HDVRNA檢測(cè)的研究現(xiàn)狀

高耀 任鋒 段鐘平

摘要：HDV感染導(dǎo)致的丁型肝炎是最嚴(yán)重的肝炎類型。由于缺乏精準(zhǔn)HDV RNA檢測(cè)方法，HDV的流行率被嚴(yán)重低估。HDV RNA是診斷HDV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，在HDV的診斷、篩查和指導(dǎo)治療方面具有重要意義。但因HDV基因型多、二級(jí)結(jié)構(gòu)牢固，導(dǎo)致HDV RNA檢測(cè)困難。本文就HDV RNA診斷方法的進(jìn)展進(jìn)行綜述，闡述了HDV RNA檢測(cè)方法從定性到定量檢測(cè)的進(jìn)展，為了解HDV RNA檢測(cè)重要意義以及促進(jìn)HDV RNA檢測(cè)新方法的研發(fā)提供新思路。

關(guān)鍵詞：δ肝炎病毒; RNA; 診斷

基金項(xiàng)目：

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81770611， 82002243）； 北京自然科學(xué)基金和北京市教委聯(lián)合資助重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ202010025035）； 首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（首發(fā)2020-1-1151）； 北京市屬醫(yī)學(xué)科研院所公益發(fā)展改革試點(diǎn)項(xiàng)目（京醫(yī)研2021-10）； 北京市衛(wèi)健委高層次公共衛(wèi)生技術(shù)人才建設(shè)項(xiàng)目“學(xué)科帶頭人”專項(xiàng)資助（SL-02-13）； 北京市醫(yī)院管理中心“登峰人才”專項(xiàng)資助（DFL20221503）； 首都醫(yī)科大學(xué)科研培育基金資助項(xiàng)目（PYZ22130）

Current research status of hepatitis D virus RNA detection

GAO Yao1，2， REN Feng1，2， DUAN Zhongping1. （1. Beijing Municipal Key Laboratory of Liver Failure and Artificial Liver Treatment Research， Beijing YouAn Hospital， Capital Medical University， Beijing 100069， China; 2. Beijing Institute of Hepatology， Beijing 100069， China）

Corresponding author：

DUAN Zhongping， duan2517@163.com （ORCID：0000-0002-8455-0426）

Abstract：

Hepatitis D caused by hepatitis D virus （HDV） infection is the most serious type of viral hepatitis. The prevalence rate of HDV has been seriously underestimated due to the lack of accurate HDV RNA detection methods. HDV RNA is the gold standard for the diagnosis of HDV infection and is of great significance in the diagnosis， screening， and treatment guidance of HDV. However， the multiple genotypes and strong secondary structure of HDV have led to great difficulties in HDV RNA detection. This article reviews the advances in HDV RNA detection methods and elaborates on the development from qualitative to quantitative detection methods， in order to provide new ideas for understanding the significance of HDV RNA detection and promoting the research and development of new HDV RNA detection methods.

Key words：

Hepatitis Delta Virus; RNA; Diagnosis

Research funding：

National Natural Science Foundation of China （81770611， 82002243）; Key Projects of the Beijing Municipal Education Commissions Science and Technology Plan （KZ202010025035）; Special Key Research Project of Capital Health Development Scientific Research （SF2020-1-1151）; Pilot Project of Public Welfare Development and Reform of Beijing Municipal Medical Research Institutes （Beijing Medical Research No. 2021-10）; High-level Public Health Technical Personnel Construction Project （Subject leaders-02-13）; Talent Cultivation plan of “Climbing the peak” of Beijing Municipal Hospital Administration （DFL20221503）; Research and Cultivation Foundation of Capital Medical University （PYZ22130）

