無瓣海桑根響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

梁銳濤　韓維棟　楊少瑕等

關(guān)鍵詞：無瓣海桑；鹽脅迫；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)：S728.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）01-0068-11

土壤鹽漬化現(xiàn)象幾乎遍布所有的氣候區(qū)域以及地理環(huán)境，是影響農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)的主要問題。土壤鹽漬化使植物受到滲透脅迫、離子毒害、膜透性改變及生理代謝紊亂等危害，嚴(yán)重制約了植物的生長，是在植物生產(chǎn)與栽培上一個(gè)非常嚴(yán)峻的問題。因此，通過對(duì)植物抗鹽的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探析，挖掘耐鹽相關(guān)基因，并應(yīng)用于新種質(zhì)創(chuàng)制和新品種選育，對(duì)于緩解土壤鹽漬化問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

長期生長在濱海區(qū)域潮間帶的紅樹林，由于其特殊的、有別于陸地和淡水植物的生長環(huán)境，演化出了一套特殊的鹽逆境適應(yīng)機(jī)制。植物的耐鹽機(jī)制涉及滲透物質(zhì)積累、蛋白積累、抗氧化酶的誘導(dǎo)、植物激素的誘導(dǎo)和光合作用路徑的變化5個(gè)方面。對(duì)于紅樹植物，不同的紅樹物種具體的耐鹽機(jī)制有所不同。無瓣海桑（Sonneratia apetala Buch.-Ham.）是海桑科海桑屬紅樹喬木，具有生長快、耐淹浸、耐貧瘠、耐寒強(qiáng)等特點(diǎn)，是濱海灘涂的先鋒造林樹種，在維持海岸帶生態(tài)平衡方面起著重要作用。先前有關(guān)其耐鹽特性的研究主要集中在形態(tài)、生理生態(tài)層面，如廖巖等研究了不同鹽度處理3個(gè)月下無瓣海桑根、莖、葉中的蛋白質(zhì)、可溶性糖、丙二醛含量、抗氧化酶活性的變化情況，并探討了它們的相互關(guān)系，為耐鹽樹種的選育提供了參考。然而，目前鮮見關(guān)于無瓣海桑耐鹽分子機(jī)制方面的研究報(bào)道。

轉(zhuǎn)錄組測序是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的核心技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于新基因的挖掘等。目前，最新的測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了第三代。三代測序技術(shù)具有單分子、超長讀長、無需PCR擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，已在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等領(lǐng)域上得到了應(yīng)用。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)上，三代全長轉(zhuǎn)錄組測序（lso-Seq）的應(yīng)用，可彌補(bǔ)二代測序技術(shù)讀段較短、無法覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的缺點(diǎn)，從而做到從全長轉(zhuǎn)錄本水平上研究轉(zhuǎn)錄組。但三代測序技術(shù)存在堿基錯(cuò)誤率高、成本高等缺點(diǎn)，目前應(yīng)用并不廣泛。二代測序有通量高、成本低的特點(diǎn)，且發(fā)展至今已取得了較好的工作基礎(chǔ)，因此，二代和三代測序結(jié)合使用成為很多研究者的策略。如梅瑜等利用基于SMRT技術(shù)原理的PacBio平臺(tái)三代測序技術(shù)，對(duì)甘葛藤（Pueraria thomsoruu Benth）進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序及分析，從轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中鑒定了黃酮類生物合成基因、轉(zhuǎn)錄因子、R基因和SSR標(biāo)記，為甘葛藤的選育和利用提供了基礎(chǔ)。然而，對(duì)于紅樹植物，當(dāng)前研究僅限于對(duì)白骨壤（Avicennia marina （Forsk.） Vierh.）、秋茄（Kandeliacandel （Linn.） Druce／Kandelia obovata）、角果木（Ceriops tagal （perr.）C.B.Rob）、竹節(jié)樹（Carallia brachiate （Lour.） Merr.）和老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）等個(gè)別物種開展了轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)研究。特別是，至今對(duì)無瓣海桑僅開展了以三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集為基礎(chǔ)的鹽脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子挖掘工作。因此，本研究利用二代與三代結(jié)合的高通量測序技術(shù)，對(duì)鹽脅迫處理前后的無瓣海桑根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，從中鑒定并初步篩選出無瓣海桑根系響應(yīng)鹽脅迫的候選基因，可為深入研究無瓣海桑的耐鹽基因組學(xué)、分子生物學(xué)和進(jìn)一步揭示紅樹植物的耐鹽機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與處理

