短枝木麻黃根際放線菌及其抗細菌活性

單體江　謝銀燕　葉大航等

關鍵詞：短枝木麻黃；根際放線菌；青枯病菌；次生代謝產(chǎn)物；抗細菌活性

中圖分類號：S792.93 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）04-0139-10

短枝木麻黃（Casuarina equisetifolia L.）為木麻黃科（Casuarinaceae）木麻黃屬（Casuarina）常綠喬木，原產(chǎn)于澳大利亞、太平洋諸島以及亞洲東南部，喜高溫多濕氣候，適生于海岸的疏松沙地。木麻黃生長迅速、耐干旱，并具有防風固沙、耐鹽堿和生物固氮等特殊功能，被廣泛用于熱帶和亞熱帶沿海防護林的建設，是我國東南和華南沿海地區(qū)不可替代的沿海防護林樹種和當家樹種，同時也是重要的經(jīng)濟林和園林綠化樹種。近年來，由于抗病品種缺乏、栽培經(jīng)營措施不當以及自然災害等因素的影響，木麻黃病蟲害的發(fā)生也日趨嚴重，其中，青枯病是發(fā)生規(guī)模最大、危害最嚴重的病害。木麻黃青枯病是由勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種系統(tǒng)性維管束病害，被稱為木麻黃的“癌癥”或“絕癥；青枯病也是目前世界范圍內(nèi)傳播廣泛、危害嚴重、最難防治的重大細菌性病害之一，可危害54個科的450余種植物。木麻黃青枯病的大面積發(fā)生，嚴重制約著沿海木麻黃防護林的健康發(fā)展，對我國東南沿海的生態(tài)環(huán)境和生態(tài)安全構成了嚴重威脅，目前尚無有效的防控措施。

根際微生物是受植物影響最大的土壤微生物類群，蘊含著極其豐富的微生物資源。根際土壤中的有益微生物可通過直接或間接的方式促進植物生長、防治由病原菌引起的多種植物病害。因此，根際微生物是重要生物活性產(chǎn)物的來源，探究和開發(fā)根際微生物為生物防治病蟲害問題以及提高農(nóng)林業(yè)的經(jīng)濟價值提供了廣闊前景。放線菌是根際微生物中一類重要的微生物資源，目前基于微生物源活性先導化合物而研發(fā)的抗生素、免疫抑制劑、抗真菌、抗腫瘤以及抑制炎癥等藥物絕大多數(shù)來源于放線菌。Elshafie等從金合歡（Vachellia farnesiana （L.） Wight＆Arn.）和油橄欖（Canarium oleosum （Lam.） Engl.）中分離到2株根際放線菌可以很好的保護番茄（Solanum lycopersicum L.）免受核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的侵染；方正等從金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）根際土壤中分離出164株放線菌，其中，部分放線菌對多種供試細菌均表現(xiàn)出抑菌活性；葉景靜等從紅樹林根際土壤中分離出88株放線菌，其中，7株放線菌對至少一種供試細菌具有抗菌活性；吳佳等從纈草（Valeriana officinalis L.）根際土壤中共分離出118株放線菌，其中，33株放線菌對病原菌有較好的抑制效果；Kumari等發(fā)現(xiàn)，植物根際放線菌的粗提物對金黃色葡萄球菌（Staph y/ococcusaureus）、變形桿菌（Proteus vulgaris）以及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表現(xiàn)出明顯的抑制作用。放線菌可產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物抑制某些病原菌生長，促進植物生長發(fā)育，一些放線菌還可以侵染植物誘導其產(chǎn)生大量的活性次生代謝產(chǎn)物。木麻黃是一種特殊類型的共生營養(yǎng)型植物，對木麻黃共生固氮菌和菌根菌的研究一直是木麻黃研究的熱點。Gunasekera等從木麻黃固氮根瘤中分離到Frankia sp.、Micromonospora sp.和新的共生放線菌鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），其中，鏈霉菌屬放線菌能明顯促進木麻黃側根的生長。而目前對于木麻黃根際土壤放線菌的報道較少，Abhijit等從印度不同地區(qū)的木麻黃根際土壤中共分離到14株鏈霉菌屬放線菌，其中部分放線菌對3種供試細菌（Bacillus subtilis、Escherichiacoli和Xanthomonas citri）中的1種或2種表現(xiàn)出抑菌活性，所有放線菌對供試植物病原真菌（Fusarium oxysporum）都表現(xiàn)出抑制活性。本研究通過采集短枝木麻黃根際土壤，分離鑒定根際土壤中的放線菌，并測定短枝木麻黃根際放線菌次生代謝產(chǎn)物的抗細菌活性，從中篩選出抗勞爾氏菌的活性菌株，進一步采用HPLC分析活性菌株次生代謝產(chǎn)物的情況，以期為木麻黃青枯病的生物防治以及放線菌資源的綜合開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1短枝木麻黃根際土壤的采集

