鮮積雪草化學(xué)成分的分離鑒定

黃穎雪 繆麗蘭 田明明 吳繼春

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

積雪草Centellaasiatica(L.)Urb.為傘形科積雪草屬多年生匍匐草本植物，廣泛分布于長江流域以南各地。積雪草用藥歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱利濕、解毒消腫的功效，主要用于治療濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋熱淋、癰腫瘡毒、跌撲損傷等病癥[1-2]。同時(shí)，鮮積雪草還是一種使用廣泛的鮮藥，內(nèi)服或外用治療流行性腮腺炎、傳染性肝炎、帶狀皰疹等[3]。目前，已從該植物中發(fā)現(xiàn)三萜及其苷類、多炔類、揮發(fā)油、黃酮類、生物堿等化學(xué)成分[4]。藥理研究[5]表明，積雪草提取物具有抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、抗阿爾茲海默癥、改善學(xué)習(xí)記憶能力、抗抑郁、抑制瘢痕增生和修復(fù)皮膚損傷等作用，積雪草苷被認(rèn)為是發(fā)揮相關(guān)功效的主要活性成分。此外，積雪草總黃酮還具有促進(jìn)組織愈合、止血、止痛等活性[6]。對鮮積雪草化學(xué)成分的研究未見報(bào)道。研究表明，鮮藥與干藥中的化合物種類和含量可能存在差異，藥理作用也有區(qū)別[7]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)對鮮積雪草全草95%乙醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，得到7個(gè)化合物，其中3個(gè)化合物為首次從積雪草中分離得到。報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker Avance Neo-400 MHz核磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，德國Bruker公司)；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；WFH-308B型三色紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；數(shù)顯熱風(fēng)槍(德力西電氣)。

1.2 材料 柱層析硅膠(200～300目、300～400目，青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(美國GE公司)；GF254薄層硅膠板(青島海洋化工有限公司)。其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)藥材于2019年11月采自貴州省貴陽市花溪大學(xué)城，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)江洪副教授鑒定為傘形科植物積雪草Centellaasiatica(L.)Urb.的新鮮全草。

2 提取與分離

鮮積雪草全草100 kg，洗凈切碎，95%乙醇(200 L)浸泡提取4次，提取液減壓濃縮得浸膏3.0 kg?？偨嗷鞈矣?0 L水中，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。石油醚萃取部分(640 g)經(jīng)硅膠柱層析分離，石油醚∶乙酸乙酯(100∶0→0∶100)梯度洗脫，得到5個(gè)流分Fr.A～Fr.E。Fr.B經(jīng)硅膠柱層析分離，石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脫，得到Fr.B-1～Fr.B-2兩個(gè)流分。Fr.B-1經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫)得到化合物1(150 mg)。Fr.C重結(jié)晶(乙酸乙酯)得化合物2(15 g)；母液經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫)得到化合物3(20 mg)。乙酸乙酯萃取部分(100 g)通過硅膠柱層析，二氯甲烷∶甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脫，得到4個(gè)流分Fr.F～Fr.I。Fr.G采用硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=50∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫)，最后重結(jié)晶(甲醇)得到化合物4(15 mg)。Fr.H采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脫)、Sephadex LH-20柱層析(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫)，得到化合物5(10 mg)。Fr.I采用硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脫)分為Fr.I-1～Fr.I-3。Fr.I-1和Fr.I-3的沉淀分別用乙醇反復(fù)洗滌、離心得到化合物6(8.0 g)、7(10 g)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色油狀，易溶于石油醚、二氯甲烷，分子式為C17H22O3。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.95 (1H，dd，J=8.6，4.3 Hz，H-8)，5.70 (1H，m，H-2)，5.48 (1H，dq，J=15.6，7.5，5.3 Hz，H-10)，5.26 (1H ddd，J=22.3，13.3，5.6 Hz，H-9)，5.01 (1H dd，J=10.5，5.2 Hz，H-1)，4.72 (1H，t，J=5.0 Hz，H-3)，1.98 (2H，dd，J=10.0，4.8 Hz，H-11)，1.88 (3H，s，H-17)，1.21 (2H，t，J=7.1 Hz，H-12)，1.12 (4H，m，H-13，14)，0.72 (3H，dt，J=10.7，5.0 Hz，H-15)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：169.7 (C-16)，136.2 (C-10)，135.8 (C-2)，123.7 (C-9)，116.8 (C-1)，79.0 (C-4)，75.9 (C-7)，69.4 (C-5)，69.4 (C-6)，62.9 (C-3)，60.1 (C-8)，31.2 (C-13)，28.6 (C-12)，27.6 (C-11)，22.3 (C-14)，20.7 (C-17)，13.9 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]中的化合物8-acetoxyfalcarinol相似，但是對比1H NMR和13C NMR譜發(fā)現(xiàn)，化合物1比化合物8-acetoxyfalcarinol少了兩個(gè)亞甲基。通過CAS SciFinder數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，化合物1與文獻(xiàn)[9]中的化合物Ⅲ數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物1為3-Hydroxy-8-acetoxy-pentadecadien-(1，9)-diin-(4，6)。

