非編碼RNA對肝細胞癌腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的作用

楊超然 李思柔 劉源 侯志遠 王元 楊季紅

摘要：肝細胞癌（HCC）是一種常見的肝臟惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、進展快、預(yù)后差等特點。近年來發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA（ncRNA）在腫瘤微環(huán)境（TME）中參與腫瘤免疫的調(diào)節(jié)，進而影響HCC的生物學(xué)行為。本文簡述了ncRNA對TME中免疫細胞的調(diào)控作用，并介紹了ncRNA在HCC診斷和治療中的潛在價值，以期為HCC提供潛在的診斷和治療策略。

關(guān)鍵詞：癌， 肝細胞；? RNA；? 腫瘤微環(huán)境；? 免疫，? 細胞

基金項目：河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目（361007）

Role of non-coding RNA on immune cells in tumor microenvironment of hepatocellular carcinoma

YANG Chaoran， LI Sirou， LIU Yuan， HOU Zhiyuan， WANG Yuan， YANG Jihong. （Department of Hepatobiliary Surgery， Affiliated Hospital of Hebei University， Baoding， Hebei 071000， China）

Corresponding author：

YANG Jihong， doctoryangjh@sina.com （ORCID：0000-0001-8844-8640）

Abstract：

Hepatocellular carcinoma （HCC） is a common malignant tumor of the liver characterized by a high incidence rate， rapid progression， and poor prognosis. In recent years， it has been found that non-coding RNA （ncRNA） participates in the regulation of tumor immunity in tumor microenvironment （TME） and in turn affects the biological behavior of HCC. This article briefly describes the regulatory effect of ncRNA on immune cells in TME and introduces the potential value of ncRNA in the diagnosis and treatment of HCC， in order to provide potential diagnostic and treatment strategies for HCC.

Key words：

Carcinoma， Hepatocellular;?? RNA;? Tumor Microenvironment； Immunity， Cellular

Research funding：Hebei Provincial Government Funded Clinical Medicine Talent Training Program （361007）

肝細胞癌（HCC）是全球范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，約占原發(fā)性肝癌的90%［1］，起病隱匿，早期缺乏典型的臨床癥狀和診斷指標(biāo)。外科手術(shù)仍是目前治療HCC的最佳選擇。對于無法行手術(shù)治療的患者，輔助性化療、放療及靶向免疫治療可以延長患者的生存期，但HCC患者預(yù)后以及5年生存率仍然不樂觀［2］。因此，闡明HCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制，對于延長患者生存期至關(guān)重要。目前，非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）序列已經(jīng)被證明參與各種細胞信號傳遞以及腫瘤免疫的過程。因此，本文總結(jié)了ncRNA對HCC腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的調(diào)控作用，以期從ncRNA調(diào)控免疫細胞的角度為HCC早期診斷和治療提供新的思路。

1 ncRNA簡介

ncRNA是細胞中不具有翻譯蛋白質(zhì)功能的獨特轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，根據(jù)核苷酸序列長短分為微小RNA、長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）［3］。過去幾十年里，ncRNA被認(rèn)為是一種“垃圾”轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，沒有特定的生物學(xué)功能。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)ncRNA不僅參與各種細胞之間信號的傳遞，并且參與腫瘤免疫和抗腫瘤免疫反應(yīng)，進而調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展［4］。例如，ncRNA通過調(diào)節(jié)免疫細胞活化，增殖和細胞因子分泌，從而影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸［5］；又如，lncRNA HOMER3-AS1可以增加集落刺激因子-1（CSF-1）的表達和分泌，阻斷CSF-1可以逆轉(zhuǎn)HOMER3-AS1誘導(dǎo)巨噬細胞募集和M2極化［6］。因此HOMER3/Wnt/β-連環(huán)蛋白軸和CSF-1的激活，可以調(diào)控腫瘤細胞和巨噬細胞的行為，從而來驅(qū)動HCC進展。