短枝木麻黃根際土壤于2018年6月采自雷州半島的廣東省湛江市雷州市，選取8個不同地點采集樣品，分別為A（20°58′43”N；110°7′52”E）、B（20°48'60″N; 110°20′2″E）、C（20°49′3″N;110°20'49″E）、D（20049′4″N; 110°20′49″E）、E（20°47′32″N; 110023′10″E）、F（20°47′32″N;110°23′10″E）、G（20°47′37″N; 110°23′8″E）和H（20°47′35″N；110°23′8″E）。采集時選取健康的短枝木麻黃植株，在主干1.5 m范圍內(nèi)從4個不同的方向挖取距離地面15～30 cm的根系，將根系挖出后采用抖根法收集根系掉落的土壤，將4個不同方向采集的土壤合并在一起用自封袋密封后立即帶回實驗室，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2根際放線菌的分離和純化

采用熱擊稀釋法分離短枝木麻黃根際土壤中的放線菌。首先將采集的土壤充分混勻，去除雜質后取1g土壤置于100 mL的旋蒸瓶內(nèi)，加入10 mL無菌水，在50℃無壓條件下采用OSB-2100旋轉蒸發(fā)器（東京理化器械株式會社）旋轉15min，使其充分混勻；而后取1 mL混勻后的土壤懸濁液于15 mL離心管內(nèi)，并向其加入9mL無菌水，充分混勻后采用同樣的方法依次稀釋成濃度為10^-1、10^-2和10^-3的土壤溶液，備用。分別吸取100 pL各濃度的土壤溶液，置于改良的M1固體培養(yǎng)基（未添加人工海鹽）平板上，用無菌的涂布棒涂布均勻，每個濃度重復3次；然后將培養(yǎng)基平板放在28℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，根據(jù)菌落生長情況以及菌落特征挑選肉眼可辨別的放線菌，接種于M1培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。將純化后的放線菌菌株接種于M1培養(yǎng)基上，28℃恒溫暗培養(yǎng)3～7 d，觀察記錄菌落形態(tài)和顏色，合并相同的菌株并拍照。將純化后的菌株接種在2.5 mL凍存管里（含0.5 mL無菌的甘油和0.5 mL M1液體培養(yǎng)基），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3根際放線菌菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建將純化后的放線菌接種于ISP-2液體培養(yǎng)基中，28℃150 rpm的條件下震蕩培養(yǎng)1 d，吸取適量的放線菌菌絲，DNA提取方法按照Ezup柱式細菌基因DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取步驟進行；采用原核生物通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R （5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系為30μL：12μL ddH₂O，上下游引物各0.5μL，15μL2×Taq PCR MasterMix，2 pL模板DNA。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min，4℃保溫。所得序列均使用DNAMAN軟件進行互補拼接，通過在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST，將測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，使用MAFTT version 7進行序列處理后，采用鄰接法（Neighbor-joining），用MEGA 7.0.26軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，Bootstrap method中重復抽樣次數(shù)設置1000，模式為Maximum Composite Likelihood。將最終的鑒定結果和所得的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），并獲得其登錄號。