本實(shí)驗(yàn)原材料采自于廣東省湛江市特呈島紅樹林自然保護(hù)區(qū)（21°09′～21°10′N，110°25′～110°27′E）。2019年10月采集無瓣海桑的種子，播種于人工配制的營養(yǎng)土中。1a后，選取長勢一致的無瓣海桑幼苗，分別設(shè)置對(duì)照組（RCK）和處理組（RT）。處理組用500 mmol·L^-1的NaCl溶液每3d進(jìn)行1次鹽脅迫處理，對(duì)照組使用等量清水。對(duì)照組（RCK_a、RCK_b、RCK_c）和處理組（RT_a、RT_b、RT_c）均進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。10 d后分別取對(duì)照組和處理組根部組織液氮速凍，于-80℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1測序文庫構(gòu)建及測序 提取6個(gè)樣本的RNA，質(zhì)檢合格后構(gòu)建三代全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫和二代RNA-seq測序文庫，并進(jìn)行測序及分析。二代測序文庫構(gòu)建方法如下：（1）用mRNA富集法或rRNA去除法對(duì)total RNA進(jìn)行處理；（2）用打斷buffer把獲得的RNA片段化，隨機(jī)的N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA二鏈形成雙鏈DNA，再將其末端補(bǔ)平并5'端磷酸化；（3）連接一個(gè)3'端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭；（4）通過特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，將其熱變性成單鏈，再用一段橋式引物將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫；（5）利用BGISEQ-500平臺(tái)測序。

PacBio測序文庫構(gòu)建方法如下：取6個(gè)樣本的RNA，等量混合，使用SMARTerTM PCRcDNA Synthesis試劑盒將混合的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成第-鏈cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增合成第二鏈cDNA，然后對(duì)雙鏈DNA經(jīng)過2次PCR擴(kuò)增后的片段進(jìn)行損傷修復(fù)、末端修復(fù)，并連接SMRT適配體后構(gòu)建全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫，利用PacBio平臺(tái)進(jìn)行測序。

文庫構(gòu)建及測序工作由華大基因公司完成。

1.2.2測序數(shù)據(jù)組裝和基因定量 為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，需對(duì)測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、參考基因比對(duì)等前期處理。本研究使用華大自主研發(fā)的過濾軟件SOAPnuke對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行過濾，去除包含接頭污染、未知堿基N含量大于10%、低質(zhì)量的reads。使用Bowtie2將clean reads比對(duì)到三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫；利用RSEM計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平。樣本間的相關(guān)性分析通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient）進(jìn)行。

1.2.3差異基因的選擇與功能注釋分析 本研究基于負(fù)二項(xiàng)分布原理的Deseq2模型分析方法，對(duì)2組樣本進(jìn)行差異檢測分析，并以差異倍數(shù)值（fold change， FC）≥2或≤0.5， P-value<0.01，Q-value<0.05作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，并將該篩選得到的差異基因用于后續(xù)的GO和KEGG Pathway富集分析，前者通過agriGO網(wǎng)站（http：//systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）進(jìn)行，后者借助基因數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https：//www.kegg.jp/）完成。