HDV是一種血源性傳播病原體，也是目前已知能夠感染人類的最小病毒［1］。HDV最初于1977年被Rizzetto等［2］首先在HBV感染相關(guān)重癥肝炎患者中發(fā)現(xiàn)。HDV是一種衛(wèi)星病毒，其感染和傳播均需要依賴HBV。因HDV感染而引起的丁型肝炎是最嚴(yán)重類型的病毒性肝炎。近年隨著HDV檢測(cè)準(zhǔn)確性的不斷提高，人們意識(shí)到HDV的流行率被嚴(yán)重低估，既往認(rèn)為丁型肝炎發(fā)病率低的看法被徹底顛覆，HDV的精準(zhǔn)檢測(cè)也逐漸成為研究熱點(diǎn)。

1 HDV的流行率及其危害

根據(jù)2020年的一項(xiàng)研究［1］估計(jì)，全球約有1 200萬(wàn)人感染HDV。然而由于存在地區(qū)差異、人群差異、診斷方式差異，HDV的感染率被嚴(yán)重低估，后續(xù)有研究不斷更新了HDV的感染率，2021—2023年發(fā)表的薈萃分析［3-4］報(bào)道了HDV的感染人數(shù)高達(dá)5 000萬(wàn)～7 200萬(wàn)。

目前已知感染HDV的高危因素包括靜脈吸毒（IVDU）、高危性行為（HRSB）、HIV感染、HCV感染、高發(fā)地區(qū)人口遷徙等。因此HDV的流行率存在較大的地域及人群差異。Miao等［4］通過(guò)對(duì)1980—2019年發(fā)表的研究進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，HDV在普通人群中的流行率約為0.80%，在HBsAg陽(yáng)性人群可高達(dá)13.02%，在靜脈吸毒人群中的流行率為37.57%，在高危性行為人群中為17.01%。2022年Chen等［3］對(duì)1990—2021年發(fā)表的研究進(jìn)行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi)，HDV/HBV/HIV三重感染者占HIV感染者的7.4%，在亞洲地區(qū)HDV有更高的流行率，尤其是在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)，HDV/HBV/HIV三重感染率甚至高達(dá)21.4%。

HDV的流行率遠(yuǎn)超預(yù)期，HDV篩查尤其是對(duì)特殊人群的HDV檢測(cè)更加應(yīng)該引起重視。2017年歐洲肝病學(xué)會(huì)［5］和2016年亞太肝病學(xué)會(huì)［6］均建議對(duì)所有HBsAg陽(yáng)性人群進(jìn)行至少一次HDV檢測(cè)。2018年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)［7］則建議HDV的篩查不僅應(yīng)在HBsAg陽(yáng)性人群中進(jìn)行，更應(yīng)該在HDV高危人群中規(guī)律進(jìn)行。目前大多數(shù)國(guó)家及地區(qū)采用HDV血清學(xué)檢測(cè)（即HDV抗體）為主要檢測(cè)方式。2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）慢性乙型肝炎指南［8］建議HDV活動(dòng)期應(yīng)根據(jù)HDV抗體滴度診斷，再通過(guò)HDV RNA檢測(cè)進(jìn)行最終確診。然而根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球只有64.9%的HDV抗體陽(yáng)性患者接受HDV RNA檢測(cè)，而非洲地區(qū)檢測(cè)率更是遠(yuǎn)低于其他地區(qū)，僅有41.3%的HDV抗體陽(yáng)性患者進(jìn)行了RNA檢測(cè)［1］。造成HDV檢測(cè)率低及各地區(qū)檢測(cè)率不同的原因，除了不同國(guó)家醫(yī)療水平存在差異，患者及醫(yī)療工作者對(duì)HDV的認(rèn)識(shí)不同以外，更要?dú)w因于HDV檢測(cè)方式及檢測(cè)精準(zhǔn)度存在巨大差異。