1.4根際放線菌次生代謝產(chǎn)物的制備

采用無菌打孔器從培養(yǎng)好的放線菌M1培養(yǎng)基平板上打取4塊菌餅，接種到裝有250 mL M1液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃150 rpm條件下培養(yǎng)14 d。發(fā)酵完成后采用4層紗布將菌絲殘渣和發(fā)酵液分開，然后往發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯，室溫下連續(xù)萃取3次，合并萃取液經(jīng)減壓濃縮后即得放線菌乙酸乙酯層次生代謝產(chǎn)物，4℃條件下保存，備用。

1.5根際放線菌次生代謝產(chǎn)物抗細菌活性的測定

供試細菌分別為木麻黃青枯病菌（Ralstoniasolanacearum，G^-）、大腸桿菌（Escherichia coll， G^-）、枯草芽孢桿菌（Baacillus subtilis，G+）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+）。采用TLC-MTT-生物自顯影法測定短枝木麻黃根際放線菌次生代謝產(chǎn)物對不同供試細菌的抑制活性。先將各根際放線菌次生代謝產(chǎn)物溶解，用直徑0.5 mm的毛細管在薄層層析板上點樣，點樣量為5μL。采用二氯甲烷：甲醇=20：1的展開系統(tǒng)進行薄層層析，在ZF-2型三用紫外儀下觀察化合物的薄層層析情況。薄層層析后在薄層板的一側點樣原點處點5μL 0.2mg·mL^-1硫酸鏈霉素作為陽性對照。向滅菌的LB半固體培養(yǎng)基（瓊脂質量濃度為5 g·L^-1）中加入一定量的供試細菌菌液（45 mL LB+5 mL菌液），調(diào)至約10⁸CFU·mL^-1。用移液槍將制備好的菌懸液均勻噴灑到層析后的薄層板上，待培養(yǎng)基冷卻后，將薄層板置于28℃下黑暗保濕培養(yǎng)，12 h后在薄層板上均勻噴灑噻唑藍（MTT），約10 min后觀察試驗結果。有抗菌活性成分處，供試細菌由于受到活性成分的抑制而出現(xiàn)白色抑菌斑；無抗菌活性成分處，供試細菌正常生長，與MTT反應顯藍色。根據(jù)抑菌斑直徑的大小和多少來初步評價活性化合物的抑菌活性和數(shù)量，通過抑菌斑的遷移率（Rf）來初步判斷樣品中抗菌化合物的極性。

1.6根際放線菌次生代謝產(chǎn)物高效液相色譜分析

為進一步闡明不同放線菌次生代謝產(chǎn)物的情況，采用高效液相色譜LC-16（島津儀器（蘇州）有限公司）對不同放線菌乙酸乙酯層提取物進行分析。分別稱取20 mg濃縮后的提取物，加入1 mL色譜甲醇，超聲溶解，再用0.22μm的有機濾膜過濾，配置成濃度為20 mg·mL^-1的溶液，備用。流動相為乙腈和水，流速為1mL.min^-1，WondaSilC₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，島津儀器（蘇州）有限公司），柱溫為40℃，進樣量為5μL。色譜分析條件為：0～2 min，10%的乙腈等度洗脫；1～30 min，乙腈濃度由10%線性遞增到100%；30～36 min，100%的乙腈等度洗脫；36～37 min，乙腈濃度由100%線性遞減到10%；37～45 min，使用10%的乙腈對色譜柱進行再平衡；采用SPD-M20A二極管陣列檢測器（島津儀器（蘇州）有限公司）進行全波長掃描檢測。

2結果與分析

2.1短枝木麻黃根際放線菌的分離和純化

通過菌落形態(tài)觀察，對從短枝木麻黃根際土壤中分離到的放線菌進行初步合并，最終從木麻黃根際土壤中共分離得到12株不同的放線菌，其菌落形態(tài)見圖1。從圖1中可看出：在相同的生長時間內(nèi)，大多數(shù)放線菌單菌落為白色、圓形，但菌落的大小有所差別，菌株Ceaf-6的單菌落最大，生長速度較快；菌株Ceaf-9、Ceaf-19和Ceaf-23的單菌落相對較小，且菌株Ceaf-23后期培養(yǎng)基顏色會變深。