2 ncRNA在HCC腫瘤微環(huán)境中參與免疫調(diào)控

腫瘤微環(huán)境是一個包含多種細胞和非細胞成分的微型動態(tài)生態(tài)系統(tǒng)，腫瘤的一般生物學(xué)特征均受腫瘤微環(huán)境影響［7］。隨著ncRNA對各種癌癥調(diào)控機制的深入研究，許多證據(jù)［8-9］表明，腫瘤微環(huán)境中ncRNA不僅調(diào)控免疫細胞的分化、增殖和凋亡過程，而且可以通過免疫調(diào)控影響腫瘤細胞的增殖和侵襲。例如，miRNA在腫瘤微環(huán)境中可以促進基質(zhì)和免疫細胞的募集區(qū)影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［10］。miRNA在細胞間通訊中的活性作為肝臟疾病中的關(guān)鍵點，幾乎參與了全部病理和生理過程。并且，大部分lncRNA和circRNA通過與之相應(yīng)的miRNA海綿在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮調(diào)控作用?？偨Y(jié)了多種表達異常的ncRNA對免疫細胞的調(diào)控和功能詳見表1。

2.1 miRNA對免疫細胞的調(diào)控作用

2.1.1 miRNA調(diào)節(jié)T淋巴細胞參與腫瘤免疫 T淋巴細胞是針對各種病原體以及癌細胞免疫反應(yīng)的核心，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，miRNA已被證明參與T淋巴細胞的活化過程［11］。其中，CD8+T淋巴細胞可通過分泌TNFα、IFNγ等導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡；CD4+T淋巴細胞可釋放IL-2等多種細胞因子致使效應(yīng)細胞殺傷能力增強。Lin等［12］報道，miR-570在HCC細胞（Bel-7404、Huh-7和HepG2細胞）中表達降低。相比對照組，注射miR-570模擬物的裸鼠外周血和腫瘤組織中CD8+T淋巴細胞、IFNγ的比率明顯升高，并且腫瘤生長速度減慢、腫瘤質(zhì)量及體積減小。表明miR-570可能通過調(diào)控CD8+T淋巴細胞的增殖和相關(guān)細胞因子的釋放，從而抑制腫瘤的增殖和發(fā)展。此外，研究［13］發(fā)現(xiàn)，miR-26b-5在HCC中表達低于對照組，與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。miR-26b-5p有助于CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞中TNFα、IFNγ、IL-6和IL-2的分泌。并作用于HCC中PIM-2來增強T淋巴細胞的免疫反應(yīng)，從而使HCC的免疫系統(tǒng)重新激活來增強腫瘤免疫應(yīng)答。還有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（Treg）通常在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮免疫抑制和耐受作用，常被腫瘤細胞拉攏以逃避免疫監(jiān)視。Li等［14］報道，miR-23a在HBV相關(guān)HCC中表達降低，與C-C趨化因子配體（CCL）22的表達呈負(fù)相關(guān)。CCL22的作用是通過p65/miR-23a軸促進Treg募集。miR-23a直接靶向作用于CCL22 3′非翻譯區(qū)（3′UTR），致使CCL22功能喪失，從而減弱Treg募集。同時，p65抑制劑通過與miR-23a啟動子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子作用，致使CCL22表達和Treg的體外募集減少。因此，miR-23a抑制劑可以使CCL22上調(diào)，促進異種移植腫瘤生長，而p65抑制劑發(fā)揮的作用與miR-23a相反。由此可見，通過p65/miR-23a/CCL22軸調(diào)控Treg募集可以影響腫瘤免疫逃逸能力，從而改變腫瘤的進展。

2.1.2 miRNA誘導(dǎo)巨噬細胞極化參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移 巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中起突出作用的重要免疫細胞，在腫瘤微環(huán)境中各種因素的刺激下極化為各種表型（主要是M1巨噬細胞發(fā)揮免疫活性和M2巨噬細胞促進免疫逃逸），從而影響腫瘤的生物學(xué)行為［15］。Liu等［16］發(fā)現(xiàn)，AKT/Ras通過誘導(dǎo)Kupffer細胞的M2極化和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的消耗，促進肝癌細胞的增殖。同時，miR-206通過靶向Kruppel樣因子4（KLF4），使M1標(biāo)志物（CCL2）增多，從而促進巨噬細胞M1極化。其中，miR-206誘導(dǎo)巨噬細胞M1極化和招募CTL的能力受KLF4/CCL2/CCR2軸的影響。由此可見，Kupffer細胞的M2極化是AKT / Ras模型小鼠HCC發(fā)展的重要因素。miR-206通過誘導(dǎo)Kupffer細胞的M1極化，促進CD8+ T淋巴細胞的募集，進而抑制HCC的進展。此外，巨噬細胞的浸潤與腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ke等［17］研究發(fā)現(xiàn)，miR-148b在HCC中表達降低，并且與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良之間存在正相關(guān)。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，miR-148b缺乏會導(dǎo)致由miR-148b-CSF1信號通路誘導(dǎo)的巨噬細胞浸潤增加，進而促進肝癌細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，其中CSF-1受miR-148b的調(diào)控。

