檸檬酸對(duì)食用菌腐敗菌的抑制作用及其作用機(jī)制

夏飛　張?zhí)幪帯∥渥訉帯〔軙r(shí)玲　鄔培鴻

摘要：腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌是在采收后食用菌中數(shù)量較高的致腐細(xì)菌，可引起雙孢蘑菇、杏鮑菇等食用菌的腐爛變質(zhì).檸檬酸是食品加工中常用的添加劑，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌等食源性病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，具有無(wú)臭、無(wú)毒害、無(wú)殘留等優(yōu)勢(shì).本研究通過(guò)抑菌圈測(cè)定、構(gòu)建時(shí)間-抑菌模型揭示檸檬酸對(duì)引起食用菌腐敗的腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的抑制效果，并進(jìn)一步從細(xì)胞膜通透性、完整性和菌體形態(tài)方面揭示檸檬酸的抑菌機(jī)制.結(jié)果表明，檸檬酸對(duì)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的抑菌圈直徑分別為1.57±0.03 cm、1.93±0.03 cm.根據(jù)Logistic方程建立檸檬酸的時(shí)間-抑菌模型，預(yù)測(cè)檸檬酸抑制腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的最高相對(duì)生長(zhǎng)下降比分別為36.93±1.58%和80.37±3.96%.經(jīng)檸檬酸處理，腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的菌液電導(dǎo)率顯著增加（p≤0.001），MIC處理組12 h后分別達(dá)到5.47±0.01 ms/cm和5.01±0.01 ms/cm.此外，腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的胞外核酸泄露量顯著增加，胞外蛋白泄漏量6 h時(shí)達(dá)到最大.通過(guò)掃描電鏡觀察，檸檬酸處理后菌體表面粗糙，出現(xiàn)褶皺、彎曲，并明顯發(fā)生破損.檸檬酸對(duì)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌具有較好的抑制效果；其作用機(jī)制是通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性和完整性，使胞內(nèi)電解質(zhì)外流，核酸、蛋白質(zhì)等大分子外泄，從而抑制菌體生長(zhǎng).本研究可為采收后食用菌腐敗菌無(wú)害化防治奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：檸檬酸； 腐敗菌； 抑菌模型

中圖分類號(hào)：TS255.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Antibacterial effect and mechanism of citric acid on

spoilage bacteria of edible mushroom

XIA Fei， ZHANG Chu-chu， WU Zi-ning， CAO Shi-ling， WU Pei-hong（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.are spoilage bacteria in higher numbers in postharvest edible mushroom，which can cause decay deterioration of edible mushrooms such as Agaricus bisporus and Pleurotus eryngii.Citric acid is a common additive in food processing，which has a strong inhibitory effect on food-borne pathogens such as Escherichia coli and Salmonella and has the advantages of being odorless，non-toxic，and having no residues.In this study，the antibacterial effect of citric acid on Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.causing edible mushroom spoilage was revealed through the determination of the inhibition zone and the establishment of the time-inhibition model，and the antibacterial mechanism of citric acid was further revealed from the aspects of cell membrane permeability，integrity，and thalli morphology.The results showed that the inhibition zone diameters of citric acid on Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.were 1.57±0.03 cm and 1.93±0.03 cm，respectively.According to the time-inhibition model of citric acid established by the Logistic equation，the maximum relative growth decline ratios of Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.were predicted to be 36.93±1.58% and 80.37±3.96%，respectively.After citric acid treatment，the conductivity of bacterial suspension increased significantly （p≤0.001） and reached 5.47±0.01 ms/cm and 5.01±0.01 ms/cm，respectively，after 12 hours in the MIC treatment group.In addition，the extracellular nucleic acid leakage increased significantly，and the extracellular protein leakage reached the maximum at 6 hours.Through scanning electron microscope observation，the thalli surface of the bacteria treated with citric acid was rough，wrinkled，bent and obviously damaged.Citric acid had a better inhibitory effect on Enterobacter sp.and Stenotrophomonas sp.; It inhibits bacterial growth by altering cell membrane permeability and integrity，allowing the efflux of intracellular electrolytes and the efflux of macromolecules such as nucleic acids and proteins.This study may provide a foundation for the harmless control of spoilage bacteria in edible mushroom.

