代謝相關(guān)脂肪性肝病患兒外周血黏膜相關(guān)恒定T淋巴細(xì)胞的頻率、表型及功能改變

姜濤 歐陽文獻(xiàn) 譚艷芳 康楨 李雙杰

摘要：目的 探討代謝相關(guān)脂肪性肝?。∕AFLD）患兒外周血黏膜相關(guān)恒定T（MAIT）淋巴細(xì)胞的變化及其臨床意義。方法 選取2022年3月—2022年5月在湖南省兒童醫(yī)院就診的18例MAFLD患兒（MAFLD組）及同期20例正常對(duì)照兒童（對(duì)照組），采集外周血，流式細(xì)胞儀檢測MAIT淋巴細(xì)胞（CD3+CD161+TCRVα7.2+細(xì)胞）及其不同MAIT淋巴細(xì)胞亞型（CD4+CD8-MAIT淋巴細(xì)胞、CD4-CD8-MAIT淋巴細(xì)胞、CD4-CD8+MAIT淋巴細(xì)胞和CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞）比例，表達(dá)PD-1、CD69、穿孔素、CD107α、CXCR3、CXCR6和CCR6的MAIT淋巴細(xì)胞比例，分析MAIT淋巴細(xì)胞頻率與肝臟炎癥、脂肪含量和纖維化程度的相關(guān)性。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。結(jié)果 與對(duì)照組相比，MAFLD組中外周血MAIT淋巴細(xì)胞比例及表達(dá)PD-1、CD69、CD107α、CXCR3、CXCR6和CCR6的MAIT淋巴細(xì)胞比例均明顯升高（P值均＜0.05）；MAIT淋巴細(xì)胞亞型中CD4+CD8-MAIT淋巴細(xì)胞、CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞所占MAIT淋巴細(xì)胞比例明顯升高（P值均＜0.001），CD4-CD8+MAIT淋巴細(xì)胞所占MAIT淋巴細(xì)胞比例降低（P＜0.001）；CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞（r=-0.474，P=0.047）和CD107α陽性MAIT淋巴細(xì)胞比例（r=-0.550，P=0.018）與ALT呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 外周血MAIT淋巴細(xì)胞向肝臟趨化聚集，在兒童MAFLD肝臟炎癥中發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞； 代謝相關(guān)脂肪性肝病； 兒童

基金項(xiàng)目：湖南省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題（20200695）

Changes in the frequency， phenotype， and function of mucosal-associated invariant T lymphocytes in peripheral blood of children with metabolic associated fatty liver disease

JIANG Tao， OUYANG Wenxian， TAN Yanfang， KANG Zhen， LI Shuangjie. （Department of Hepatopathy Center， Hunan Childrens Hospital， Changsha 410007， China）

Corresponding author：

LI Shuangjie， lesjie62@vip.sina.com （ORCID：0000-0002-3792-6793）

Abstract：

Objective To investigate the change in mucosal-associated invariant T （MAIT） lymphocytes in peripheral blood of children with metabolic associated fatty liver disease （MAFLD） and its clinical significance. Methods A total of 18 children with MAFLD who attended Hunan Childrens Hospital from March to May， 2022， were enrolled as MAFLD group， and 20 normal children who attended the hospital during the same period of time were enrolled as control group. Peripheral blood samples were collected， and flow cytometry was used to measure the percentages of MAIT lymphocytes （CD3+CDl61+TCRVα7.2+ cells）， different MAIT lymphocyte subsets （CD4+CD8- MAIT cells， CD4-CD8- MAIT lymphocytes， CD4-CD8+ MAIT lymphocytes， and CD4+CD8+ MAIT lymphocytes）， and MAIT lymphocytes expressing PD-1， CD69， perforin， CD107α， CXCR3， CXCR6， and CCR6. The correlation of MAIT lymphocyte frequency with liver inflammation， fat content， and fibrosis degree was analyzed. The t-test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups， and the Mann-Whitney U test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups. The Spearman correlation analysis was used for correlation analysis. Results Compared with the control group， the MAFLD group had significant increases in the percentage of MAIT lymphocytes in peripheral blood， the percentages of MAIT cells expressing PD-1， CD69， CD107α， CXCR3， CXCR6 and CCR6， and the percentages of CD4+CD8- MAIT cells and CD4+CD8+ MAIT lymphocytes among MAIT cell subsets （all P＜0.05）， as well as a significant reduction in the percentage of CD4-CD8+ MAIT cells among MAIT cell subsets （P＜0.001）. The percentages of CD4+CD8+ MAIT lymphocytes and CD107α-positive MAIT lymphocytes were negatively correlated with alanine aminotransferase （r=-0.474 and -0.550， P=0.047 and 0.018）. Conclusion The migration of peripheral blood MAIT lymphocytes to the liver plays a protective role against liver inflammation in children with MAFLD.