2.1.3 miRNA調(diào)節(jié)自然殺傷細胞（NK細胞）毒性參與抗腫瘤免疫反應(yīng) NK細胞對HCC細胞的毒性受損，可能是抗腫瘤免疫反應(yīng)失敗的重要原因［18］。一直以來，miRNA被認(rèn)為是NK細胞發(fā)育和功能的重要調(diào)節(jié)因子，NK細胞激活后釋放NK細胞毒性因子等產(chǎn)生類似CTL的作用，從而殺傷腫瘤細胞［19］。一項研究［20］發(fā)現(xiàn)，HCC患者的NK細胞中miR-506表達下調(diào)，STAT3 mRNA表達上調(diào)，與對照組相比，NK細胞作用于SMMC7721或HepG2細胞的細胞毒性顯著降低。研究證明，NK細胞毒性與miR-506表達呈正相關(guān)，與STAT3 mRNA表達呈負(fù)相關(guān)。miR-506與STAT3的3′UTR靶向結(jié)合，抑制STAT3 mRNA的表達進而增強NK細胞對HCC細胞的毒性作用，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤細胞的增殖。相反，過表達STAT3可以逆轉(zhuǎn)該毒性作用。由此可見，miRNA可以靶向相應(yīng)mRNA進而調(diào)節(jié)NK細胞，使機體抗腫瘤免疫反應(yīng)增強，進一步抑制腫瘤細胞的增殖。另外一項研究［21］中發(fā)現(xiàn)，miR-561-5p在轉(zhuǎn)移性HCC患者的組織和高轉(zhuǎn)移潛力的肝癌細胞系中表達極高，并可以促進腫瘤生長和HCC肺轉(zhuǎn)移。趨化因子CX3CL1（CX3C趨化因子配體1）作為miR-561-5p潛在靶標(biāo)，可以激活NK細胞不同亞群，增強抗腫瘤反應(yīng)，從而抑制腫瘤的進展。因此，miR-561-5p通過CX3CL1/NK細胞軸調(diào)控NK細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，可以進一步影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

2.2 lncRNA對免疫細胞的調(diào)控作用

2.2.1 lncRNA調(diào)節(jié)T淋巴細胞功能參與腫瘤免疫免疫逃逸一直以來都是治療癌癥的絆腳石，據(jù)研究［22］表明，lncRNA通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中CD4+T、CD8+T淋巴細胞影響腫瘤進展以及腫瘤免疫。例如，lncRNA FENDRR在HCC組織和細胞中顯著低于正常肝組織和肝細胞，沉默lncRNA FENDRR后，HCC細胞出現(xiàn)增殖能力增強和凋亡速率降低，但細胞中TGFβ、IL-10、VEGF、IFNγ和IL-4的表達顯著增加，而lncRNA FENDRR過表達出現(xiàn)了相反的趨勢。證明lncRNA FENDRR具有抑制免疫相關(guān)因子增殖和分泌的能力，同時也抑制HCC細胞增殖能力，促進HCC細胞凋亡［23］。進一步研究［24］發(fā)現(xiàn)，lncRNA FENDRR高表達可以抑制Treg的免疫抑制能力，從而抑制Treg介導(dǎo)的HCC免疫逃逸。此外，lncRNA NEAT1在HCC患者外周血單核細胞中表達增高，但其下調(diào)后可以抑制CD8+T淋巴細胞凋亡，并通過miR-155/Tim-3途徑增強HCC細胞溶解活性。故此可見，lncRNA NEAT1沉默后通過調(diào)節(jié)miR-155/Tim-3途徑可以降低CD8+T淋巴細胞凋亡率，增強腫瘤免疫，從而增強HCC細胞溶解活性，改善免疫治療的結(jié)果。此外，Wang等［25］發(fā)現(xiàn)lncNNT-AS1在HCC組織中表達明顯增加，免疫組化檢測后表明lncNNT-AS1高表達與CD4+T淋巴細胞浸潤減少相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)lncNNT-AS1過表達通過激活TGFβ信號傳導(dǎo)機制，進而損害腫瘤CD4+T淋巴細胞浸潤來影響HCC的腫瘤免疫。