Key words：citric acid; spoilage bacteria; bacteriostasis model

0引言

食用菌組織鮮嫩，具有很高的食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受消費(fèi)者的喜愛(ài).然而食用菌采后極易受微生物的侵染，特別是致腐細(xì)菌，從而出現(xiàn)褐變、軟化、產(chǎn)生異味等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，降低其商業(yè)價(jià)值.食用菌貨架期細(xì)菌大量生長(zhǎng)繁殖，如金針菇的外源細(xì)菌數(shù)量5天內(nèi)便達(dá)到1.8×10⁸CFU/g［1］.食用菌采后細(xì)菌類群包含成百上千個(gè)屬，其中僅有少數(shù)屬被認(rèn)為是優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌，如腸桿菌［2，3］、寡養(yǎng)單胞菌［4，5］、假單胞菌［6］、美洲愛(ài)文菌（Ewingella americana）［7］、芽孢桿菌［8］等.

腸桿菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬細(xì)菌是食用菌貨架期外源細(xì)菌中相對(duì)豐度較高的兩類腐敗細(xì)菌，可引起金針菇、雙孢蘑菇、杏鮑菇、草菇等食用菌的腐?。?，7，9，10］.這兩種細(xì)菌不僅是食用菌的致腐細(xì)菌，也是一些水果、蔬菜的病原菌，如甜瓜［11］、黃豆芽［12］等.其中，腸桿菌是部分食品貯藏期間的主要優(yōu)勢(shì)菌，如鮮濕米粉［13］、豆制品［14］、豬肉［15］等，還可引起魔芋軟腐病［16］、馬鈴薯葉片枯萎［17］、桑細(xì)菌性枯萎病［18］等.寡養(yǎng)單胞菌屬是一類革蘭氏陰性好氧菌群，最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃～37 ℃，廣泛分布于臨床標(biāo)本、植物根系、土壤、動(dòng)物食品等，是引起人和水稻等經(jīng)濟(jì)作物感染的條件致病菌［19］.鑒于這兩類菌的致腐性和致病性，亟待尋找和制定有效控制這兩種細(xì)菌在食用菌上生長(zhǎng)繁殖的策略.

檸檬酸是從檸檬、柑橘等水果中提取的一種弱有機(jī)酸，通?？勺鳛樗嵛秳┖鸵志鷦┰谑称分刑砑邮褂?，具有無(wú)臭、無(wú)毒害、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn).檸檬酸對(duì)一些常見(jiàn)的食源性病原菌有較強(qiáng)的抑制作用.采用0.5%檸檬酸可顯著抑制大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)［20］.使用0.5%檸檬酸溶液攪拌清洗甜櫻桃，可有效將沙門氏菌的菌落濃度降低至10 CFU/mL，幾乎達(dá)到最低檢出菌落數(shù)［21］.檸檬酸的抑菌效果還具有持續(xù)性的優(yōu)勢(shì)，檸檬酸對(duì)常見(jiàn)水產(chǎn)病原菌嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌的持續(xù)抑菌作用可達(dá)6天［22］.因此，檸檬酸在食用菌致腐菌防治方面具有很大的潛力.

目前，生產(chǎn)中食用菌鮮品的保鮮方法包括低溫保鮮和化學(xué)保鮮，但保鮮效果欠佳，對(duì)采后致腐菌的抑制針對(duì)性較弱，且化學(xué)保鮮劑可能產(chǎn)生對(duì)人體有害的化學(xué)殘留.因此，本研究探究檸檬酸對(duì)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的抑制效果，通過(guò)構(gòu)建時(shí)間-抑菌模型預(yù)測(cè)檸檬酸的抑菌特性；進(jìn)而從細(xì)胞膜通透性和完整性方面探究檸檬酸對(duì)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的抑菌機(jī)制，最后通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化.本研究旨在探索一種安全、高效的采后食用菌致腐菌的防治方法.