2.2短枝木麻黃根際放線菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

基于短枝木麻黃根際放線菌16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）表明：菌株Ceaf-9、Ceaf-19、Ceaf-20、Ceaf-21、Ceaf-22和Ceaf-23與菌株S.luteogriseus聚在同一大支上，親緣關系較近，但自展值只有89，且遺傳距離也不相同，進一步通過序列比對發(fā)現(xiàn)并不是同一菌株，因此，以上菌株未鑒定到種。菌株Ceaf-15與S.hawaliensis（登錄號為M2389914.1）聚在同一支上，且自展值為98，最大相似度為99.65%，因此，菌株Ceaf-15最終鑒定為S.hawaiiensis（登錄號為MK764957）。按照同樣的分類依據(jù)，綜合菌落形態(tài)以及構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，短枝木麻黃根際放線菌的最終鑒定結果見表1。BLAST結果顯示：所有菌株與最大相似菌株的相似性均在97%以上。分離到的12株短枝木麻黃根際放線菌均為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）放線菌，說明鏈霉菌屬放線菌為短枝木麻黃根際土壤中的優(yōu)勢菌群。

2.3根際放線菌次生代謝產(chǎn)物的抗細菌活性

短枝木麻黃根際放線菌次生代謝產(chǎn)物對4種供試細菌的抑制活性見表2。4種供試細菌中，木麻黃青枯病菌和大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌為革蘭氏陽性菌。由表2可知：不同放線菌次生代謝產(chǎn)物對4種供試細菌的抑制活性差異較大，但對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑制活性未表現(xiàn)出明顯差異。菌株Ceaf-9和Ceaf-23提取物均未表現(xiàn)出任何抑菌活性，其他提取物均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，但對不同供試細菌的抑菌活性差異較大；菌株S.spinosus Ceaf-4提取物對木麻黃青枯病菌、大腸桿菌及溶血葡萄球菌的抑菌斑直徑均大于10 mm，表現(xiàn)出較強的抑菌活性；菌株S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌的抑菌斑直徑也大于10 mm，但菌株Ceaf-4抑菌斑的Rf值為0.30～0.57，而菌株Ceaf-12抑菌斑的Rf值為0.45～0.58，說明菌株Ceaf-4對青枯病菌的抑制活性更強；R_f越小，化合物的極性越大，多數(shù)放線菌抑菌斑的Rf值為0.30～0.50，說明具有活性的化合物多為極性中等偏大的化合物。綜上所述，菌株S.spinosusCeaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌表現(xiàn)出較強的抑制活性。

2.4根際放線菌次生代謝產(chǎn)物分析

12株短枝木麻黃根際放線菌乙酸乙酯層次生代謝產(chǎn)物的HPLC-UV色譜圖見圖3。從圖3可看出：12株放線菌均含有一定數(shù)量的次生代謝產(chǎn)物，但不同化合物的相對含量（峰高）差別較大?？辜毦钚越Y果（表2）表明，菌株S.spinosusCeaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌表現(xiàn)出較強的抑制活性，但圖3表明這2株放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有明顯的區(qū)別，S.spinosus Ceaf-4中的各個次生代謝產(chǎn)物相對含量差別不大，保留時間（R_t）集中在10～15 min，通過紫外吸收分析發(fā)現(xiàn)為結構類似的化合物；而S.chattanoogensis Ceaf-12在R_t=20 min左右有一個明顯的吸收峰，說明此化合物的含量較高。此外菌株Ceaf-1、Ceaf-6和Ceaf-20也含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，但抗菌活性一般。綜合考慮抗菌活性和次生代謝產(chǎn)物的情況，菌株S.spinosusCeaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12可作為候選菌株進一步分離其中的活性成分。

