受影響，并且存在突變復(fù)原現(xiàn)象，推測(cè)TssM、TssJ影響了P.syringae的自身保護(hù)膜而未參與鞭毛膜的形成，并且發(fā)生了基因水平轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致突變失效；就其調(diào)控方式而言，T6SS與T3SS可以共同被（P） ppGpp、RetS和LadS調(diào)控表達(dá)并影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，其中RetS負(fù)向控制粘液性，LadS負(fù)向調(diào)節(jié)成群運(yùn)動(dòng)；此外，低溫和植物免疫物質(zhì)也會(huì)影響T6SS基因的表達(dá)，且該過程受GacS/GacA雙組分系統(tǒng)的調(diào)控。

R.solanacearum可以侵染茄科、豆科等雙子葉草本植物及桑樹、木麻黃等雙子葉木本植物，相關(guān)研究多集中于TssM、TssB、VgrG、HCP和TssL等蛋白。就其蛋白功能而言，TssM和TssB參與了該菌的生物膜（自身保護(hù)膜和運(yùn)動(dòng)鞭毛膜）的形成過程，當(dāng)TssM和TssB沉默時(shí)，外膜蛋白、鞭毛相關(guān)基因flhC、flhD、flgM、fliA以及環(huán)磷酸腺苷受體蛋白等表達(dá)受阻。保護(hù)生物膜的失活導(dǎo)致菌株無法有效抵御來自宿主的活性氧免疫攻擊，進(jìn)而導(dǎo)致毒力減弱，然而與Wang等人研究結(jié)果不同的是，鞭毛的失活導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)受阻，進(jìn)而影響菌株在宿主植物組織的定殖能力，與此相似的是該菌中VgrG1、VgrG2也參與了菌株的運(yùn)動(dòng)形成過程，并且存在突變復(fù)原的現(xiàn)象。此外，該菌的T6SS蛋白在同宿主不同組織中所表現(xiàn)的致病能力也不同，例如在葉柄致病過程中TssL相比其他蛋白將發(fā)揮更大作用，而在根部致病過程中VgrG3占主體影響因素，這表明在不同的侵染環(huán)境中，不同T6SS蛋白貢獻(xiàn)力不同。就其調(diào)控方式而言，該菌存在多種分泌系統(tǒng)互作調(diào)控，諸如編碼VgrG1、VgrG2、HCP等蛋白的基因簇在參與T6SS的同時(shí)也影響著T3SS效應(yīng)子基因的表達(dá)。

E.amylovora可以引起薔薇科植物火疫病，主要侵染葉、花、嫩枝、果實(shí)等。相關(guān)研究集中于TssH、TssA、TssB、TssC、HCP、VgrG等蛋白。就其蛋白功能而言，位于T6SS1基因座的ClpV基因（TssH相關(guān)）與該菌中的致病效應(yīng)子梨火疫病菌素（Amylovoran）的產(chǎn)量、生物膜呈正相關(guān)，同為致病效應(yīng)子的果聚糖卻不受該基因影響，這表明不同T6SS蛋白、效應(yīng)子之間可能存在兼容性差別。同時(shí)，編碼TssA1、TssB1、TssC1和HCP1等蛋白的基因與梨火疫病毒素產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。就其調(diào)控方式而言，T6SS的HCP、VgrG與T3SS的SpaR3基因被證明參與聯(lián)合調(diào)控，此外，HCP、VgrG還與鞭毛（FlgB3）、菌毛（EAMY0247）、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)過程（pstA3、pstC3、pstS3）、硫代謝過程（cysC、cysl3、cysJ、cysN、tauA、tauB、tauC、tauD3）、趨化性（cheA1、cheB1、cher1、cheY1、che27）和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（motA1、motB1）等功能相關(guān)基因呈正相關(guān)。

