低劑量電離輻射誘導(dǎo)眼晶狀體上皮細(xì)胞中差異mRNA表達(dá)譜的鑒定

王萍　范莉　陸雪等

關(guān)鍵詞：低劑量電離輻射;眼晶狀體渾濁;生物信息學(xué);增殖

中圖分類(lèi)號(hào)：Q345 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

眼晶狀體一直被認(rèn)為是對(duì)輻射最敏感組織之一，流行病學(xué)對(duì)輻射誘導(dǎo)眼晶狀體混濁的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期受到低劑量輻射的人群，比如核工業(yè)工作者[1] 、醫(yī)院介入心臟病學(xué)家[2] 、X 射線工作者[3] 、宇航員和飛行員[4] 等，會(huì)增加眼晶狀體混濁的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)， 且大多發(fā)生在皮質(zhì)或者后囊下。2011 年，主要基于流行病學(xué)的研究結(jié)果，國(guó)際放射防護(hù)委員會(huì)（ ICRP） 推薦眼晶狀體劑量閾值為0. 5 Gy。然而，近年美國(guó)關(guān)于放射技術(shù)人員的隊(duì)列研究結(jié)果顯示，低劑量（<0. 1 Gy） 和低劑量率（通常<0. 005 Gy/ h）照射后白內(nèi)障發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[5] 。我國(guó)在陽(yáng)江高本底地區(qū)居民的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)眼晶狀體累積劑量達(dá)0. 1 Gy 時(shí)，患皮質(zhì)及后囊下渾濁的風(fēng)險(xiǎn)升高，且發(fā)生皮質(zhì)性渾濁的劑量閾值估值為0. 14 Gy[6] 。這提示對(duì)于容易接觸低劑量輻射的人群，誘導(dǎo)晶狀體渾濁的劑量限值可能要比ICRP 推薦的0. 5 Gy 低。但是，低劑量電離輻射誘導(dǎo)眼晶狀體渾濁的機(jī)制目前還未完全了解，只提出了一些潛在的途徑，包括氧化應(yīng)激或電離輻射誘導(dǎo)的DNA 損傷可能修復(fù)緩慢[7] ，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化異常;DNA 損傷與修復(fù)可能存在逆劑量率效應(yīng)[8-9] ;端粒長(zhǎng)度增加和端粒酶活性降低等也可能與白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)[10-11] 以及遺傳背景不同會(huì)顯著改變低劑量電離輻射誘導(dǎo)白內(nèi)障的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等[12-14] 。相比于低劑量， 較高劑量（>2 Gy）輻射誘導(dǎo)白內(nèi)障的機(jī)制已經(jīng)比較明確，主要是晶狀體上皮細(xì)胞基因組損傷，包括氧化應(yīng)激、DNA 損傷、細(xì)胞間通訊、細(xì)胞極性改變等[15] 。為此，我們首先通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)低劑量（0. 2 Gy）和較高劑量（2 Gy）γ 射線照射人晶狀體上皮細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜和相關(guān)分子通路進(jìn)行分析，并對(duì)與細(xì)胞增殖相關(guān)的PIM1、HMGB1、BRE 和JUN差異表達(dá)基因進(jìn)行初步驗(yàn)證，為進(jìn)一步探索差異表達(dá)基因在晶狀體上皮細(xì)胞中的功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于揭示低劑量電離輻射誘導(dǎo)眼晶狀體渾濁的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞培養(yǎng)、照射及樣本收集

正常人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/ 04 培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基（ HyClone，SH30024. 01）或含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，C11965500BT）中，正常人晶狀體上皮細(xì)胞HLE-B3 培養(yǎng)在含10%胎牛血清的EMEM 培養(yǎng)基（ATCC，80615210）中，培養(yǎng)條件為飽和濕度、37 ℃ 、5%CO₂的培養(yǎng)箱。待SRA01/ 04 細(xì)胞長(zhǎng)至80% 融合，分別進(jìn)行0. 2 Gy¹³⁷Cs 和2 Gy⁶⁰Co γ射線照射，其中0. 2 Gy 劑量率為9. 73 mGy/ min，2 Gy 劑量率為1 Gy/ min，照射后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞， 用預(yù)冷的PBS 洗一遍， 加1 mLTrizol 裂解，置于-80 ℃ 冰箱保存，用于基因芯片分析。采用相同劑量率對(duì)SRA01/ 04 和HLE-B3兩種細(xì)胞分別進(jìn)行0、0. 05、0. 075、0. 1、0. 2、0. 5Gy¹³⁷Cs γ 射線照射和2 Gy⁶⁰Co γ 射線照射，照射后24 h、48 h 收集細(xì)胞，用于驗(yàn)證及分析不同劑量照射后不同時(shí)間晶狀體上皮細(xì)胞差異基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1. 2 總RNA 提取