2結(jié)果與分析

2.1測序質(zhì)量分析

通過SOAPnuke軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后，如表1所示，有效讀序百分率均在98%以上，Q20（堿基量≥20%）均大于96%且Q30（堿基量≥30%）均>91%，比對(duì)率均在87%以上。6個(gè)樣品轉(zhuǎn)錄本reads覆蓋度的峰值在90～100；空白對(duì)照RCK組和鹽處理RT組的三次生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)系數(shù)極高（>0.98，圖1）。以上數(shù)據(jù)均說明6個(gè)樣品的測序質(zhì)量較高，測序數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)的差異表達(dá)分析。

2.2樣本差異基因表達(dá)情況

無瓣海桑根系在500 mmol·L^-1的NaCl脅迫10 d后，共檢測到20 289個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生了改變（圖2）。2組樣本間共有14 401個(gè)基因差異表達(dá)，其中，7 153個(gè)差異基因上調(diào)表達(dá)，lOg2FC最大值為11.32（isoform_13 051）；7 248個(gè)差異基因下調(diào)表達(dá)，lOg2FC最低值為-12.69（isoform_11 580）。結(jié)果表明，下調(diào)表達(dá)的差異基因數(shù)量多于上調(diào)的數(shù)量。

2.3差異基因的GO分類和顯著性富集分析

將差異基因比對(duì)到Gene Ontology （GO）數(shù)據(jù)庫，共有11068個(gè)差異基因注釋到47條GO條目，注釋率為76.9%，涉及3大主要功能分類：生物過程、細(xì)胞組分和分子功能，占比分別為25.02%，43.76%，31.21%，由此可知，大多數(shù)差異基因的功能與細(xì)胞組分具有較大的相關(guān)性。根據(jù)GO功能注釋分類結(jié)果（圖3），這些差異基因在參與生物過程中，主要集中在細(xì)胞過程和代謝過程；在細(xì)胞組分中，主要集中在細(xì)胞、膜、膜部分；在分子功能中，主要集中在連接、催化活性。表明在高鹽脅迫下，上述的亞類中涉及到的基因可能在無瓣海桑根系中響應(yīng)強(qiáng)烈。

2.4差異基因的KEGG富集分析

在KEGG分析結(jié)果中，共有6189個(gè)差異基因富集到134條通路，以Q-value<0.05作為顯著富集標(biāo)準(zhǔn)，共有14條顯著富集的通路（圖4），其中，富集差異基因數(shù)量最多的是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075），涉及512個(gè)基因，最顯著富集的植物一病原體相互作用（ko04626）涉及367個(gè)基因。富集分析結(jié)果表明，無瓣海桑根系基因主要通過14條顯著通路參與鹽脅迫的響應(yīng)，并且其中涉及的基因可能對(duì)無瓣海桑根系耐鹽性的調(diào)控發(fā)揮作用，關(guān)注這些顯著通路，有助于對(duì)無瓣海桑根系耐鹽候選基因的篩選。

2.5響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)基因功能分析

通過進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋分析，本研究共篩選出89個(gè)無瓣海桑根系抗鹽候選功能基因，涉及12條KEGG通路（表2，圖5）。

2.5.1抗氧化基因的差異表達(dá) 正常情況下，植物體內(nèi)存在著活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，但外界的不良環(huán)境會(huì)打破這個(gè)平衡，導(dǎo)致ROS的積累，產(chǎn)生毒害。植物體內(nèi)存在2種ROS清除機(jī)制——酶促清除和非酶促清除，前者主要涉及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，后者主要涉及抗壞血酸、類黃酮物質(zhì)等。本研究發(fā)現(xiàn)6類共24個(gè)活性氧清除基因（圖6），其中，上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量最多的是過氧化物酶基因，總數(shù)為7，表達(dá)量差異變化最大的為銅鋅家族超氧化物歧化酶基因，差異倍數(shù)達(dá)到6.46。這些上調(diào)表達(dá)的基因有利于無瓣海桑在鹽脅迫前期，合成多種抗氧化酶類物質(zhì)，提高體內(nèi)抗氧化和ROS清除的能力，增強(qiáng)耐受性。