3.2種間競(jìng)爭(zhēng)的拮抗功能

在細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)中發(fā)揮重要作用的各種抗菌毒素可以通過T6SS傳遞至靶細(xì)胞，當(dāng)不同植物病原細(xì)菌擁有共同的宿主侵染目標(biāo)時(shí)，便會(huì)啟用T6SS分泌多種降解酶，作為抗菌武器用以嘗試殺死營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)者。諸如在P.aeruginosa中含有H1、H2和H3-T6SS3個(gè)基因簇，其中H1-T6SS專注于自身防御，僅用于檢測(cè)到被異種細(xì)菌攻擊時(shí)的反擊作用，同時(shí)，細(xì)菌同種群之間相互接收信號(hào)并分泌對(duì)應(yīng)的免疫蛋白從而避免誤傷。前人對(duì)于A.tumefaciens的T6SS的研究多集中于Tae、Tai、VgrG、基因轉(zhuǎn)移、調(diào)控方式等，其T6SS通過分泌肽聚糖酰胺酶效應(yīng)子Tae，裂解肽聚糖中的D-丙氨酸和谷氨酸鍵引起細(xì)胞增大從而抑制E.coll生長(zhǎng)，并在漫長(zhǎng)的進(jìn)化中產(chǎn)生特異性免疫蛋白Tai，用于競(jìng)爭(zhēng)過程中保護(hù)自身細(xì)胞不被Tae殺傷。同時(shí)，該菌還具有兩種依賴于保守HxxD基序的DNA酶效應(yīng)子Tde，通過引起DNA降解及細(xì)胞伸長(zhǎng)導(dǎo)致Ecoli凋亡。因此，Atumefaciens通常將Tae和Tde聯(lián)合參與營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，且在不同競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境下均可殺死E.coli、P-aeruginosa等細(xì)菌。此外，該細(xì)菌中T6SS的VgrG-a相關(guān)基因V2a編碼一個(gè)AHH家族核酸酶，同樣作為種間競(jìng)爭(zhēng)的重要效應(yīng)子。其效應(yīng)子多樣性或許與其相關(guān)基因高效轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)過程中導(dǎo)致部分細(xì)胞DNA裂解，隨后被同種間其他活細(xì)菌基因組整合，并利用整合的特異性免疫蛋白基因抵抗攻擊者。基于免疫基因轉(zhuǎn)移機(jī)制使得細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)過程中的毒性功能發(fā)揮更具挑戰(zhàn)性，同時(shí)也提供了更多效應(yīng)子的進(jìn)化途徑。產(chǎn)生T6SS特異性免疫的被攻擊者可以大大增強(qiáng)其競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，諸如在E.coli中ClpA/ClpP基因的突變使其提高了對(duì)來自A.tumefaciens的T6SS毒性攻擊，其中ClpA與ClpP相互作用是A tumefaciens的T6SS效應(yīng)子識(shí)別目標(biāo)之一。就其調(diào)控方式而言，T6SS的激活與Chvl組分或TssL的磷酸化作用有關(guān)，該蛋白調(diào)控途徑與另一項(xiàng)關(guān)于P.aeruginosa的T6SS調(diào)控方式相似。

前人對(duì)于P.syringae利用T6SS參與種間競(jìng)爭(zhēng)的研究多集中于HCP、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等。該菌中HCP2的分泌依賴于IcmF2（由HSI-Ⅱ編碼），HCP2基因的特點(diǎn)在于其與E.coli、酵母菌的競(jìng)爭(zhēng)過程中分泌活躍，而在侵染宿主植物過程中則保持沉默。然而，在HSI-I基因簇中HCP2相關(guān)的編碼基因被轉(zhuǎn)座酶終止，導(dǎo)致其相關(guān)功能喪失，該相似結(jié)果發(fā)現(xiàn)于P-aeruginosa，說明不同T6SS基因簇的功能存在專一性。此外，研究表明P.syringae中T6SS蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)與金屬離子有關(guān)，諸如VgrG相關(guān)細(xì)胞壁靶向效應(yīng)子PSPTO5413的活性依賴于鈣離子濃度，通過EF-Hand基序調(diào)節(jié)。同時(shí)，P.syringae中T6SS蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)還與環(huán)境脅迫相關(guān)，諸如在滲透壓升高后表現(xiàn)為T6SS相關(guān)基因上調(diào)。