細(xì)胞加Trizol 充分裂解后，加入200 μL 三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2 ～ 3 min，于4 ℃ ，12 000 rpm 離心15 min;將上層水相吸至新EP 管中，再加入等體積異丙醇，輕輕混勻后室溫靜置10min，4 ℃ ，12 000 rpm 離心10 min，留底部白色沉淀，加入700 μL 無(wú)水乙醇、200 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水，7 500 rpm 離心5 min，留底部沉淀，適當(dāng)風(fēng)干， 加入20 ～ 30 μL DEPC 水， 得到RNA溶液。

1. 3 mRNA 芯片分析

采用Affymetrix 芯片進(jìn)行分析（北京中康博生物科技有限公司）。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：樣本總RNA通過(guò)質(zhì)控后，依次進(jìn)行Poly A 加尾、片段化標(biāo)記、芯片雜交、芯片洗染、掃描等過(guò)程。使用GeneChip3000 7G 掃描儀捕獲熒光信號(hào)，并通過(guò)GCOS 軟件將信號(hào)轉(zhuǎn)化，從而獲得每個(gè)探針的信號(hào)值，生成CEL 文件，進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，篩選變化倍數(shù)大于2（FC>2）的差異表達(dá)基因。

1. 4 mRNA 功能的生物信息學(xué)分析

利用基因本體學(xué)（Gene Ontology， GO）數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組大百科全書(shū) （ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG） 對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能和信號(hào)通路的顯著性分析。

1. 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ Real-time PCR） 檢測(cè)

采用PrimeScript RT reagent Kit With gDNAEraser（ 日本TaKaRa） 將樣本總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用ABI7500 快速實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)檢測(cè)mRNA 表達(dá)量。以GAPDH 作為內(nèi)源性內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化處理，以2^-ΔΔCT法計(jì)算照射組與未照射組間mRNA 表達(dá)水平的變化。所有樣品檢測(cè)均設(shè)置3 個(gè)平行樣，至少重復(fù)3 次。PCR 引物列于表1。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。在數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性條件下，多組之間比較使用方差分析，若方差不齊選擇秩和檢驗(yàn)。p<0. 05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同劑量γ 射線照射SRA01 / 04 細(xì)胞后差異表達(dá)基因及生物學(xué)功能與通路分析

通過(guò)芯片分析篩選出了高、低劑量照射后48 h 變化倍數(shù)大于2 的基因，各照射組之間相互比較篩選出的共同表達(dá)的基因和單獨(dú)表達(dá)的基因如圖1 所示。發(fā)現(xiàn)較高劑量（2 Gy）照射后差異表達(dá)基因要比0. 2 Gy 照射后基因數(shù)增多，2 Gy 照射后差異表達(dá)基因共3 970 個(gè)，1 960 個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 010 個(gè)表達(dá)下調(diào)，單獨(dú)表達(dá)的基因1 495 個(gè);而0. 2 Gy 照射后差異表達(dá)基因共3 304 個(gè)，1 640 個(gè)表達(dá)上調(diào)，1 664 個(gè)表達(dá)下調(diào)，單獨(dú)表達(dá)的基因1 144 個(gè);此外，0. 2 Gy 與2 Gy 相比共有3 690 個(gè)差異表達(dá)基因，1 862 個(gè)表達(dá)上調(diào)，1 828 個(gè)表達(dá)下調(diào)，單獨(dú)表達(dá)的基因1 285 個(gè)。