2.2.2 lncRNA誘導(dǎo)巨噬細胞極化參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移 腫瘤相關(guān)的巨噬細胞一直被認(rèn)為與HCC患者的生存率相關(guān)［26］，M1型極化巨噬細胞對于腫瘤活性具有滅殺作用，相反，M2型極化巨噬細胞對于HCC細胞增殖、遷移等方面具有促進作用［27］。多種lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)。例如，lncRNAMa301不僅與肝癌患者總體生存期密切相關(guān)，而且在M1型巨噬細胞中過表達。lncRNAMa301與caprin-1相互作用，通過Akt/erk-1途徑可以抑制肝癌細胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［28］。又如，lncRNA00662在HCC中高表達，可以通過自分泌方式激活HCC細胞中的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，影響HCC患者腫瘤的大小、侵襲和生存率；也可以通過旁分泌方式激活巨噬細胞中的Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)，促進M2巨噬細胞極化，使HCC患者腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移能力增強［29］。上述研究表明lncRNA可以通過分子途徑或信號傳導(dǎo)的改變，調(diào)控腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞極化，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。此外，巨噬細胞具有高水平的可塑性，可以在M1和M2兩種極化表型之間動態(tài)轉(zhuǎn)換。Ye等［30］利用脂多糖和IL-4分別誘導(dǎo)出RAW264.7巨噬細胞M1型和M2型進行研究，發(fā)現(xiàn)lncRNA cox-2在M1型巨噬細胞表達高于非極化巨噬細胞和M2型巨噬細胞。干擾lncRNA cox-2后，M1巨噬細胞抑制HCC細胞增殖、侵襲、遷移和促進細胞凋亡的能力明顯下降，M2巨噬細胞促進HCC細胞增殖和抑制細胞凋亡的能力明顯增強。這表明，lncRNA cox-2通過增強M1型巨噬細胞或抑制M2型巨噬細胞的極化調(diào)控腫瘤免疫逃逸，進而影響HCC細胞的增殖和腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

2.2.3 lncRNA調(diào)節(jié)NK細胞毒性參與抗腫瘤免疫反應(yīng) NK細胞具有消除病毒感染或殺傷細胞的能力，在先天性抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［31］。與miRNA相似，lncRNA通過參與NK細胞毒性作用的調(diào)控，影響抗腫瘤免疫反應(yīng)，進而影響腫瘤的生物學(xué)行為。例如，LINC00638/miR-4732-3p/ULBP1軸調(diào)控NK細胞的功能和浸潤［32］，MMP9與NK細胞的休眠和活化密切相關(guān)［33］。此外，F(xiàn)ang等［34］發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5在HCC患者NK細胞中的表達較對照組降低，反而miR-544表達增高?；罨疦K細胞中敲除lncRNA GAS5后，RUNX3、INFγ分泌和NK細胞毒性明顯降低，并且HepG2細胞凋亡速率降低。而lncRNA GAS5過表達后，情況則相反。繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，miR-544模擬物可以降低lncRNA GAS5過表達后產(chǎn)生的NK細胞對HCC細胞的殺傷作用，減弱抗腫瘤免疫反應(yīng)。由此可見，lncRNA GAS5高表達可以通過miR-544/RUNX3增強 NK細胞毒性作用以及腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)，進而抑制腫瘤的增長。

2.3 circRNA對免疫細胞的調(diào)控作用 免疫細胞是腫瘤微環(huán)境中最豐富的細胞成分，其與腫瘤細胞以及各種釋放因子之間能量的相互作用是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵［35］。最近，多種cricRNA被確定與免疫細胞相互作用，從而影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。例如，circRNA hsa_circ_0110102在HCC組織中高表達，