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要試劑

檸檬酸、DMSO（上海源葉生物科技有限公司）；蛋白胨、酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；氯化鈉、無(wú)水乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）、PBS（pH 7.2-7.4，陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司）、戊二醛固定液（2.5%，上海麥克林生化科技有限公司）、叔丁醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），上述試劑均為分析純及生化試劑.

1.1.2菌株與培養(yǎng)基

腸桿菌屬（Enterobacter sp.）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）細(xì)菌：均分離于采收后食用菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后，保存于陜西科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室.

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，氯化鈉1.0%，pH 7.0.

1.1.3主要設(shè)備

DDS-307型電導(dǎo)率儀（上海佑科儀器儀表有限公司）；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；SP-756PC紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；CTFD-10S型冷凍干燥機(jī)（青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司）；高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（美國(guó)FEI）.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1制備菌液和檸檬酸母液

將腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌接種于液體LB培養(yǎng)基，33 ℃、150 rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，PBS洗滌3次后重懸菌體備用.

將檸檬酸溶解于DMSO，配制成1 M檸檬酸-DMSO母液備用.

后續(xù)每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，并以未加檸檬酸的菌液為對(duì)照組.

1.2.2檸檬酸的抑菌作用

（1）檸檬酸抑菌圈的測(cè)定

將適量菌液加入冷卻至50 ℃左右的無(wú)菌LB固體培養(yǎng)基，混合均勻后傾注平板，凝固后往牛津杯中注入200 mM檸檬酸-DMSO溶液，以DMSO為對(duì)照.33 ℃培養(yǎng)18 h后，觀察是否出現(xiàn)透明抑菌圈并測(cè)量直徑.

（2）檸檬酸最小抑菌濃度的測(cè)定

無(wú)菌96孔板上設(shè)置LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照、腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌菌液作為陰性對(duì)照.并采用倍比稀釋法使菌液中檸檬酸終濃度分別為100 mM、50 mM、25 mM、12.5 mM、6.25 mM、3.13 mM、1.57 mM、0.78 mM.在33 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后采用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀測(cè)OD600，依據(jù)公式（1）計(jì)算抑菌率并判斷檸檬酸的最小抑菌濃度.

抑菌率=對(duì)照組-處理組/對(duì)照組×100%（1）

1.2.3檸檬酸時(shí)間-殺菌曲線的測(cè)定

取2 mL腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌菌液轉(zhuǎn)移至小試管中，分別加入檸檬酸母液使各管終濃度為兩種菌的0.5 MIC、MIC、2 MIC值.33 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h處取樣，測(cè)OD₆₀₀.

1.2.4檸檬酸對(duì)菌液電導(dǎo)率的影響

將腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌菌液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌生理鹽水中，分別加入檸檬酸使其終濃度為兩種菌的0.5 MIC、MIC、2 MIC值.33 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h處取樣，8 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)電導(dǎo)率.

1.2.5菌體紫外吸收物的滲透檢測(cè)

將腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌菌液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌PBS中，加入檸檬酸使其終濃度為兩種菌的MIC值.33 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，于0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h時(shí)取樣，4 000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾器過(guò)濾上清液，檢測(cè)上清液在260 nm、280 nm 處的吸光度.

1.2.6檸檬酸對(duì)細(xì)菌菌體形態(tài)的影響

分別取培養(yǎng)至2 h和24 h的MIC檸檬酸處理組的腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌菌液，離心收集菌體，PBS洗滌3次.2.5%戊二醛溶液固定2 h后，依次用30%，50%，70%，90%，100%乙醇梯度脫水，再用純叔丁醇置換酒精3次，最后將細(xì)菌-叔丁醇混合液冷凍干燥，噴金，在掃描電鏡下觀察細(xì)菌的菌體形態(tài).