圖2 和圖3 分別給出了不同比較組差異表達(dá)基因的GO 生物過(guò)程通路和KEGG 功能通路的生物信息學(xué)分析結(jié)果。首先是0. 2 Gy 與0 Gy 比較組，GO 生物過(guò)程通路按統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性排前三位的分別是線粒體的電子傳遞鏈、中性粒細(xì)胞脫顆粒、細(xì)胞死亡調(diào)控，差異基因主要聚集在細(xì)胞分裂、細(xì)胞粘附等過(guò)程，KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)p <0. 01 的信號(hào)通路有氧化磷酸化、DNA 復(fù)制、衰老等;0. 2 Gy與2 Gy 比較組，GO 生物過(guò)程通路按統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性排前三位的分別是細(xì)胞粘附、細(xì)胞死亡調(diào)控、中性粒細(xì)胞脫顆粒，差異基因主要聚集在細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂過(guò)程，KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)p<0. 01 的信號(hào)通路有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、緊密連接等，其他還有細(xì)胞周期、氧化磷酸化、錯(cuò)誤修復(fù)、粘附連接等;2 Gy 與0 Gy 比較組，GO 生物過(guò)程通路按統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性排前三位的分別是線粒體的電子傳遞鏈、細(xì)胞分裂、mRNA 剪接，差異基因主要聚集在細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附以及有絲分裂細(xì)胞周期G1 -S 期轉(zhuǎn)換過(guò)程，KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)p<0. 01 的信號(hào)通路有氧化磷酸化、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、緊密連接等，其他還有TGF-β 信號(hào)通路等。

2. 2 高、低劑量照射SRA01 / 04 細(xì)胞后基因表達(dá)差異

為了探究低劑量電離輻射誘導(dǎo)眼晶狀體渾濁的分子機(jī)制，并與高劑量電離輻射誘導(dǎo)白內(nèi)障的機(jī)制比較異同，我們將重點(diǎn)分析0. 2 Gy 與0 Gy 比較組和0. 2 Gy 與2 Gy 比較組的差異表達(dá)基因。GO 生物過(guò)程和KEGG 結(jié)果表明，0. 2 Gy 與未照射（0 Gy）和較高劑量（2 Gy）相比，相同之處可能在于差異表達(dá)基因都與細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附這一生物過(guò)程相關(guān)。細(xì)胞增殖、粘附相關(guān)的差異表達(dá)上調(diào)的基因（FC>2）見(jiàn)表2、表3，基因表達(dá)的熱圖分析見(jiàn)圖4。0. 2 Gy 照射后，差異基因變化倍數(shù)最高的前三位分別是原癌基因PIM1、促炎因子IL-1β和編碼抗凋亡蛋白的BRE，0. 2 Gy 與2 Gy 相比，差異基因變化倍數(shù)最高的前三位分別是編碼抗凋亡蛋白的BRE、促炎因子IL-18 和DNA 修復(fù)酶XRCC6，兩比較組相同的基因?yàn)椋築RE、JUN、IL -1β、GADD45A、S100A7A。

2. 3 Real-time PCR 驗(yàn)證差異表達(dá)的基因

選擇0. 2 Gy 照射后表達(dá)水平顯著上調(diào)的基因，以及在0. 2 Gy 與0 Gy 和0. 2 Gy 與2 Gy 比較組中表達(dá)水平都顯著上調(diào)的基因（ PIM1、BRE、JUN）進(jìn)行Real-tiem PCR 驗(yàn)證，并且在0. 2 Gy 照射后表達(dá)水平下調(diào)的基因中也選擇了一個(gè)差異倍數(shù)變化4. 659 倍且與細(xì)胞增殖相關(guān)的HMGB1 基因。SRA01/ 04 細(xì)胞和HLE-B3 細(xì)胞分別經(jīng)不同劑量（0、0. 05、0. 075、0. 1、0. 2、0. 5 和2 Gy）γ 射線照射后24 h、48 h，利用Real-time PCR 檢測(cè)差異基因表達(dá)變化。相比于保持著穩(wěn)定的上皮細(xì)胞極性的SRA01/ 04 細(xì)胞，HLE-B3 細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)中，不僅具有細(xì)胞增殖能力，還保持著穩(wěn)定分化能力。