化合物2：白色針狀結(jié)晶，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等溶劑，分子式為C29H50O。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.30 (1H，m，H-6)，0.97 (3H，s，H-19)，0.88 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.81 (3H，m，H-27)，0.78 (3H，d，J=1.7 Hz，H-26)，0.75 (3H，d，J=6.9 Hz，H-29)，0.65 (3H，d，J=7.4 Hz，H-18)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：140.7 (C-5)，121.4 (C-6)，71.5 (C-3)，56.7 (C-14)，55.9 (C-17)，50.0 (C-9)，45.7 (C-24)，42.2 (C-4)，42.1 (C-13)，39.6 (C-12)，37.1 (C-1)，36.4 (C-10)，36.0 (C-20)，33.8 (C-22)，31.8 (C-8)，31.7 (C-2)，30.1 (C-7)，29.0 (C-25)，28.2 (C-16)，25.9 (C-23)，24.2 (C-15)，22.9 (C-28)，20.9 (C-11)，19.7 (C-26)，19.2 (C-19)，18.9 (C-27)，18.6 (C-21)，11.9 (C-29)，11.8 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]一致，故鑒定化合物2為β-谷甾醇。

化合物3：棕黃色油狀，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等溶劑，分子式為C21H38O4。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.39 (4H，m，H-9，10，12，13)，4.14 (3H，pd，J=11.7，4.8 Hz，H-1′，2′，3′)，2.34 (2H，t，J=7.5 Hz，-CH2-COO)，0.88 (3H，t，J=4.1 Hz，H-18)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：173.8 (C-1)，130.1 (C-10)，129.9 (C-12)，128.0 (C-13)，127.8 (C-9)，68.3 (C-2′)，65.0 (C-1′，C-3′)，34.0 (C-2)，31.8 (C-6)，31.4 (C-16)，29.5 (C-7)，29.3 (C-15)，29.1 (C-4)，29.0 (C-5)，27.1 (C-8，C-14)，25.6 (C-11)，24.8 (C-3)，22.5 (C-17)，14.0 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]一致，故鑒定化合物3為1，3-dihydroxylpropyl-(9Z，12Z)-octadeca-9，12-dienate。

化合物4：乳白色顆粒，溶于甲醇；分子式為C10H10O4。1H NMR (400 MHz，MeOD)δ：7.58 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.16 (1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，7.05 (1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)，6.80 (1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.30 (1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.87 (3H，s，-CH3)；13C NMR (100 MHz，MeOD)δ：170.9 (C-9)，150.4 (C-3)，149.3 (C-4)，146.9 (C-8)，127.7 (C-1)，123.9 (C-6)，116.4 (C-5)，115.8 (C-2)，111.6 (C-7)，56.4 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]一致，故鑒定化合物4為咖啡酸甲酯。