2 HDV特征及其對(duì)RNA檢測(cè)的影響

HDV顆粒直徑為36 nm，基因組長(zhǎng)度約1.7 kb，可編碼兩種形式的丁型肝炎抗原（HDAg），即小HDAg（S-HDAg）和大HDAg（L-HDAg）。S-HDAg是啟動(dòng)和維持HDV RNA復(fù)制所必需；L-HDAg可抑制HDV復(fù)制，對(duì)于病毒顆粒的組裝至關(guān)重要［9］。HDV僅在肝細(xì)胞核中復(fù)制，其病毒顆粒存在缺陷，故HDV的復(fù)制依賴于HBV。作為一種包膜蛋白，HBsAg允許HDV進(jìn)入肝細(xì)胞。HDV和HBV首先與肝細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結(jié)合，通過(guò)?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）進(jìn)入宿主細(xì)胞［10］。在發(fā)生細(xì)胞膜融合后，核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物被釋放并進(jìn)一步被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)S-HDAg的mRNA被轉(zhuǎn)錄和翻譯。進(jìn)入細(xì)胞核的RNA基因組（HDV-G）作為第一次滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增的模板參與復(fù)制，所產(chǎn)生的反式基因組RNA（HDV-AG）聚合物被核酶切割并連接成環(huán)狀單體。使用HDV-AG作為模板，合成HDV基因組RNA聚合物，并進(jìn)一步裂解形成單體。細(xì)胞腺苷脫氨酶1通過(guò)調(diào)節(jié)HDV-AG來(lái)調(diào)控L-HDAg的轉(zhuǎn)錄和翻譯［9］。S-HDAg和L-HDAg被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，進(jìn)一步調(diào)節(jié)病毒復(fù)制或與HDV RNA結(jié)合形成RNP。含有HDV基因組RNA的RNP可以通過(guò)L-HDAg和HBsAg相互作用，輸出到細(xì)胞質(zhì)并包裹在HBV包膜中。HDV顆粒通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑釋放。除了依賴HBV包膜的感染方式，HDV還可以在有絲分裂期間直接在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移可復(fù)制的HDV RNA［11］。HDV有8種基因型，同一基因型分離株之間的差異小于16%，而不同基因型分離株差異可高達(dá)40%［12］。HDV的這一特征也是導(dǎo)致HDV RNA檢測(cè)困難的主要原因之一。

3 HDV RNA檢測(cè)的臨床意義

HDV感染形式有2種。（1）合并感染：HDV和HBV同時(shí)感染宿主引起急性病毒性肝炎；（2）雙重感染：HBsAg攜帶者或慢性HBV感染者重復(fù)感染HDV導(dǎo)致慢性病毒性肝炎［13］。與慢性乙型肝炎相比，重疊感染HDV的患者發(fā)生肝硬化、肝功能失代償以及肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加2倍，在慢性乙型肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞癌人群中，HDV的流行率分別高達(dá)26.75%、25.77%和19.80%［14］。

HDV有獨(dú)特的肝內(nèi)傳播方式。其需要HBV編碼的包膜蛋白進(jìn)行傳播和重新進(jìn)入肝細(xì)胞，HDV也可以通過(guò)細(xì)胞分裂傳播。進(jìn)入肝細(xì)胞后，HDV RNA的復(fù)制中間體被模式識(shí)別受體MDA5感知，誘導(dǎo)IFNβ/λ分泌。IFN的分泌強(qiáng)烈抑制了HDV基因組細(xì)胞分裂介導(dǎo)的肝內(nèi)病毒傳播。然而IFN不能影響靜止期肝細(xì)胞中的HDV RNA復(fù)制。因此在HDV的臨床治療中，IFNα/λ單藥治療有效，但很少能清除HDV。HDV感染途徑及肝內(nèi)復(fù)制方式的廣泛研究，明確了治療HDV的關(guān)鍵在于降低HDV滴度和HBsAg水平。既往HDV感染者的治療方式以PEG-IFNα治療為主，但是PEG-IFNα治療效果差，只有約20%的患者出現(xiàn)治療應(yīng)答，且?guī)?lái)的諸多副作用也增加了治療難度［15］。近年來(lái)，3類新型抗HDV藥物先后進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，分別為進(jìn)入肝細(xì)胞抑制劑Bulevirtide（BLV）、戊烯化抑制劑（LNF）和HBsAg分泌抑制劑（核酸多聚體REP2139）。其中BLV已于2020年在歐洲作為治療HDV的藥物獲批上市。BLV可模仿L-HBsAg的NTCP受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，抑制HBV/HDV進(jìn)入肝細(xì)胞。研究［16］表明，BLV單獨(dú)用藥或與IFN等聯(lián)合使用均可明顯降低血清中HDV的病毒載量。皮下注射BLV 24周以上，68%～72%的患者出現(xiàn)HDV RNA載量降低（≥2 log10 IU/mL），但BLV不能降低HBsAg的水平。新型藥物單獨(dú)或與IFN的聯(lián)合使用或許能為HDV患者帶來(lái)治愈的曙光。