結(jié)果顯示，SRA01/ 04 細(xì)胞中（圖5），PIM1 的表達(dá)量在照射后24 h，大部分低劑量組相比于未照射組表達(dá)水平都顯著升高（ p < 0. 05）;照射后48 h，相比于未照射組，0. 05 Gy 和0. 1 Gy 照射組表達(dá)水平顯著升高（p<0. 05），較高劑量（2 Gy） 組表達(dá)水平顯著下降（p <0. 05）。HMGB1 表達(dá)量在照射后24 h、48 h，相比于未照射組，某些低劑量點(diǎn)有升高趨勢(shì)，其中0. 075 Gy 照射后24 h，HMGB1表達(dá)水平顯著升高（p<0. 05），而2 Gy 照射后表達(dá)水平顯著下降（p <0. 05）。BRE 的表達(dá)水平在低劑量照射后24 h 有隨劑量升高而升高的趨勢(shì)，到較高劑量點(diǎn)（2 Gy） 表達(dá)回到基線水平;照射后48 h，低劑量組相比于未照射組表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，2 Gy 組表達(dá)水平顯著下降（p <0. 05）。JUN的表達(dá)量在0. 05 Gy、0. 075 Gy 照射后24 h 升高，2 Gy 照射后顯著升高（ p < 0. 05），其余低劑量組JUN 的表達(dá)水平都顯著下降（ p < 0. 05）;照射后48 h，表達(dá)量變化與基因芯片分析結(jié)果相反。HLE-B3 細(xì)胞中（ 圖6）， PIM1 的表達(dá)變化與SRA01/ 04 細(xì)胞中表達(dá)趨勢(shì)基本一致，但表達(dá)水平升高不顯著（p >0. 05）。HMGB1 的表達(dá)量在照射后24 h 表現(xiàn)為隨劑量升高而升高，照射后48 h 大部分低劑量組相比于未照射組表達(dá)水平也有升高趨勢(shì)。BRE 的表達(dá)量在低劑量照射后24 h 和0. 05 Gy、0. 075 Gy 照射后48 h，與未照射組相比表達(dá)水平顯著升高（p <0. 05）。JUN 的表達(dá)量在0. 075 Gy、0. 2 Gy 和2 Gy 照射后48 h 顯著升高（p<0. 05），其余時(shí)間點(diǎn)和劑量點(diǎn)未見(jiàn)明顯變化。綜上， 在遺傳背景不同的兩種細(xì)胞中， PIM1、HMGB1、BRE 在低劑量電離輻射照射后劑量響應(yīng)比較好，照射后24 h，大部分低劑量組相比于未照射組表達(dá)水平明顯升高，48 h 仍然有升高趨勢(shì)，但在某些低劑量組升高不顯著，并且這三個(gè)基因在SRA01/ 04 細(xì)胞2 Gy 照射后48 h，表達(dá)水平顯著下降，在HLE-B3 細(xì)胞中也有表達(dá)水平下降趨勢(shì)。這提示低劑量電離輻射作用于眼晶狀體可以誘導(dǎo)某些與刺激細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)的基因表達(dá)升高，可能與低劑量電離輻射誘導(dǎo)晶狀體渾濁有關(guān)。

3 討論

隨著流行病學(xué)隨訪調(diào)查的更加系統(tǒng)全面、更準(zhǔn)確的照射劑量測(cè)量方法以及新診斷技術(shù)的發(fā)展，研究結(jié)果均表明急性和長(zhǎng)期受到低劑量輻射的人群發(fā)生眼晶狀體渾濁的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，ICRP 在2011 年大幅降低了晶狀體的劑量閾值至0. 5 Gy（原為2 Gy），對(duì)于職業(yè)照射，每年的晶狀體當(dāng)量劑量限值也從原來(lái)150 mSv 大幅降低至20mSv，且連續(xù)5 年內(nèi)任何一年都不能超過(guò)50mSv[16] 。新建議的提出也影響了對(duì)低劑量電離輻射如何導(dǎo)致晶狀體渾濁的機(jī)制研究。