Key words：

Mucosal-Associated Invariant T Cells； Metabolic associated Fatty Liver Disease； Child

Research funding：

Scientific Research Project of Health and Family Planning Commission of Hunan Province（20200695）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種常見的慢性肝病，包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相關(guān)肝纖維化和肝硬化［1］，部分患者甚至進(jìn)展為肝癌，現(xiàn)在被稱為代謝相關(guān)脂肪性肝病 （metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）［2-3］，隨著肥胖發(fā)病率逐年增高和低齡化趨勢(shì)，NAFLD成為兒童慢性肝病的常見原因［4］，肝硬化的三大主要原因之一。目前MAFLD的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，臨床上亦缺乏有效的藥物治療，因此MAFLD發(fā)病機(jī)制的研究是當(dāng)前的熱點(diǎn)。

黏膜相關(guān)恒定T（mucosal associated invariant T，MAIT）淋巴細(xì)胞是一類新的天然免疫T淋巴細(xì)胞，是最豐富的TCRαβ+T淋巴細(xì)胞，以1類主要組織相容性復(fù)合體相關(guān)分子和不依賴MR1的方式快速激活 MAIT 淋巴細(xì)胞［5］，發(fā)揮生物學(xué)功能，釋放多種細(xì)胞因子，如IFNγ、TNFα、IL-17和溶細(xì)胞產(chǎn)物穿孔素及顆粒素分泌并脫顆粒（將CD107a暴露于細(xì)胞表面）等殺傷性細(xì)胞因子［6］，迅速誘導(dǎo)細(xì)胞溶解和靶細(xì)胞的死亡。國外相關(guān)報(bào)道［7-9］顯示MAIT淋巴細(xì)胞在成人MAFLD發(fā)病中起到減少肝臟炎癥及促肝纖維化作用，但在兒童MAFLD發(fā)病中作用的研究甚少。本研究通過分析MAFLD兒童外周血MAIT淋巴細(xì)胞的變化及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討MAIT淋巴細(xì)胞在兒童MAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2022年3月—2022年5月在本院肝病中心診治的18例MAFLD患兒（MAFLD組）的外周血標(biāo)本，根據(jù)年齡匹配的20例正常兒童作為對(duì)照（對(duì)照組），其外周血標(biāo)本采集于本院健康管理中心。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) MAFLD組納入標(biāo)準(zhǔn)：脂肪肝合并超重/肥胖、2型糖尿病和代謝功能障礙中至少一項(xiàng)特征［1-2］。同時(shí)排除合并甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒感染，自身免疫性肝病，人類免疫缺陷病毒等病毒感染。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：肝功能正常，無慢性疾病，近期無感染史等。

1.3 方法 人外周血免疫細(xì)胞的制備：留取MAFLD組和對(duì)照組兒童外周血3 mL，將PBS加入3 mL新鮮全血中，吸取稀釋后的外周血緩慢加到lymphoprep表面。全血在400×g室溫下離心20 min，收集第二層外周血免疫細(xì)胞并轉(zhuǎn)入含有PBS的離心管中，離心機(jī)800×g室溫下離心10 min。離心結(jié)束后去上清，再加入10 mL PBS，離心機(jī)400×g室溫下離心5 min，清洗外周血免疫細(xì)胞以徹底去除殘留的lymphoprep。