circ_0110102靶向作用于miR-580-5p可以降低HCC細胞中過氧化物酶體增殖物活化受體α（PPARα）的表達，從而抑制CCL2分泌到腫瘤微環(huán)境中，而CCL2可以激活巨噬細胞環(huán)加氧酶-2/前列腺素E2途徑增加其促炎細胞因子的釋放［36］。可見hsa_circ_0110102作為miR-580-5p的海綿可以抑制巨噬細胞活化和肝癌細胞的增殖，遷移和侵襲能力。還有研究［37］發(fā)現(xiàn)，circUHRF1在人HCC組織中表達增高，circUHRF1可以靶向miR-449c-5p來調(diào)控TIM-3，而TIM-3增高與NK細胞比例降低和NK細胞腫瘤浸潤減少密切相關(guān)。因此，circUHRF1可以調(diào)控TIM-3誘導(dǎo)NK細胞功能障礙來促進免疫抑制，使腫瘤細胞的增殖能力增強。由此可見，利用circRNA可以充當(dāng)miRNA的海綿參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)，進而調(diào)控腫瘤細胞的增殖和浸潤。此外，Wang等［38］研究發(fā)現(xiàn)，cricRNA Hsa_circ_0074854在HCC組織和細胞中高表達，敲除cricRNA Hsa_circ_0074854不僅可以抑制HCC生長，而且可以抑制巨噬細胞M2極化，從而損害HCC細胞的遷移和侵襲。

3 ncRNA在HCC中診斷和治療的潛在價值

HCC是一種惡性程度高、進展迅速、預(yù)后較差的腫瘤。因此，尋找早期有效的非侵入性診斷方法對于HCC的治療和預(yù)后尤為重要。最近研究［39-42］發(fā)現(xiàn)，從癌細胞和組織釋放的外泌體ncRNA幾乎參加了HCC發(fā)展的所有階段，并且在體液中表達失調(diào)，是非侵入性診斷生物標(biāo)志物的潛在候選者。例如，Sun等［43］研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p在HCV相關(guān)HCC患者早期血清中高表達，經(jīng)手術(shù)治療后表達明顯下降。相反的是，miR-23b-3p在HCC早期患者血清中表達下降，經(jīng)手術(shù)治療后表達卻顯著升高。通過進一步比較，發(fā)現(xiàn)血清中miR-331-3p和miR-23b-3p表現(xiàn)出來敏感性和特異性均優(yōu)于AFP。由此可見，血液中外泌體miRNA作為HCC早期診斷標(biāo)志物比經(jīng)典血清標(biāo)志物AFP更具有優(yōu)勢。

此外，ncRNA被證明有希望成為HCC的有效治療靶點。例如，miR-1258過表達可以與Smad2和Smad3直接結(jié)合，從而減弱TGFβ/Smad信號傳導(dǎo)，抑制HCC細胞在體內(nèi)外的遷移和侵襲［44］。lncRNA LINC01278作為miR-1258的負(fù)調(diào)節(jié)因子，LINC01278介導(dǎo)的HCC轉(zhuǎn)移依賴于miR-1258的表達，miR-1258下調(diào)增強 LINC01278 的表達。并發(fā)現(xiàn)TCF-4是lncRNA LINC01278啟動子的結(jié)合位點。lncRNA LINC01278低表達可減少由β-catenin和TGF-β1誘導(dǎo)的HCC細胞的遷移和侵襲。由此可見，通過β-catenin/TCF-4-LINC01278-miR-1258-Smad2/3軸調(diào)控HCC進展和轉(zhuǎn)移，為LINC01278成為HCC潛在治療靶點提供有力支持。

4 小結(jié)與展望

由上述可見，腫瘤微環(huán)境中ncRNA通過信號通路或分子傳導(dǎo)機制調(diào)控免疫細胞生理功能，參與腫瘤免疫以及抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而改變腫瘤進程。因此，對于這些ncRNA的深入研究，可以為HCC早期診斷以及治療提供新的思路。ncRNA在體液和組織外泌體中的表達失調(diào)，也讓其成為非侵入性診斷生物標(biāo)志物的可能。目前，盡管針對微環(huán)境中ncRNA對免疫細胞作用的研究可以為抗腫瘤治療提供新的思路，但目前其作用機制仍然非常復(fù)雜，需要在未來進行更全面、深入的研究，以期形成新的基于ncRNA對免疫細胞調(diào)控作用的HCC治療策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：楊超然、李思柔負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；劉源、侯志遠、王元參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；楊季紅負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。楊超然和李思柔對本文貢獻等同，同為第一作者。

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收稿日期：

2022-07-28；錄用日期：2022-09-09

本文編輯：王瑩