盡管HDV感染的潛在機(jī)制尚不完全清楚，但HDV負(fù)荷量可以在一定程度上影響肝臟疾病的進(jìn)程。此外，目前尚無(wú)有效的HDV治療方法。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、靈敏且特異性強(qiáng)的HDV RNA檢測(cè)方法，以監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展和評(píng)價(jià)治療效果。

4 HDV血清學(xué)檢測(cè)方法及其不足

從傳統(tǒng)意義上來(lái)說(shuō)，病毒性疾病的診斷依賴于直接通過(guò)檢測(cè)完整病毒或其成分（蛋白質(zhì)或核酸）或通過(guò)間接血清學(xué)檢查以檢測(cè)病毒抗原或抗體。在HDV被發(fā)現(xiàn)后不久，相應(yīng)的抗原/抗體檢測(cè)方式被迅速研發(fā)。目前，抗體檢測(cè)常被用作HDV感染的初步篩查，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）或放射免疫測(cè)定檢測(cè)HDAg抗體，通常檢測(cè)抗-HD IgM和抗-HD IgG。在出現(xiàn)癥狀后的2～3周可檢測(cè)到抗-HD IgM，在急性HDV感染2個(gè)月后消失［17］。然而，在慢性HDV感染者急性發(fā)作期間，患者的抗-HD IgM也會(huì)升高，因此檢測(cè)抗-HD IgM不能明確區(qū)分急性和慢性HDV感染。急性HDV感染者的緩解期和慢性HDV感染者均出現(xiàn)抗-HD IgG，在病毒清除后抗體可持續(xù)存在較長(zhǎng)時(shí)間，因此難以區(qū)分HDV的現(xiàn)癥感染和既往感染。因此目前認(rèn)為HDV RNA檢測(cè)陽(yáng)性是確診HDV的金標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)HDV RNA的方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)。除了具有極高的診斷價(jià)值，HDV RNA的病毒載量檢測(cè)對(duì)于鑒別HDV基因型、確定治療方案、追蹤治療效果等方面亦具有較高的指導(dǎo)意義。因此WHO推薦所有HDV抗體陽(yáng)性的患者均應(yīng)進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)。

5 HDV RNA檢測(cè)的方法及局限性

5.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） PCR技術(shù)是分子生物學(xué)最偉大的成就之一，由Kary B. Mullis在1983年發(fā)明，并因此獲得了1993年的諾貝爾獎(jiǎng)。RT-PCR原理是在體外模擬遺傳物質(zhì)的天然復(fù)制，以微量的核酸模板擴(kuò)增得到大量的特定DNA片段。1985年，Randall K. Saiki等研究者首次將PCR技術(shù)用于臨床疾病診斷，其使用PCR技術(shù)檢測(cè)鐮狀細(xì)胞性貧血和β-地中海貧血。此后，PCR也被用于HDV檢測(cè)。1990年，法國(guó)學(xué)者Zignego等［18］發(fā)表相關(guān)研究，確定了應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行HDV RNA檢測(cè)、克隆和測(cè)序的可行性，證明了PCR在診斷HDV感染、快速合成HDV探針和分析病毒遺傳變異方面具有重要價(jià)值。同一年，西班牙學(xué)者M(jìn)adejón等［19］驗(yàn)證了RT-PCR檢測(cè)HDV RNA在臨床中的可行性。該研究通過(guò)檢測(cè)梯度稀釋的HDV RNA，用RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern印記雜交，證明RT-PCR檢測(cè)比狹縫雜交技術(shù)（slot-blot hybridization）靈敏10 000倍。該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)將RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床，進(jìn)行了更大數(shù)量的臨床標(biāo)本驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)慢性HDV感染過(guò)程中不同HDV復(fù)制水平以及低水平的HDV復(fù)制與ALT之間存在相關(guān)性，表明PCR技術(shù)在檢測(cè)HDV復(fù)制中具有重要的應(yīng)用價(jià)值［20］。越來(lái)越多的研究者將PCR應(yīng)用于HDV的研究，HDV RNA檢測(cè)的靈敏度和特異度不斷提升，操作步驟也被逐漸優(yōu)化。