Xoc主要危害水稻分蘗期到抽穗前期的水稻葉片，且幼齡葉片最易受害，受害較嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)50%以上甚至顆粒無收。前人對(duì)于其T6SS的研究相對(duì)較少，主要涉及HCP、VgrG等蛋白。該菌編碼2套T6SS基因簇，與細(xì)胞游動(dòng)、趨化性、生物被膜及群體感應(yīng)等表達(dá)有關(guān)，并參與調(diào)控胞外多糖和黃色素，通常利用T6SS效應(yīng)子作為群體感應(yīng)信號(hào)分子調(diào)控種間競(jìng)爭(zhēng)趨勢(shì)，相比于HCP，VgrG有著明顯的分化現(xiàn)象，進(jìn)化速度更快，并且其表達(dá)都與HCP呈正相關(guān)。與上述P.syringae相同，Xoc的T6SS2在細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)中發(fā)揮了重要作用，其中HCP2基因表達(dá)最為活躍，進(jìn)一步說明了T6SS基因簇的專一性。

4討論

4.1不同植物病原細(xì)菌中T6SS蛋白數(shù)量之間差異性

不同植物病原細(xì)菌中T6SS蛋白數(shù)量之間存在著較大的差異性。其中，E.amylovora中T6SS蛋白數(shù)量最多，為39個(gè)；P.syringae中T6SS蛋白數(shù)量次之，為37個(gè)；而A.tumefaciens僅為15個(gè)，明顯少于P.syringae與E.amylovora。推測(cè)不同細(xì)菌中T6SS蛋白數(shù)量的差異性可能與侵染宿主的種類數(shù)量有關(guān)，有待于進(jìn)一步深化對(duì)比研究。通過對(duì)5種細(xì)菌中的T6SS蛋白種類數(shù)量進(jìn)行分析，明確VgrG的數(shù)量明顯高于其他蛋白，為20個(gè)，HCP次之，為13個(gè)；除特有分泌蛋白VasK、CagE_TrbE_VirB外，TssL、TagH最少，僅有3個(gè)。上述不同蛋白之間數(shù)量的差異，推測(cè)VgrG作為效應(yīng)子結(jié)合蛋白相比其他蛋白具有更深的進(jìn)化水平，從而保證了其攜帶多種效應(yīng)子以及靶向多種細(xì)胞的毒性能力。此外，部分細(xì)菌中不含特定蛋白，如P.syringae、R.solanacearum不含TssL、TagH；A.tumefaciens不含TssJ、TagH、Tai4等（表1）。這種數(shù)量上的差異是否與細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)獲取、種間競(jìng)爭(zhēng)過程中的生長(zhǎng)發(fā)育、毒性強(qiáng)弱有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入研究。

4.2不同植物病原細(xì)菌中T6SS蛋白種類之間的差異性

在功能近似的蛋白中，如TssM/J/L作為跨膜復(fù)合體結(jié)構(gòu)，其中，TssM均來自于同一個(gè)進(jìn)化分支C，而TssJ/L卻分別聚為A、B與A、C類，且3個(gè)TssL蛋白所包含的結(jié)構(gòu)域不盡相同，推測(cè)是水平基因轉(zhuǎn)移所造成，然而各種T6SS相關(guān)基因如何進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)移還有待進(jìn)一步深入研究。HCP與VgrG的數(shù)量、結(jié)構(gòu)域以及遺傳分類均具有一定共性，其協(xié)同進(jìn)化特性與毒性功能的發(fā)揮具有怎樣的聯(lián)系？有待于進(jìn)一步探究。此外，獨(dú)特的T6SS相關(guān)分泌蛋白CagE_TrbE VirB、VasK分別聚類為A、B類群（圖3），推測(cè)其作用主要由系統(tǒng)分泌的效應(yīng)子的功能驅(qū)動(dòng)。