Hamada[17] 提出眼晶狀體細(xì)胞不一定對(duì)細(xì)胞死亡具有輻射敏感性，其對(duì)輻射的敏感性可能與上皮細(xì)胞過(guò)度增殖、纖維細(xì)胞異常分化、DNA 雙鏈斷裂修復(fù)不當(dāng)或緩慢、端粒效應(yīng)、衰老、晶狀體蛋白改變、非靶向效應(yīng)、炎癥以及遺傳因素有關(guān)。對(duì)于易受低劑量輻射的人群，誘導(dǎo)晶狀體渾濁的劑量限值可能要比ICRP 推薦的0. 5 Gy 更低，低劑量電離輻射誘發(fā)晶狀體渾濁的分子機(jī)制可能與高劑量不同。體內(nèi)研究表明，低劑量尤其是0. 1 Gy、0. 25 Gy X 射線照射后24 h，小鼠晶狀體外周區(qū)細(xì)胞密度和增殖明顯增加，cyclin D1 的表達(dá)水平也升高，而高劑量1 Gy 和2 Gy 照射后cyclin D1 的表達(dá)水平顯著降低[18] 。Vigneux 等[19] 研究發(fā)現(xiàn)，HLE-B3 細(xì)胞受0. 25 Gy X 射線照射后7 天，細(xì)胞增殖和遷移能力顯著增強(qiáng)， 而較高劑量（0. 5 ～2 Gy）時(shí)回落到未照射水平，且高于0. 25 Gy 照射后細(xì)胞粘附能力持續(xù)降低。有研究也發(fā)現(xiàn)小于0. 5 Gy 的X 射線照射人晶狀體上皮細(xì)胞，活性氧和活性氮的生成略有降低、細(xì)胞活力增強(qiáng)、細(xì)胞增殖能力也增強(qiáng)，而大于0. 5 Gy 照射后，產(chǎn)生了大量的活性氧和活性氮、細(xì)胞活力降低，表明了低劑量電離輻射可以激活抗氧化機(jī)制，有效清除活性氧，而較高劑量照射下，過(guò)量的活性氧可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡并誘發(fā)白內(nèi)障[20] 。

本文篩選了高、低劑量照射眼晶狀體上皮細(xì)胞后差異表達(dá)基因，并進(jìn)行GO 生物過(guò)程和KEGG分析。GO 生物過(guò)程表明，0. 2 Gy 照射后，差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞分裂、細(xì)胞死亡調(diào)控、細(xì)胞粘附等方面;0. 2 Gy 與2 Gy 相比，差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡調(diào)控等方面;2 Gy 照射后，差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、有絲分裂細(xì)胞周期G1 -S 期轉(zhuǎn)換、細(xì)胞粘附等方面。同樣， KEGG 分析也表明，0. 2 Gy 照射后，差異基因顯著富集的信號(hào)通路是氧化磷酸化、與炎癥相關(guān)的IL-17 信號(hào)通路、與衰老相關(guān)的信號(hào)通路、DNA 復(fù)制以及與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的MAPK 信號(hào)通路等;0. 2 Gy 與2 Gy 相比，差異基因顯著富集的信號(hào)通路除氧化磷酸化外，還有與細(xì)胞粘附相關(guān)的粘附連接和緊密連接、細(xì)胞周期、錯(cuò)配修復(fù)等;2 Gy 照射后，差異基因顯著富集的信號(hào)通路是氧化磷酸化、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、緊密連接、TGF-β 信號(hào)通路等。綜上表明電離輻射誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞功能改變?cè)谘趸姿峄?、?xì)胞增殖、細(xì)胞粘附等方面與正常晶狀體上皮細(xì)胞相比有顯著差別。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，低劑量電離輻射照射晶狀體上皮細(xì)胞后與較高劑量照射后相比，KEGG 分析顯示差異表達(dá)基因在錯(cuò)配修復(fù)通路中顯著富集，這提示低劑量電離輻射引起晶狀體上皮細(xì)胞DNA 損傷后修復(fù)可能不當(dāng)，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，低能X 射線照射小鼠頭部，72 h 后仍能在晶狀體細(xì)胞核中檢測(cè)到大量的DNA 氧化損傷標(biāo)志物8-OHG 以及DNA 單鏈修復(fù)蛋白XRCC1，隨后幾個(gè)月觀察到上皮細(xì)胞異常遷移到內(nèi)部，表明初始細(xì)胞DNA 損傷遺傳給子細(xì)胞并引起細(xì)胞異常行為，導(dǎo)致白內(nèi)障[21] 。Ahmadi 等人[7] 用低劑量（ <0. 5 Gy） γ 射線照射人晶狀體上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)照射后24 h DNA損傷仍然存在，作者推測(cè)這種持續(xù)未修復(fù)的損傷可能導(dǎo)致基因組突變，傳遞給子細(xì)胞，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定并發(fā)生白內(nèi)障。