5.2 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR） 為進(jìn)一步提高PCR的精準(zhǔn)度及實(shí)現(xiàn)核酸定量，研發(fā)了RT-qPCR技術(shù)。RT-qPCR是指在PCR反應(yīng)中加入熒光物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)判斷核酸擴(kuò)增情況，而后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板RNA進(jìn)行定量分析，以達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的目的。根據(jù)熒光信號(hào)來(lái)源的不同，可分為熒光染料法（SYBR Green）和探針?lè)ǎ═aqman）。染料法成本較低，應(yīng)用廣泛；探針?lè)`敏性和特異性更強(qiáng)，但成本相對(duì)較高。迄今為止，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)方法成熟，在核酸檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，也有公司在該方法的基礎(chǔ)上生產(chǎn)商品化試劑盒。盡管RT-qPCR在多種核酸檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的特異性和靈敏性，但是由于HDV基因型多（8種），各基因型間的序列差異較大、二級(jí)結(jié)構(gòu)牢固、GC含量和互補(bǔ)性高以及HDV存在高度遺傳變異性，設(shè)計(jì)涵蓋所有基因型的引物和探針具有極大的挑戰(zhàn)性，因此HDV RNA檢測(cè)的進(jìn)展緩慢。

2004年日本學(xué)者Yamashiro等［21］首次使用RT-qPCR檢測(cè)了48例HBsAg和丁型肝炎抗體陽(yáng)性患者血清中的HDV RNA，不僅證明了RT-qPCR（染料法）在臨床檢測(cè)中應(yīng)用的可能，還發(fā)現(xiàn)慢性肝炎和肝硬化患者血清中HDV RNA水平明顯高于無(wú)癥狀患者，提示血清HDV RNA的病毒載量與肝病不同進(jìn)程存在相關(guān)性。然而該研究設(shè)計(jì)的引物僅能檢測(cè)HDV-2型和HDV-4型，且所用的臨床樣本量少。2005年，法國(guó)學(xué)者Le Gal等［22］進(jìn)一步改進(jìn)了反應(yīng)體系，建立了Taqman探針?lè)z測(cè)HDV RNA，可對(duì)所有基因型進(jìn)行檢測(cè)，且靈敏度高，可達(dá)到100拷貝/mL，并納入了更多血清樣本（共160例，其中包括IFN治療前后不同時(shí)間點(diǎn)的76例血清標(biāo)本）進(jìn)行驗(yàn)證，研究結(jié)果顯示HDV RNA的檢測(cè)有助于幫助明確丁型肝炎患者治療前、治療中和治療后的病毒學(xué)特征，可用于慢性感染者治療方案管理以及HDV感染史的研究。此外RT-qPCR還可以用于大規(guī)模的前瞻性研究，以確定治療指南和評(píng)估新藥的治療效果。在后續(xù)的數(shù)十年內(nèi)，RT-qPCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于HDV檢測(cè)，相關(guān)研究大量涌現(xiàn)，主要集中于以下5個(gè)方面。（1）用于HBV感染人群中HDV的篩查。各國(guó)家的研究者分別對(duì)韓國(guó)［23］、埃及［24］、巴基斯坦［25］、巴西［26］、澳大利亞［27］等國(guó)家及地區(qū)的HDV流行率進(jìn)行評(píng)估，使人們逐漸意識(shí)到HDV的流行率被嚴(yán)重低估。（2）用于HDV基因型的檢測(cè)。確定了不同HDV基因型的流行區(qū)域［28］，并發(fā)現(xiàn)HDV-3型與肝病的不良結(jié)局存在相關(guān)性［29］。通過(guò)研究大量血清或肝組織樣本，證明了HDV RNA病毒載量與暴發(fā)性肝炎、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)［14］。（3）用于監(jiān)測(cè)IFN治療效果及新藥治療效果的臨床驗(yàn)證。證明了足療程、足量使用IFN或與其他藥物聯(lián)用可以降低HDV病毒載量［30-31］，也證明了新型抗HDV藥物BLV、LNF和核酸多聚體REP213均具有良好的治療效果［16］。（4）用于HDV病毒譜的分析［32］和HDV全基因組測(cè)序［33］，為理解HDV重組和明確HDV感染機(jī)制提供了幫助。（5）各研究者或公司用于研發(fā)商業(yè)檢測(cè)試劑盒?？蓪?shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的一步實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄，從臨床樣本中快速、精準(zhǔn)、定量檢測(cè)HDV［34］。