2.5.2滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)基因的差異表達(dá) 植物在對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)過程中，細(xì)胞會(huì)積累一定量的可溶性有機(jī)物質(zhì)，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與滲透調(diào)節(jié)，以適應(yīng)外界的低水勢。在本研究中，發(fā)現(xiàn)10種共22個(gè)編碼生成有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的基因（圖6），涉及水蘇糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖、脯氨酸、甜菜堿、熱激蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在這些基因中，部分基因存在上調(diào)表達(dá)，表明在鹽脅迫下，無瓣海?？赏ㄟ^合成一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以調(diào)節(jié)鹽漬環(huán)境下植物細(xì)胞內(nèi)的滲透勢。

2.5.3植物激素基因的差異表達(dá) 植物體內(nèi)的多種激素在其生長發(fā)育、代謝等生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)7種共19個(gè)涉及2種植物激素（IAA與ABA）的基因（圖6），其中，IAA途徑相關(guān)的有生長素應(yīng)答因子（auxin response factor，ARF）、生長素應(yīng)答GH3家族基因（auxin responsive GH3 gene family， GH3）、SAUR家族蛋白（SAUR family protein，SAUR）和生長素響應(yīng)蛋白（auxin-responsive protein IAA，IAA）共11個(gè)基因；涉及ABA途徑的有脫落酸應(yīng)答元件結(jié)合因子（ABA responsive element bindingfactor，ABF）、脫落酸受體PYR/PYL家族（abscisic acid receptor PYR/PYL family，PYL）和蛋白磷酸酶2C（protein phosphatase 2C，PP2C）共8個(gè)基因。IAA相關(guān)基因除GH3基因均上調(diào)表達(dá)外，其他同時(shí)存在上下調(diào)表達(dá)，而ABA相關(guān)基因大部分下調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果表明，植物激素能夠在無瓣海桑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，不同激素共同調(diào)控鹽脅迫響應(yīng)過程。

2.5.4植物蛋白激酶基因的差異表達(dá) 蛋白激酶可調(diào)控植物的生長，在逆境中起到調(diào)控感受脅迫信號(hào)、啟動(dòng)各種非生物逆境響應(yīng)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)6種共10個(gè)蛋白激酶相關(guān)基因（圖6），其中，2種促分裂原活化蛋白激酶基因（mitogen-activated protein kinases，MAPK）MPK4、MPK6和2種絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶基因PBS1、CTR1均上調(diào)表達(dá)，1種促分裂原活化蛋白激酶基因（mitogen activated protein kinase，MEKK）MEKK1和1種鈣依賴性蛋白激酶基因（calcium-dependent protein kinase， CDPK）中均有2個(gè)上調(diào)表達(dá)，1個(gè)下調(diào)表達(dá)?？梢娺@些蛋白激酶在無瓣海桑根系響應(yīng)高鹽脅迫時(shí)，發(fā)揮著尤為重要的調(diào)控作用。

2.6響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子是一類功能蛋白質(zhì)，具有調(diào)控基因表達(dá)的作用。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子通過與相應(yīng)的順式作用元件相互作用，調(diào)控并減輕逆境脅迫帶來的傷害，以適應(yīng)各種逆境。本研究發(fā)現(xiàn)8種共14個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（圖6），涉及5個(gè)家族，分別為WRKY家族、MYB家族、GRAS家族、bHLH家族和EREBP家族，其中，WRKY家族發(fā)現(xiàn)的成員數(shù)量最多，暗示W(wǎng)RKY家族在無瓣海桑響應(yīng)鹽脅迫中起著重要的調(diào)控作用。