4.3不同植物病原細(xì)菌中T6SS蛋白功能研究方面的差異性

前人關(guān)于植物病原細(xì)菌T6SS的相關(guān)研究主要涉及效應(yīng)子釋放對(duì)宿主植物的攻擊性以及自身在種間競(jìng)爭(zhēng)過程中面對(duì)脅迫反應(yīng)的防御性兩大方面，其功能具有保守性和獨(dú)特性，其中包括結(jié)構(gòu)、分類、功能機(jī)制等的研究已經(jīng)取得了較多成果。然而，當(dāng)前在植物病原細(xì)菌的T6SS相關(guān)研究具有一定差異性，一方面，對(duì)于不同研究面其研究側(cè)重點(diǎn)不同，如在侵染宿主方面的T6SS研究主要涉及VgrG、HCP、TssM/J/L、TssB/C、TssA、TssH等眾多蛋白，而在種間競(jìng)爭(zhēng)方面主要涉及VgrG、HCP、Tai、Tae等較少的蛋白；另一方面，研究所涉及的細(xì)菌種類較少，在十大植物病原細(xì)菌中，X.oryzae pv.oryzae、X.campestris等目前鮮有相關(guān)報(bào)道，未來還有很大的發(fā)展空間。在上述5種植物病原細(xì)菌的T6SS研究報(bào)道中，多次出現(xiàn)T6SS組件參與生物膜的形成。最近研究發(fā)現(xiàn)，外膜發(fā)生的必要基因bamA、tolB和lptD并不影響P.aeruginosa中T6SS的激活，其中bamA的缺失卻導(dǎo)致了T6SS的非靶向性攻擊，說明外膜的破壞導(dǎo)致T6SS上游激活信號(hào)更加敏感，然而外膜發(fā)生必要基因和參與生物膜形成的T6SS基因有何聯(lián)系？有待于進(jìn)一步研究。此外，在植物病原細(xì)菌的T6SS中關(guān)于金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制也鮮有報(bào)道，前人已通過對(duì)泰國(guó)伯克霍爾德氏菌（Burkholderia thailandensis、）、假單胞菌（Pseudomonas）等細(xì)菌的T6SS研究明確了錳、鐵、鋅離子作為抗氧化酶的結(jié)構(gòu)成分或輔因子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。未來還需對(duì)植物病原細(xì)菌T6SS作出進(jìn)一步深入研究，將有助于細(xì)菌多種分泌系統(tǒng)的完善。

5展望

植物病原細(xì)菌通過T6SS釋放效應(yīng)蛋白進(jìn)而對(duì)宿主或其它競(jìng)爭(zhēng)菌種實(shí)現(xiàn)接觸性破壞，以達(dá)到營(yíng)養(yǎng)攝取的目的。最新研究表明，T6SS也可以采用非接觸依賴性毒性策略。在細(xì)菌與宿主以及種間協(xié)同進(jìn)化的過程中，為了克服侵染過程中的免疫障礙及競(jìng)爭(zhēng)壓力，T6SS進(jìn)化出復(fù)雜多樣的生存機(jī)制，如錳離子結(jié)合蛋白應(yīng)對(duì)宿主免疫、特異性免疫蛋白Tai、相關(guān)基因的高效水平轉(zhuǎn)移機(jī)制等。前期，本實(shí)驗(yàn)組基于生物信息學(xué)與比較基因組學(xué)方法分析黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv.raphanin）Ⅵ型分泌蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、保守基序、遺傳關(guān)系等。隨著諸多植物病原菌全基因組序列的釋放，為植物病原細(xì)菌特別是林木病原細(xì)菌致病基因的進(jìn)一步研究夯實(shí)了理論基礎(chǔ)，更多的植物病原細(xì)菌中T6SS相關(guān)蛋白被不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)于進(jìn)一步對(duì)比分析不同植物病原細(xì)菌的毒性特點(diǎn)與進(jìn)化差異，以及不同T6SS相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，發(fā)揮著重要的作用。未來學(xué)術(shù)界對(duì)于植物病原細(xì)菌中T6SS功能的進(jìn)一步解析，將有助于找尋和識(shí)別植物病原細(xì)菌的作用新靶點(diǎn)，有助于推動(dòng)預(yù)防和治療植物病害的新型農(nóng)藥的開發(fā)和利用。