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.p≤0.05代表有顯著差異；p≤0.01代表有高度顯著差異；p≤0.001代表有極顯著差異.用Origin Pro 2018通過(guò)Logistic方程對(duì)檸檬酸的時(shí)間-抑菌曲線進(jìn)行非線性擬合，并建立模型.Logistic方程如式（2）所示，Gd為相對(duì)生長(zhǎng)下降百分比，a為Gd最大值，k為相對(duì)生長(zhǎng)速率，xc為曲線拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)x值.如式（3）和（4）所示，μmax代表Gd的最大比增長(zhǎng)速率，c代表檸檬酸抑菌的延滯時(shí)間.

2結(jié)果與討論

2.1檸檬酸的抑菌作用

2.1.1檸檬酸的抑菌圈直徑

檸檬酸對(duì)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌具有一定的抑制作用.經(jīng)200 mM檸檬酸處理18 h，腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的培養(yǎng)皿均出現(xiàn)明顯抑菌圈，直徑分別為1.57±0.03 cm，1.93±0.03 cm（圖1），極顯著大于對(duì)照組（p＜0.001）.檸檬酸對(duì)寡養(yǎng)單胞菌的抑制作用極顯著大于對(duì)腸桿菌的抑制作用（p＜0.001），且培養(yǎng)過(guò)程中抑菌圈最大可達(dá)到2.47±0.03 cm.

2.1.2檸檬酸的最小抑菌濃度

MIC60是指檸檬酸對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到60%時(shí)的最低濃度.檸檬酸對(duì)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的MIC60分別為100 mM和50 mM（圖2），說(shuō)明寡養(yǎng)單胞菌對(duì)檸檬酸的處理更敏感.

2.1.3檸檬酸時(shí)間-抑菌模型的建立

作用時(shí)間越久，檸檬酸抑制腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌所需的延滯時(shí)間越短，抑制效果越明顯（圖3）.根據(jù)Logistic方程建立的時(shí)間-抑菌模型中，100 mM檸檬酸抑制腸桿菌的最高相對(duì)生長(zhǎng)下降百分比為36.93±1.58%，延滯時(shí)間為3.83 h，最大比增長(zhǎng)速率為0.04 mM-1，模型方程為Gd=36.93/（1+exp（-0.29×（x-7.27））（圖3（a））.50 mM檸檬酸抑制寡養(yǎng)單胞菌的最高相對(duì)生長(zhǎng)下降百分比為80.37±3.96%，延滯時(shí)間分別為1.89 h，最大比增長(zhǎng)速率為0.08 mM-1，模型方程為Gd=80.37/（1+exp（-0.26×（x-5.77）））（圖3（b））.上述模型的R2均大于94%，說(shuō)明擬合效果良好（表1）.其中，25 mM檸檬酸抑制寡養(yǎng)單胞菌的效果欠佳，12 h后抑菌效果逐漸降低，導(dǎo)致其時(shí)間-抑菌曲線不符合傳統(tǒng)的微生物“S”型生長(zhǎng)曲線，因此沒(méi)有選擇該濃度建立模型.

2.2檸檬酸的抑菌機(jī)理

2.2.1檸檬酸對(duì)菌液電導(dǎo)率的影響

菌液電導(dǎo)率與檸檬酸的作用濃度呈正相關(guān)，且具有時(shí)間依賴性（圖4）.濃度越大，菌液的電導(dǎo)率越大，細(xì)胞膜的通透性越大.200 mM檸檬酸處理6 h后，腸桿菌菌液的電導(dǎo)率最高達(dá)6.07±0.01 ms/cm，極顯著高于0 h電導(dǎo)率（p≤0.001），說(shuō)明6 h后，腸桿菌細(xì)胞膜通透性顯著提高.而50 mM檸檬酸處理組12 h后電導(dǎo)率才達(dá)到最高，僅為4.93±0.01 ms/cm，明顯低于200 mM檸檬酸處理組（圖4（a））.寡養(yǎng)單胞菌菌液的電導(dǎo)率變化情況和腸桿菌基本一致（圖4（b））.有機(jī)酸通常可以降低環(huán)境pH、破壞滲透壓、造成細(xì)胞膜損傷，從而抑制或殺死病原菌.細(xì)胞膜發(fā)生損傷后，胞內(nèi)Na⁺、K⁺等電解質(zhì)大量外流，體系電導(dǎo)率升高，細(xì)胞膜通透性增大.