3討論

植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程，從微觀上的基因響應(yīng)到宏觀上生理的變化，經(jīng)歷了一系列的信號(hào)傳遞與調(diào)節(jié)過程，最終適應(yīng)鹽逆境。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)植物鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究分析，能夠快速準(zhǔn)確地初步篩選出其中的耐鹽相關(guān)基因，為進(jìn)一步利用分子生物學(xué)手段深入探究其耐鹽機(jī)制奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。然而，對(duì)于紅樹植物，當(dāng)前研究對(duì)無瓣海桑僅限于利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)開展了鹽脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的挖掘，而對(duì)轉(zhuǎn)錄因子以外的其他可能參與調(diào)控鹽逆境適應(yīng)過程的基因并未關(guān)注。本研究聯(lián)合二代和三代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，獲得了無瓣海桑對(duì)照組及500mmol·L^-1鹽脅迫處理10d后的根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最終篩選出89個(gè)無瓣海桑根抗鹽候選基因，其中一些基因?qū)}脅迫的響應(yīng)起著十分重要的作用。

在植物的ROS酶促清除機(jī)制中，SOD、過氧化物酶（POD）、CAT是常見的酶。研究表明，NaCl脅迫后耐鹽性強(qiáng)的A34株系葡萄根系中的SOD、CAT、POD活性表現(xiàn)出快速升高并在較高水平后小幅度降低的趨勢，這有利于維持活性氧代謝的平衡，緩解細(xì)胞膜脂過氧化。魯琳等通過高通量測序技術(shù)對(duì)鹽脅迫下花煙草（Nicotiana alata Link et Otto）的活性氧清除基因進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)編碼SOD、POD、CAT的基因均發(fā)生了顯著的上調(diào)表達(dá)，同時(shí)存在下調(diào)表達(dá)的基因。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，在SOD中，SOD1 2個(gè)上調(diào)，1個(gè)下調(diào)，SOD2 1個(gè)上調(diào)表達(dá)；CAT5個(gè)基因全部上調(diào)表達(dá)；在POD中，存在較多下調(diào)表達(dá)的基因。上述結(jié)果推測可能是由于植物體內(nèi)的抗氧化機(jī)制存在著正負(fù)2種調(diào)控方式，且不同抗氧化酶在不同植物中的調(diào)控方式可能有所不同；對(duì)于無瓣海桑來說，CAT可能是以正向調(diào)控為主導(dǎo)，而POD可能主要是以負(fù)向調(diào)控為主。

在逆境下，植物可通過調(diào)節(jié)海藻糖的含量，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，提高在逆境中的生存能力。李輝等克隆了海藻糖合成關(guān)鍵酶基因海藻糖-β-磷酸磷酸酶基因（trehalose-β-phosphate phosphatase，TPP），并研究其在非生物脅迫下的作用，結(jié)果表明該基因表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明，高鹽脅迫主要促進(jìn)了龍須菜（Asparagus schoberioides Kunth）海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶1基因（trehalose 6-phosphatesynthase/phosphatase 1，TPS1）、海藻糖-6-磷酸合成酶，磷酸酶2基因（trehalose 6-phosphatesynthase/phosphatase 2，TPS2）和海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶4基因（trehalose 6-phosphatesynthase/phosphatase 4，TPS4）的表達(dá)，而滲透脅迫抑制了TPS1、TPS2和海藻糖-6-磷酸合成酶，磷酸酶3基因（trehalose 6-phosphate synthase/phosphatase 3，TPS3）的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)2種共7個(gè)合成海藻糖的關(guān)鍵基因：海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因（otsB）和海藻糖-6-磷酸合成酶基因（TPS）。在這些基因中，3個(gè)表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)，可能是由于鹽脅迫產(chǎn)生的滲透脅迫抑制了這些基因的表達(dá)。