RT-qPCR檢測(cè)是一種成熟的檢測(cè)病毒核酸的方法，但在HDV的檢測(cè)中存在一些缺陷。RT-qPCR檢測(cè)進(jìn)行RNA定量需要標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線。多數(shù)已發(fā)表的研究使用的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品是HDV質(zhì)粒，但這并不能評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄的步驟。也有研究者［35］使用體外合成的RNA作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，雖然該方法可以評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄的步驟，但合成的RNA沒(méi)有牢固的二級(jí)結(jié)構(gòu)，HDV基因組的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響HDV病毒載量的定量檢測(cè)。雖然WHO已經(jīng)提出了HDV RNA檢測(cè)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)方法仍需要進(jìn)行內(nèi)部?jī)?yōu)化，需與待測(cè)核酸進(jìn)行共純化、共擴(kuò)增。有研究者［36］使用管家基因如β-actin和18S rRNA作為內(nèi)部對(duì)照，然而，這些RNA的濃度在不同臨床樣本中存在較大差異。此外，質(zhì)控產(chǎn)品的選擇也會(huì)影響HDV RNA定量的準(zhǔn)確性。理想的核酸質(zhì)控產(chǎn)品不僅可以用于核酸檢測(cè)過(guò)程的質(zhì)量控制，也是評(píng)價(jià)檢測(cè)程序和對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的重要基礎(chǔ)。目前，RNA病毒的質(zhì)控產(chǎn)品多為裸露的RNA片段或完整的病毒顆粒。裸露的RNA片段很容易被環(huán)境中的RNase降解，而完整的病毒顆粒作為質(zhì)控樣品存在安全隱患。滅活藥物雖然可以降低傳染性，但病毒滅活試劑（如甲醛）會(huì)破壞病毒核酸，影響核酸的提?。?7］。理想的RNA質(zhì)控產(chǎn)品應(yīng)可以長(zhǎng)期穩(wěn)定的保存RNA。裝甲R(shí)NA技術(shù)可以克服RNA的不穩(wěn)定性，已廣泛應(yīng)用于RNA病毒核酸質(zhì)控產(chǎn)品的研究。2016年，國(guó)際上首次對(duì)血漿HDV RNA定量進(jìn)行了外部質(zhì)量評(píng)估。對(duì)來(lái)自全球17個(gè)國(guó)家的28個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，由于檢測(cè)技術(shù)和程序的差異以及設(shè)計(jì)的引物/探針目標(biāo)區(qū)域的不同，結(jié)果具有高度異質(zhì)性［38］。因此，有必要建立一個(gè)國(guó)際通用的HDV RNA定量檢測(cè)體系。