2.2.2檸檬酸對(duì)菌體紫外吸收滲透的影響

260 nm和280 nm分別是核酸和蛋白質(zhì)的最大吸收峰，因此可通過(guò)OD260和OD280來(lái)表征胞外核酸和蛋白質(zhì)的泄露情況.腸桿菌的核酸、蛋白質(zhì)泄露量明顯多于寡養(yǎng)單胞菌，而泄露量顯著增大的時(shí)間晚于寡養(yǎng)單胞菌（圖5）.經(jīng)檸檬酸處理2 h后，腸桿菌的核酸泄露量迅速增大，且顯著大于0 h，最大增至0.065±0.001.4 h后腸桿菌的蛋白泄漏量才開始迅速增大，6 h時(shí)達(dá)到最大0.046±0.001（圖5（a））.對(duì)寡養(yǎng)單胞菌，0.5 h時(shí)核酸泄漏量已經(jīng)顯著大于0 h，4 h時(shí)達(dá)到最大0.036±0；蛋白泄漏量在6 h時(shí)達(dá)到最大0.023±0（圖5（b））.細(xì)胞膜受損后，完整性被破壞，胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等大分子隨之泄露到胞外.

2.2.3檸檬酸對(duì)菌體細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組的腸桿菌呈短桿狀，菌體表面光滑完整（圖6（a））.經(jīng)100 mM檸檬酸處理，2 h后腸桿菌部分菌體表面出現(xiàn)褶皺（圖6（c）），24 h后大部分菌體表面凹凸不平，菌體不再光滑飽滿，出現(xiàn)塌陷（圖6（e））.對(duì)照組的寡養(yǎng)單胞菌呈長(zhǎng)桿狀，菌體光滑完整（圖6（b））.經(jīng)50 mM檸檬酸處理，2 h后寡養(yǎng)單胞菌部分菌體表面凹凸不平（圖6（d）），24 h后幾乎所有菌體表面粗糙，出現(xiàn)褶皺、彎曲，并明顯發(fā)生破損（圖6（f））.通過(guò)高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡可以直觀地觀察到檸檬酸處理破壞了菌體形態(tài).這與上述菌液電導(dǎo)率和胞外核酸、蛋白質(zhì)泄露情況的結(jié)果一致，證明檸檬酸處理改變了細(xì)胞膜通透性和完整性，破壞了菌體形態(tài).

3結(jié)論

檸檬酸對(duì)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌具有一定的抑制作用.在最小抑菌濃度下，根據(jù)Logistic方程建立的時(shí)間-抑菌模型預(yù)測(cè)腸桿菌和寡養(yǎng)單胞菌的最高相對(duì)生長(zhǎng)下降比分別為36.93±1.58%和80.37±3.96%.檸檬酸通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性、完整性導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，胞內(nèi)電解質(zhì)外流，核酸、蛋白質(zhì)等大分子外泄，抑制菌體生長(zhǎng)甚至死亡.本研究為檸檬酸安全防治食用菌致腐菌的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐，為開發(fā)食用菌天然保鮮劑奠定理論基礎(chǔ).本文抑菌機(jī)制的研究重點(diǎn)關(guān)注了檸檬酸對(duì)腐敗菌細(xì)胞膜的影響，后續(xù)可以從細(xì)胞壁、能量代謝、蛋白質(zhì)合成等方面全面探究檸檬酸的抑菌機(jī)制.

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