脯氨酸是植物中常見的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而脯氨酸的積累是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的普遍反應(yīng)。在大多數(shù)植物物種中，δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）催化谷氨酸生物合成脯氨酸的第一步。在Funck等的研究中，發(fā)現(xiàn)在擬南芥（Arabidopsis tha/iana （L.） Heynh）NaCl處理的p5cs2突變體中，幾乎沒有Na+的積累，植株既沒有褪綠，也沒有光合作用減弱，可見P5CS2介導(dǎo)的脯氨酸合成在調(diào)節(jié)葉片Na+積累和抗鹽脅迫方面具有重要調(diào)控功能。本研究中發(fā)現(xiàn)2個(gè)P5CS基因，1個(gè)上調(diào)，1個(gè)下調(diào)，表明P5CS基因在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮了作用。

脫落酸在鹽、干旱、低溫等非生物脅迫下會(huì)在植物體內(nèi)被誘導(dǎo)產(chǎn)生，同時(shí)啟動(dòng)相關(guān)的信號(hào)途徑，以響應(yīng)非生物脅迫。ABA信號(hào)途徑由ABA受體、PP2C、SnRK2和ABF轉(zhuǎn)錄因子四部分組成。研究表明，鹽處理抑制了擬南芥中PP2C31基因的表達(dá)，且在不同時(shí)期鹽處理下PP2C31基因出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)表達(dá)，說明PP2C31蛋白在擬南芥響應(yīng)鹽脅迫中起負(fù)調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)PP2C基因均下調(diào)表達(dá)，推測PP2C蛋白負(fù)調(diào)控?zé)o瓣海桑的鹽脅迫響應(yīng)。

絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK）途徑在鹽、高溫、病原菌等逆境的應(yīng)答中起著重要作用，它通過MAPKKK→MAPKK→MAPK逐級(jí)傳遞放大脅迫信號(hào)，由下游的MAPK激活調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，引起植物對(duì)逆境的應(yīng)答。在野生大麥（Hordeum spontaneumL.）中，MEKK1-MKK2-MPK4/6聯(lián)級(jí)系統(tǒng)參與了鹽脅迫的響應(yīng)。擬南芥的MAPK聯(lián)級(jí)中多個(gè)MAPK基因在多種非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。汪芳珍等通過對(duì)沙芥根進(jìn)行6h50 mmol·L^-1的鹽處理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，共有11個(gè)MAPK/MAPKK/MAPKKK蛋白激酶基因的表達(dá)顯著上調(diào)。本研究中發(fā)現(xiàn)MEKK1、MPK4、MPK6基因大都上調(diào)表達(dá)，推測這些基因在無瓣海桑的MAPK聯(lián)級(jí)途徑響應(yīng)鹽脅迫中起著重要的作用，但無瓣海桑具體響應(yīng)鹽脅迫的MAPK聯(lián)級(jí)系統(tǒng)中的基因及機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

植物體轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫調(diào)控下游機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。參與植物鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族有WRKY、MYB、bHLH、NAC等。在鹽脅迫的響應(yīng)中，WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子存在著正負(fù)2種調(diào)控機(jī)制。在擬南芥中，RtWRKY23可提高自身過氧化物酶水平，以增強(qiáng)鹽脅迫耐受性。轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)的CaWRKY27抑制了抗氧化酶合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，在響應(yīng)鹽脅迫中起負(fù)調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)WRKY22、WRK Y25均呈上調(diào)表達(dá)，說明這些轉(zhuǎn)錄因子可能正向調(diào)控?zé)o瓣海桑的耐鹽性。此外，WRKY2、WRKY33呈現(xiàn)上下調(diào)表達(dá)，這表明了WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子參與無瓣海桑耐鹽機(jī)制方式的復(fù)雜性。

4結(jié)論

本研究通過二代RNA-seq和三代全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的聯(lián)合使用對(duì)無瓣海桑響應(yīng)鹽逆境的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了解析，獲得了鹽逆境下無瓣海桑根系的差異表達(dá)基因及功能注釋信息，并鑒定出一批與活性氧清除、滲透調(diào)節(jié)、植物激素、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)的潛在耐鹽候選基因，研究結(jié)果對(duì)揭示紅樹植物的抗鹽機(jī)制、耐鹽型紅樹新型品種選育及沿海生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。