5.3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP） LAMP是1998年由日本Eiken Chemical公司研發(fā)，該技術(shù)改善了PCR的部分不足。與PCR相比，LAMP具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）反應(yīng)快速、靈敏性高?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)（＜1 h）將DNA的擴(kuò)增數(shù)量增加到10億，而PCR只能擴(kuò)增到100萬(wàn)。（2）不依賴大型儀器或設(shè)備。LAMP可以不依賴大型儀器設(shè)備，僅需要干式加熱器或水浴鍋進(jìn)行加熱即可進(jìn)行反應(yīng)。（3）特異性高。LAMP的優(yōu)點(diǎn)在于其高特異性，這是由于LAMP需要使用4～6種引物，可以識(shí)別DNA模板上8個(gè)以上的特定位點(diǎn)，相比之下，PCR只能識(shí)別2個(gè)位點(diǎn)。（4）結(jié)果判讀方便。LAMP的產(chǎn)物可以在反應(yīng)結(jié)束后立即用肉眼觀察，甚至在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)也可以觀察到（如產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的白色沉淀），而不需要任何額外的步驟。盡管LAMP已經(jīng)用于多種病毒和基因檢測(cè)，但其在HDV RNA檢測(cè)方面仍屬新方法，這與HDV RNA基因型多、引物設(shè)計(jì)困難有關(guān)。Wang等［39］建立了RT-LAMP檢測(cè)方法，特異性檢測(cè)HDV-1型，該方法反應(yīng)體系僅需在65 ℃下反應(yīng)50? min，檢測(cè)下限為75 fg/μL，與常規(guī)的定性或定量PCR相比，RT-LAMP檢測(cè)靈敏度提高了1? 000倍，且方法特異性高，與HIV、HAV、HBV、HCV、HEV等病毒無(wú)交叉反應(yīng)。雖然與PCR相比，該方法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其只針對(duì)了HDV-1型，且依賴加熱設(shè)備維持反應(yīng)溫度，因此仍需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以實(shí)現(xiàn)HDV核酸即時(shí)檢測(cè)。

5.4 微滴式數(shù)字PCR（ddPCR） ddPCR是在傳統(tǒng)定量qPCR基礎(chǔ)上研發(fā)的新一代技術(shù)，可以對(duì)RNA進(jìn)行定量。ddPCR的主要原理是利用微流控技術(shù)生成油包水乳化微滴顆粒，以每個(gè)油包水的微滴小顆粒作為反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及后續(xù)熒光檢測(cè)。與96孔/384孔qPCR相比，ddPCR可以增加反應(yīng)體系的數(shù)量，精簡(jiǎn)操作步驟。ddPCR具有技術(shù)成熟、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的PCR技術(shù)之一。ddPCR的關(guān)鍵步驟有微滴生成、微滴操控、微滴檢測(cè)。ddPCR微滴發(fā)生器可將帶熒光的PCR反應(yīng)體系分隔成數(shù)千甚至上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，RNA分子在各微滴顆粒中隨機(jī)分布，每個(gè)微滴顆粒都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，分析儀對(duì)每個(gè)微滴顆粒進(jìn)行檢測(cè)，將熒光模擬信號(hào)數(shù)字化，有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”，無(wú)熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”；根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，最終通過(guò)分析軟件直接給出目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)濃度，因此不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴于Ct值的鑒定，所以ddPCR受擴(kuò)增效率的影響大幅度降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大幅度提高［40-41］。與qPCR相比，ddPCR具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）ddPCR的定量不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2）ddPCR檢測(cè)RNA比qPCR具有更高的靈敏性和特異性。目前ddPCR的相關(guān)方法建立及臨床驗(yàn)證已陸續(xù)在HIV、HBV以及新冠病毒中開(kāi)展［41-43］。

