華蟾素對(duì)大鼠腹腔腸粘連影響機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

張好生 單連梅 孫汝萌 宮紅彥 王永 李強(qiáng) 金曉

[關(guān)鍵詞]華蟾素；腹腔腸粘連；大鼠；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；腫瘤壞死因子-α

腸粘連是外科手術(shù)后的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，常導(dǎo)致腸梗阻，嚴(yán)重危害患者的健康。其機(jī)制與組織缺血、損傷以及異物刺激引發(fā)的局部過(guò)度炎癥反應(yīng)有關(guān)，急性炎癥期滲出物如果不能充分溶解、吸收，成纖維母細(xì)胞便會(huì)產(chǎn)生膠原，膠原沉積導(dǎo)致腹腔內(nèi)永久性粘連[1-2]，腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、白介素等細(xì)胞因子在其中可能起重要的調(diào)節(jié)作用[3]，臨床上尚無(wú)理想的藥物預(yù)防腸粘連。華蟾素注射液是我國(guó)自行研制的，由中華大蟾蜍皮制成的水制劑，性質(zhì)穩(wěn)定，具有清熱解毒、利尿消腫、化結(jié)潰堅(jiān)作用，臨床常用于抗腫瘤的治療[4]。華蟾素能抑制血管通透性，減少炎性滲出[5]，在治療胸腹水方面取得了一定的療效[6]，華蟾素還可以保護(hù)胃腸道黏膜屏障，減緩黏膜的損傷，也可以抑制腹瀉和結(jié)腸炎等不良反應(yīng)[7-8]，據(jù)此推測(cè)，華蟾素的抗炎作用可能同樣適用于腹腔內(nèi)損傷，在術(shù)后防治腸粘連方面可能發(fā)揮一定的作用，經(jīng)文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)該方面的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)觀察華蟾素腹腔灌注對(duì)術(shù)后腹腔粘連的影響，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重220～250g，6周齡，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2014-0007。飼養(yǎng)期間給予大鼠無(wú)菌飼料飲用水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，批件編號(hào)：煙山倫準(zhǔn)2022048號(hào)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 華蟾素注射液（安徽華潤(rùn)金瞻藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z34020274）；透明質(zhì)酸鈉凝膠MSHG（上海建華精細(xì)生物制品有限公司，批號(hào)：18033012，規(guī)格：10mg/ml）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 主要儀器：AU480全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman公司）；HeraeusMultifugeXIR離心機(jī)（美國(guó)賽默飛）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 動(dòng)物分組 40只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（開(kāi)關(guān)腹組）、對(duì)照組（腸粘連模型對(duì)照組）、透明質(zhì)酸鈉組、華蟾素組，每組各10只。

1.2.2 制備腸粘連模型 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水12h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，神志消失后將大鼠仰臥固定于解剖盤(pán)內(nèi)，碘伏消毒胸腹部皮膚。下腹部正中長(zhǎng)2cm直切口進(jìn)腹，提出切口外確認(rèn)盲腸后，假手術(shù)組關(guān)腹。其余三組Ellis法制備大鼠腸粘連模型[9]，提出盲腸，鹽水紗布均勻摩擦漿膜面，損傷區(qū)域約1cm×2cm，摩擦至出現(xiàn)微小出血點(diǎn)為止，滴一滴無(wú)水乙醇于創(chuàng)面加重?fù)p傷，然后用血管夾夾閉盲腸系膜動(dòng)脈2min，造成局部缺血再灌注損傷。盲腸相對(duì)的腹壁上用手術(shù)刀刮出1cm×1cm大小的區(qū)域損傷面，滴一滴無(wú)水乙醇加重?fù)p傷。然后用3-0VCP772D可吸收線(xiàn)將盲腸與腹壁損傷面縫合一針固定，防止盲腸游移，確保粘連形成。關(guān)閉腹腔，分籠飼養(yǎng)（20℃～25℃）8d，正常飲食飲水。造模過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。