化合物5：黃色油狀，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯，分子式為C15H20O2。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.92 (1H，ddd，J=17.0，10.1，5.4 Hz，H-2)，5.59 (1H，m，H-10)，5.51 (1H，dd，J=8.3，1.5 Hz，H-9)，5.47 (1H，d，J=1.4 Hz，H-1)，5.24 (1H，d，J=10.1 Hz，H-1)，5.19 (1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，4.93 (1H，d，J=5.2 Hz，H-3)，2.09 (2H，qd，J=7.3，1.4 Hz，H-11)，1.38 (2H，m，H-12)，1.27 (4H，m，H-13，14)，0.87 (3H，t，J=6.8 Hz，H-15)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：135.6 (C-2)，134.5 (C-10)，127.5 (C-9)，117.3 (C-1)，79.74 (C-7)，78.1 (C-4)，70.2 (C-5)，68.6 (C-6)，63.3 (C-3)，58.4 (C-8)，31.3 (C-14)，28.8 (C-12)，27.5 (C-11)，22.4 (C-13)，13.9 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]一致，故鑒定化合物5為araliadiol。

化合物6：黃色粉末，溶于甲醇；分子式為C15H10O6。1H NMR (400 MHz，MeOD)δ：8.07 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.89 (2H，d，J=8.9 Hz，H-3′，5′)，6.37 (1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.16 (1H，d，J=2.1 Hz，H-6)；13C NMR (100 MHz，MeOD)δ：177.2 (C-1)，165.5 (C-7)，162.4 (C-5)，160.4 (C-4′)，158.1 (C-9)，147.9 (C-2)，137.0 (C-3)，130.6 (C-2′，C-6′)，123.6 (C-1′)，116.2 (C-3′，C-5′)，104.5 (C-10)，99.2 (C-6)，94.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]一致，故鑒定化合物6為山柰酚。

化合物7：黃色粉末，溶于甲醇；分子式為C15H10O7。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ：7.67 (1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，7.54 (1H，dd，J=8.5，2.2 Hz，H-6′)，6.88 (d，J=8.5 Hz，H-5′)，6.40 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.18 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C NMR (100 MHz，DMSO-d6)δ：175.3 (C-4)，163.4 (C-7)，160.2 (C-5)，155.6 (C-9)，147.1 (C-2)，146.2 (C-4′)，144.5 (C-3′)，135.2 (C-3)，121.4 (C-1′)，119.4 (C-6′)，115.1 (C-5′)，114.5 (C-2′)，102.5 (C-10)，97.6 (C-6)，92.8 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]一致，故鑒定化合物7為槲皮素。

4 討論

新鮮積雪草總浸膏采用硅膠、Sephadex LH-20凝膠柱層析等方法進(jìn)行分離純化，通過核磁共振波譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu)，得到7個(gè)化合物，分別是3-Hydroxy-8-acetoxy-pentadecadien-(1，9)-diin-(4，6)(1)、β-谷甾醇(2)、1，3-dihydroxylpropyl-(9Z，12Z)-octadeca-9，12-dienate (3)、咖啡酸甲酯(4)、araliadiol (5)、山柰酚(6)、槲皮素(7)。其中化合物1、5是聚炔類化合物。聚炔具有抗微生物、抗腫瘤、異株克生等活性[16]?；衔?的活性研究未見報(bào)道，化合物5具有抑制人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)生長[13]和保護(hù)神經(jīng)[17]等作用。雖然前人也從積雪草中得到多種聚炔成分，但是對這些成分的活性研究較少，有待深入。化合物6和7是黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)化合物在新鮮積雪草中含量較高。有文獻(xiàn)[18]報(bào)道積雪草中的山奈酚含量較低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果矛盾?；衔?具有抗腫瘤、治療糖尿病和骨質(zhì)疏松、保護(hù)損傷細(xì)胞等作用[19]，化合物7具有抗糖尿病、抗高血壓、抗阿爾茨海默病、抗衰老及保護(hù)心血管等作用[20]。積雪草總黃酮在治療慢性肛裂的過程中能夠促進(jìn)組織聚合、止血、減少疼痛[6]，今后可以針對積雪草中的黃酮單體化合物展開相關(guān)研究?；衔?、3、4為首次從積雪草中分離得到，同時(shí)化合物6的含量與前人報(bào)道矛盾，表明干鮮積雪草的化合物種類和含量可能均有差異。后續(xù)還需要系統(tǒng)分析產(chǎn)地、采收期、加工過程等因素對積雪草的化學(xué)成分和功效的影響，為合理開發(fā)利用這一藥材提供依據(jù)。