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選了可能與低劑量電離輻射誘導(dǎo)眼晶狀體渾濁發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，對(duì)其中與細(xì)胞增殖相關(guān)的候選基因PIM1、HMGB1、BRE 和JUN 進(jìn)行了初步驗(yàn)證。兩種人晶狀體上皮細(xì)胞受不同低劑量照射后， 細(xì)胞內(nèi)PIM1、HMGB1 和BRE 基因發(fā)生不同程度的表達(dá)水平升高變化。我們觀察到HMGB1 在兩種細(xì)胞中表達(dá)水平的變化趨勢(shì)不太一致，在SRA01/ 04 細(xì)胞中，HMGB1 只在0. 075 Gy 照射后24 h 表達(dá)水平顯著升高，2 Gy 照射后表達(dá)水平顯著降低;而HLE-B3 細(xì)胞中，HMGB1 在0. 2、0. 5 和2 Gy 照射后24 h 以及0. 05 Gy 照射后48 h 表達(dá)水平顯著升高。這種差異可能是由于兩種細(xì)胞遺傳背景和細(xì)胞特性不同，對(duì)輻射敏感性也不同。遺傳背景在低劑量電離輻射誘導(dǎo)晶狀體渾濁中發(fā)揮著重要作用。體外研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同供體的HLE-B3 細(xì)胞和HLEC 細(xì)胞經(jīng)0. 1、0. 25 和0. 5 Gy （ 劑量率：0. 065 mGy/ min）照射后1 h，HLE-B3 細(xì)胞活力在各劑量點(diǎn)顯著降低，而HLEC 細(xì)胞只在0. 5 Gy 照射后細(xì)胞活力降低， 表明HLE-B3 細(xì)胞相比于HLEC 細(xì)胞對(duì)輻射更加敏感[7] 。

在其他細(xì)胞類(lèi)型，PIM1 在視網(wǎng)膜中過(guò)表達(dá)可激活Stat3、Akt1 和Akt2 通路，并通過(guò)線粒體通路抑制神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損視神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[22] 。此外，PIM1 在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)升高通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)大多數(shù)細(xì)胞阻滯于S期和G_2?/ M 期， 促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活[23] 。Mohammad 等人[24] 研究表明，HMGB1 在人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)MMP-9 表達(dá)上升，細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)，促進(jìn)血管生成。BRE基因主要在大腦和生殖器官中表達(dá)，在細(xì)胞存活、分化、凋亡和再生中發(fā)揮重要作用。Yeung 等人[25] 研究發(fā)現(xiàn)，BRE- / - 小鼠卵巢中卵泡數(shù)量變少，顆粒細(xì)胞增殖受到抑制，卵泡閉鎖增加，且γH2AX和與DNA 損傷相關(guān)基因的表達(dá)升高，表明卵巢中缺少BRE 基因表達(dá)會(huì)使DNA 損傷修復(fù)效率低，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度凋亡，進(jìn)而誘導(dǎo)閉鎖卵泡的形成。目前關(guān)于PIM1、HMGB1 或BRE 基因在眼晶狀體方面的功能研究很少。根據(jù)本研究結(jié)果，我們推測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)的PIM1、HMGB1、BRE 基因在低劑量電離輻射照射人晶狀體上皮細(xì)胞后表達(dá)水平的變化，可能與低劑量電離輻射誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞異常增殖和遷移密切相關(guān)。但仍需進(jìn)一步體內(nèi)、體外研究確定這些基因在晶狀體上皮細(xì)胞中的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究對(duì)較低劑量（0. 2 Gy） 和較高劑量（2 Gy）γ 射線照射人晶狀體上皮細(xì)胞后差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能和通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析和初步驗(yàn)證，為進(jìn)一步闡明低劑量電離輻射誘導(dǎo)晶狀體渾濁及白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制以及輻射防護(hù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和可能的分子靶點(diǎn)。