1.2.3 給藥 關(guān)閉腹腔后，假手術(shù)組和對(duì)照組5ml注射器腹腔內(nèi)注入生理鹽水5ml/kg[1]，連續(xù)3d腹腔注射同劑量的生理鹽水。透明質(zhì)酸鈉組和華蟾素組關(guān)閉腹腔后腹腔內(nèi)分別注入5ml/kg透明質(zhì)酸鈉和5ml/kg華蟾素[10]。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 觀察腹腔內(nèi)粘連形成情況 頸椎脫臼法處死大鼠，腹部“U”形切開(kāi)，觀察腹腔內(nèi)狀況。Nair[11]5級(jí)分類(lèi)法進(jìn)行粘連程度分級(jí)評(píng)分，即腹腔內(nèi)完全無(wú)粘連為0級(jí)；內(nèi)臟間或內(nèi)臟與腹壁間一條粘連帶為Ⅰ級(jí)；二條粘連帶為Ⅱ級(jí)；多于二條粘連帶，而內(nèi)臟未直接粘連到腹壁為Ⅲ級(jí)；內(nèi)臟直接粘連到腹壁，不管粘連帶多少均為Ⅳ級(jí)。

1.3.2 靜脈血TNF-α濃度和腹水TGF-β1濃度檢測(cè) 眼眶取血0.5ml，收集腹水0.2ml，分別于-80℃低溫保存，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)靜脈血TNF-α濃度和腹水TGF-β1濃度。

1.3.3 病理學(xué)檢測(cè) 取盲腸組織及其對(duì)側(cè)5mm×5mm腹膜和粘連組織，10%多聚甲醛固定。使用梯度乙醇脫水后，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。粘連纖維帶組織常規(guī)石蠟包埋、切片，Masson三色染色，光鏡下觀察纖維組織增生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。粘連程度分級(jí)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素對(duì)大鼠腸粘連的大體觀察

假手術(shù)組傷口周?chē)鸁o(wú)粘連或有微小粘連，粘連等級(jí)在0～Ⅰ級(jí)，以0級(jí)為主；對(duì)照組均發(fā)生粘連，且粘連帶多于兩條，少部分分離出血，粘連等級(jí)在Ⅲ～Ⅳ級(jí)，以Ⅲ級(jí)為主；透明質(zhì)酸鈉組粘連以1～2條粘連帶為主，等級(jí)以Ⅰ級(jí)為主，少部分為Ⅱ級(jí)；華蟾素組粘連數(shù)量少且不緊密，很容易分離，等級(jí)以Ⅰ級(jí)為主，部分為0級(jí)。華蟾素組與對(duì)照組比較，粘連明顯減輕，華蟾素組明顯優(yōu)于對(duì)照組。華蟾素組與透明質(zhì)酸鈉組比較，平均秩略微好一點(diǎn)，粘連減輕，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1和表1～2。

2.2 TGF-β1和TNF-α濃度比較

對(duì)照組與假手術(shù)組比較，TGF-β1及TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；透明質(zhì)酸鈉組與假手術(shù)組比較，TGF-β1及TNF-α升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；華蟾素組與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），華蟾素組與對(duì)照組比較，TGF-α1及TNF-α顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與透明質(zhì)酸鈉組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 粘連組織中炎癥程度和粘連程度的比較

光鏡下炎癥程度比較：假手術(shù)組炎癥損傷輕，光鏡下可見(jiàn)盲腸和腹膜間見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組粘連組織中可見(jiàn)纖維組織增生、大量急慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分呈彌漫性炎癥，可出現(xiàn)退行性變伴壞死；透明質(zhì)酸鈉組和華蟾素組可見(jiàn)少量纖維組織增生和部分變性，間質(zhì)中可見(jiàn)中等量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶見(jiàn)多核巨細(xì)胞反應(yīng)。華蟾素組與透明質(zhì)酸鈉組鏡下表現(xiàn)炎細(xì)胞和纖維組織增生分布區(qū)別不明顯。見(jiàn)圖2。