2022年，先后有兩項(xiàng)研究［44-45］通過(guò)ddPCR技術(shù)建立了HDV RNA的檢測(cè)方法并進(jìn)行了臨床驗(yàn)證。意大利學(xué)者Olivero等［44］檢測(cè)HDV質(zhì)粒及20例HDV陽(yáng)性患者的血清樣本，對(duì)比了RT-qPCR與ddPCR的靈敏性及特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用相同引物和探針（涵蓋HDV的8種基因型）的情況下，RT-qPCR與ddPCR的靈敏性、特異性和檢測(cè)下限相似。然而在研究中，ddPCR的檢測(cè)范圍與RT-qPCR存在差異。RT-qPCR的線性范圍為1×10～1×108 IU/mL，ddPCR定量線性動(dòng)態(tài)范圍為1×10～1×106 IU/mL。這與ddPCR的定量方式有關(guān)，在較高的RNA濃度下（1×107和1×108 IU/mL），反應(yīng)被過(guò)量的目標(biāo)分子飽和，而檢測(cè)到的陰性樣本量較少，無(wú)法應(yīng)用泊松分布來(lái)計(jì)算起始樣品中靶分子的含量。同年，我國(guó)學(xué)者Xu等［45］通過(guò)使用ddPCR檢測(cè)梯度稀釋的HDV全基因型的通用質(zhì)粒（pMD19T），證明所建立方法的檢測(cè)下限（0.29 IU/mL vs 650.00 IU/mL）和定量檢測(cè)下限（76 IU/mL vs 7 315.82 IU/mL）均優(yōu)于RT-qPCR。該研究同時(shí)使用ddPCR和RT-qPCR檢測(cè)44例（30例HDV感染和14例HBV感染）患者血清樣本，證明ddPCR的特異性優(yōu)于RT-qPCR（24/44 vs 10/44）。此外，Xu等還應(yīng)用3種檢測(cè)方法（ELISA、RT-qPCR及ddPCR）對(duì)728例HBV陽(yáng)性患者的血清樣本進(jìn)行了HDV篩查，在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌和，ELISA檢測(cè)的HDV抗體陽(yáng)性率分別為1.1%、3.3%、2.7%和7.1%，RT-qPCR檢測(cè)HDV RNA陽(yáng)性率分別為0、16.67%、15.4%和20%，ddPCR檢測(cè)HDV陽(yáng)性率分別為0、33.33%、30.77%和60%。證明ddPCR和RT-qPCR的技術(shù)性能具有高度的可比性，并且提示在肝衰竭患者中存在更高的HDV陽(yáng)性率。以上研究表明，ddPCR是一種可重復(fù)性高、不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線以及操作簡(jiǎn)便的方法，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

6 展望

越來(lái)越多的流行病學(xué)研究表明，HDV的全球患病率遠(yuǎn)高于先前的估計(jì)值。HDV感染的快速實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)于識(shí)別、監(jiān)測(cè)和控制疾病傳播具有重要的意義。RNA檢測(cè)是診斷HDV的金標(biāo)準(zhǔn)，亦是監(jiān)測(cè)HDV治療效果的重要指標(biāo)。目前，不同的HDV RNA檢測(cè)方法靈敏度差異較大，主要原因在于缺乏國(guó)際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)比較不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果。不同實(shí)驗(yàn)室及技術(shù)人員在HDV RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量等一系列操作過(guò)程中存在差別，因此需要開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法，建立標(biāo)準(zhǔn)化程序，例如樣本類型、提取方法、引物/探針設(shè)計(jì)、使用儀器和報(bào)告數(shù)據(jù)方式等，以進(jìn)一步提高靈敏度和特異度，降低假陰性率，更早地識(shí)別丁型肝炎患者，及時(shí)控制HDV傳播。

此外，低收入和中等收入國(guó)家或地區(qū)的醫(yī)療保健體系不完善，對(duì)HDV的認(rèn)識(shí)不足，普及HDV感染的嚴(yán)重性，進(jìn)行HDV篩查，以推動(dòng)丁型肝炎的早期檢測(cè)、早期診斷、早期治療，對(duì)降低丁型肝炎的危害，減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)有重大意義。部分HDV的高發(fā)區(qū)地處偏遠(yuǎn)，缺乏大型儀器設(shè)備和專業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)，因此研發(fā)快速、便捷、不依賴儀器設(shè)備及對(duì)檢測(cè)人員要求低的HDV檢測(cè)新方法，以實(shí)現(xiàn)HDV的即時(shí)檢測(cè)，是未來(lái)的主要研發(fā)重點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：高耀負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；任鋒、段鐘平負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路并最后定稿。

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收稿日期：

2023-02-21；錄用日期：2023-03-21

本文編輯：葛俊