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測MAIT細(xì)胞，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使用以下抗體：CD183（CXCR3）、CD279（PD-1）， CD186（CXCR6）、CD3、TCRVα7.2、CD8、CD69、CD161、CD107a、CD196 （CCR6）、CD4和穿孔素抗體進(jìn)行染色，上流式細(xì)胞儀（三激光八色流式細(xì)胞分析儀，型號(hào)：FacsCantoll，產(chǎn)地：美國）進(jìn)行分析。外周血中MAIT細(xì)胞定義為CD3+CD161+TCRVα7．2+細(xì)胞。

收集MAFLD組和對(duì)照組兒童血常規(guī)及肝功能結(jié)果，使用瞬時(shí)彈性成像檢測MAFLD組患兒的肝纖維化和脂肪含量，兒童MAFLD肝纖維化最佳臨界值為6.65 kPa［10］，區(qū)分有無脂肪變性的脂肪肝參數(shù)最佳臨界值為222.5 dB/m［11］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用 Mann-Whitney U檢驗(yàn)。MAFLD組患兒外周血MAIT淋巴細(xì)胞頻率與肝損傷、肝臟脂肪含量和纖維化相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)分析法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 MAFLD組18例患兒年齡波動(dòng)在6.17～13.08歲，對(duì)照組20例兒童年齡波動(dòng)在5.83～13.00歲。MAFLD組的中性粒細(xì)胞、ALT、AST水平高于對(duì)照組（P值均＜0.05）（表1）。MAFLD組患兒肝纖維化彈性值為5.55（4.18～7.13）kPa，脂肪肝參數(shù)為（253.85±16.40） dB/m。

2.2 兒童外周血MAIT淋巴細(xì)胞頻率比較 與對(duì)照組相比，MAFLD組患兒外周血MAIT淋巴細(xì)胞占CD3+T淋巴細(xì)胞的比例明顯升高（P＜0.001），CD4+CD8-MAIT淋巴細(xì)胞、CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞所占MAIT淋巴細(xì)胞比例明顯升高，CD4-CD8+MAIT淋巴細(xì)胞所占MAIT淋巴細(xì)胞比例降低（P值均＜0.001），CD4-CD8-MAIT淋巴細(xì)胞所占MAIT淋巴細(xì)胞比例無變化（P＞0.05）（表2）。2.3 外周血MAIT淋巴細(xì)胞表型和功能的差異 與對(duì)照組相比，MAFLD組患兒外周血表達(dá)PD-1、CD69、CD107α、CXCR3、CXCR6和CCR6的MAIT淋巴細(xì)胞比例均明顯升高（P值均＜0.05）（表3）。

2.4 MAFLD組患兒外周血MAIT淋巴細(xì)胞頻率與肝臟炎癥、脂肪含量和纖維化程度的關(guān)系

CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞和CD107α陽性MAIT淋巴細(xì)胞比例與ALT呈負(fù)相關(guān)（P值均＜0.05）；MAIT淋巴細(xì)胞、CD4+CD8-MAIT淋巴細(xì)胞、CD4-CD8+MAIT淋巴細(xì)胞比例與ALT無相關(guān)性（P值均＞0.05）；MAIT淋巴細(xì)胞、CD4+CD8-MAIT淋巴細(xì)胞、CD4-CD8+MAIT淋巴細(xì)胞、CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞和CD107α陽性MAIT淋巴細(xì)胞比例與AST、瞬時(shí)彈性成像中脂肪肝參數(shù)以及彈性值均無相關(guān)性（P值均＞0.05）（表4）。