3討論

木麻黃是我國南方尤其是華南地區(qū)重要的經(jīng)濟林和生態(tài)林樹種，而青枯病作為木麻黃的“癌癥”，嚴重影響其種植和生長，影響我國的生態(tài)安全以及沿海防護林的建設。根際微生物作為植物的第二套基因組，在植物保護中起著重要作用。近年來，隨著生物信息學技術的不斷成熟，木麻黃根際微生物的研究也逐漸成為研究的熱點。木麻黃根際土壤中特征微生物的含量差異明顯，細菌分布量最大，其次是真菌和放線菌。隨著栽植代數(shù)的增加，細菌含量減少，而真菌含量增加。同時，木麻黃根系分泌物，酚酸對根際土壤微生物群落具有特異選擇性，引起根際微生物群落結構失衡，進而導致連栽障礙問題。本研究采用熱擊稀釋法從短枝木麻黃根際土壤中共分離出12株放線菌，均為鏈霉菌屬放線菌，說明鏈霉菌屬放線菌為短枝木麻黃根際土壤的優(yōu)勢菌株，這與Abhijit等的研究結果一致。根際微生物的組成受到植物種類、土壤類型、季節(jié)變化、環(huán)境條件和栽培管理制度等各種因素的影響。木麻黃作為我國華南和東南沿海地區(qū)重要的生態(tài)防護林和用材林樹種，其生長環(huán)境土壤貧瘠、含鹽量高、有機質含量少，且植被資源匱乏，物種單一，是造成放線菌種類相對單一的重要原因。此外，并不是所有根際放線菌都能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此，分離到的這12株放線菌只是短枝木麻黃根際放線菌的一部分。前期的研究表明，從海芒果（Cerbera manghas L.）、紅豆杉（Taxus wallichiana var.chinensis （Pilg.） Florin）等植物根際土壤中分離出的鏈霉菌屬放線菌比例均比較高。

目前，放線菌已廣泛應用于農(nóng)業(yè)、生物和醫(yī)藥等多個領域。放線菌是產(chǎn)生抗生素最多的一類生物群體，而鏈霉菌屬又是產(chǎn)生抗生素最多的一類放線菌。根際放線菌種類豐富，代謝途徑各異，可產(chǎn)生一系列的次生代謝產(chǎn)物從而抑制病原菌在植物根際的生長和繁殖。近年來，木麻黃青枯病的大面積發(fā)生嚴重影響我國沿海的生態(tài)安全，從木麻黃根際土壤中尋找新的活性菌株以及次生代謝產(chǎn)物，為病害的生物防治提供了一個新的思路。本研究的抗菌活性結果表明，菌株S.spinosus Ceaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌均表現(xiàn)出較好的抑制活性，其抑菌斑直徑均大于10mm。HPLC結果表明，菌株S.spinosus Ceaf-4的提取物中含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，菌株S.chattanoogensis Ceaf-12在R_t=20 min左右時存在一個紫外吸收較高的化合物，2株放線菌中的抗菌活性成分是否與這些化合物有關值得進一步研究。本研究只采用了M1培養(yǎng)基對不同放線菌進行發(fā)酵，在后續(xù)研究中可改變培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，有效激活沉默基因的表達，可誘發(fā)菌株產(chǎn)生新的活性化合物，同時利用LC-MS/MS構建不同菌株次生代謝產(chǎn)物的可視化分子網(wǎng)絡，快速探尋新型的化合物及其同系物。隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，高通量測序技術已廣泛應用于根際微生物的研究中，探究開發(fā)根部有益微生物為病蟲害的防治提供了廣闊的前景。在后續(xù)的研究中可結合高通量測序技術研究木麻黃根際放線菌的生物多樣性，同時嘗試采用不同的培養(yǎng)基，分離得到盡可能多的放線菌菌株，并比較不同培養(yǎng)基中放線菌的分布和生長情況。

4結論

通過對華南沿海短枝木麻黃根際土壤樣品中放線菌的分離培養(yǎng)，共分離得到12株不同的鏈霉菌屬放線菌，鏈霉菌屬放線菌為短枝木麻黃根際土壤中的優(yōu)勢放線菌。進一步對篩選出的菌株進行發(fā)酵及抗菌活性研究，篩選出一些抗菌活性較好的菌株，其中，菌株S.spinosus Ceaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌表現(xiàn)出較好的抑制活性。HPLC分析發(fā)現(xiàn)，菌株S.spinosus Ceaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12的次生代謝產(chǎn)物類型豐富，值得進一步對其化合物進行分離制備，可作為候選抗菌活性菌株進一步開發(fā)和利用。