光鏡下粘連程度比較：假手術(shù)組可見(jiàn)到間質(zhì)細(xì)胞間很薄的一層纖維組織，纖維組織間見(jiàn)薄薄的間皮細(xì)胞；對(duì)照組盲腸腹壁間粘連帶中可見(jiàn)纖維組織增生增厚，間皮細(xì)胞增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；透明質(zhì)酸鈉組與華蟾素組可見(jiàn)部分粘連組織中少量纖維增生和間皮細(xì)胞增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)輕微。透明質(zhì)酸鈉組與華蟾素組纖維組織和間皮細(xì)胞增生較假手術(shù)組增生明顯活躍，比對(duì)照組增生略輕。見(jiàn)圖3。

3 討論

腸粘連的發(fā)生機(jī)制目前傾向損傷、炎癥學(xué)說(shuō)。損傷、感染等造成炎癥細(xì)胞、間皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等釋放炎癥介質(zhì)，造成毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增高，漿液滲出。刺激釋放凝血活酶，促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。這些滲出液在術(shù)后3h即凝結(jié)形成粘連，3d內(nèi)即自行溶解。若粘連能保持3d或更久而不被吸收，則有成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管長(zhǎng)入，形成永久粘連[2，12]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，對(duì)照組腹腔內(nèi)粘連程度比較重，提示腸粘連模型是成功的；與對(duì)照組相比，華蟾素組和透明質(zhì)酸鈉組均能明顯降低組織間粘連，提示華蟾素和透明質(zhì)酸鈉組在減輕腸粘連方面是有效的，但與假手術(shù)組相比腹腔粘連仍較重，二者達(dá)不到假手術(shù)組的效果，提示其防粘連作用有局限性。華蟾素組與透明質(zhì)酸鈉組相比，華蟾素組平均秩略好，但二者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

光鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，華蟾素組和透明質(zhì)酸鈉組中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度和纖維增生程度均較對(duì)照組輕，表明華蟾素可減輕急性炎癥反應(yīng)，這與文獻(xiàn)[7-8]的研究結(jié)果是一致的，再次證實(shí)華蟾素具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。華蟾素可通過(guò)抑制急性炎癥期的炎癥反應(yīng)，減少炎性滲出，從而抑制纖維組織增生和纖維化形成[13-14]，達(dá)到減輕大鼠腹腔內(nèi)粘連的狀況。

本實(shí)驗(yàn)還觀察到，華蟾素可顯著降低腹腔內(nèi)TGF-β1含量和血清中TNF-α含量，這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[13，15]，進(jìn)一步表明，TGF-β1和TNF-α等炎癥介質(zhì)可能發(fā)揮了較為重要的作用[3]。

由此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持了炎癥損傷學(xué)說(shuō)，提示手術(shù)損傷造成炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放TGF-β1和TNF-α等炎癥介質(zhì)，使毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增高，漿液滲出。華蟾素通過(guò)抑制炎細(xì)胞移出、減少損傷組織中炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度，從而抑制TGF-β1和TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，最終減少膠原纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為膠原纖維蛋白，抑制纖維組織增生，從而達(dá)到減輕腸粘連程度的目的。

本實(shí)驗(yàn)還觀察到華蟾素組與透明質(zhì)酸鈉組相比，TGF-β1和TNF-α炎癥介質(zhì)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腹腔內(nèi)粘連分級(jí)差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但平均秩明顯要好一點(diǎn)，提示華蟾素在預(yù)防腹腔腸粘連上比透明質(zhì)酸鈉可能有一定的優(yōu)勢(shì)。分析粘連分級(jí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因可能是樣本量較少，TGF-β1和TNF-α差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能與大鼠損傷已度過(guò)急性炎癥階段，而取材時(shí)間已趨向平緩有關(guān)，需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，華蟾素屬于水溶性制劑，臨床腹腔沖洗和灌洗等均比透明質(zhì)酸鈉等藥物方便，臨床上更容易開(kāi)展使用。

綜上，華蟾素腹腔灌注可以抑制急性炎癥期的炎癥細(xì)胞反應(yīng)和抑制纖維組織增生，從而減輕腹腔腸粘連程度，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1和TNF-α的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。華蟾素屬于水溶性制劑，臨床上更容易開(kāi)展使用。