3 討論

MAIT 細(xì)胞與代謝功能障礙的發(fā)展有關(guān)，肥胖兒童外周血MAIT細(xì)胞頻率高于非肥胖兒童［12］，其頻率隨著肥胖人群年齡的增長而下降，糖尿病和肥胖成人外周血MAIT細(xì)胞頻率降低［13-15］，肥胖成人和兒童中的高IL-17+表型在胰島素抵抗發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［12，16］。目前MAIT淋巴細(xì)胞在MAFLD發(fā)病中作用機(jī)制的研究主要集中在成人，研究發(fā)現(xiàn)，MAFLD患者中循環(huán)MAIT淋巴細(xì)胞頻率降低［7-9，17］，伴隨著CXCR6表達(dá)的增加，而肝臟中MAIT淋巴細(xì)胞數(shù)量則明顯增加，與MAFLD活動(dòng)評(píng)分呈正相關(guān)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，MAFLD患兒外周血MAIT淋巴細(xì)胞頻率明顯升高的同時(shí)伴有趨化因子CCR6、CXCR6、CXCR3表達(dá)的增加，表明MAFLD患兒外周血MAIT淋巴細(xì)胞亦具有更強(qiáng)的遷移至肝臟的傾向［8］，MAFLD患者外周血MAIT淋巴細(xì)胞頻率的變化亦有著隨著年齡增長而有下降的趨勢(shì)，而這種下降的趨勢(shì)可能與其遷移至肝臟有關(guān)。MAIT淋巴細(xì)胞可分為DP（CD4+CD8+）MAIT淋巴細(xì)胞、CD4+CD8-（CD4+）MAIT淋巴細(xì)胞、CD4-CD8+（CD8+）MAIT淋巴細(xì)胞和CD4-CD8-（DN）MAIT淋巴細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)健康兒童中以CD4-CD8-MAIT淋巴細(xì)胞和CD8+MAIT淋巴細(xì)胞為主［18］，而MAFLD組患兒中以CD4-CD8-MAIT淋巴細(xì)胞和CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞為主，且與對(duì)照組相比，MAFLD組患兒CD4+MAIT淋巴細(xì)胞和CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞所占MAIT細(xì)胞比率升高，CD8+MAIT淋巴細(xì)胞所占MAIT淋巴細(xì)胞比率降低。

MAIT淋巴細(xì)胞在MAFLD中的作用為保護(hù)還是促進(jìn)作用，與其所處疾病階段有關(guān)。MAFLD成人患者中，外周血MAIT淋巴細(xì)胞降低的同時(shí)伴隨著功能的改變，高表達(dá)CD69、PD-1及IL-4的產(chǎn)生增加，而IFNγ和TNFα的產(chǎn)生減少等。在蛋氨酸膽堿缺乏誘導(dǎo)的NASH模型中，MAIT細(xì)胞在肝臟中富集，并通過產(chǎn)生 IL-4和IL-10以及誘導(dǎo)抗炎M2巨噬細(xì)胞來保護(hù)肝臟炎癥［8］。隨著病情的進(jìn)展，肝內(nèi)MAIT淋巴細(xì)胞的頻率下降，在肝硬化和肝細(xì)胞癌的進(jìn)展中起到促進(jìn)作用［7，17，19］。本研究發(fā)現(xiàn)，MAFLD患兒外周血MAIT淋巴細(xì)胞水平明顯升高的同時(shí)，伴有CD69、PD-1及CD107表達(dá)的增加，提示MAIT淋巴細(xì)胞被激活并功能性耗竭的同時(shí)，伴隨著細(xì)胞毒性能力的增加。進(jìn)一步研究顯示CD4+CD8+MAIT淋巴細(xì)胞、CD107陽性MAIT淋巴細(xì)胞比例與ALT水平呈負(fù)相關(guān)，說明MAFLD患兒外周血MAIT細(xì)胞在肝臟炎癥中具有保護(hù)作用，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致。

綜上所述，MAIT淋巴細(xì)胞比例在MAFLD患兒外周血中明顯升高，并在肝臟炎癥中起著保護(hù)作用。本研究的局限性在于樣本量偏少，進(jìn)展期肝纖維化患兒病例數(shù)少，未檢測肝臟組織MAIT淋巴細(xì)胞數(shù)量和其功能改變，MAIT淋巴細(xì)胞在兒童MAFLD發(fā)病中確切的免疫學(xué)機(jī)制及作用尚待進(jìn)一步明確。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020年4月30日經(jīng)由湖南省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：HCHLL-2020-38，所納入患兒家屬均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：姜濤和譚艷芳負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；康楨參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；歐陽文獻(xiàn)和李雙杰負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：

2022-10-21；錄用日期：2022-12-06

本文編輯：林姣