利用PCR 技術(shù)檢測BoHV-1 病毒的研究進展

李寧晰，顧文源，倪俊卿，馬亞賓，朱禮倩，丁秀艷★

（1.河北大學生命科學學院，河北保定 071002；2.河北省動物疫病預防控制中心，河北石家莊 050026；3.河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050035）

1 牛皰疹病毒1 型

牛皰疹病毒1 型（Bovine herpes virus 1，Bo-HV-1）是皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科成員。 牛是BoHV-1 感染的自然宿主，在全球廣泛流行和分布，對世界養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失，美國養(yǎng)牛業(yè)因該病毒每年損失約30 億美元。

通常BoHV-1 病毒感染引起呼吸道、 生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。 其潛伏期通常為2～7 天。其臨床癥狀主要包括呼吸系統(tǒng)炎癥、高燒、結(jié)膜炎、鼻孔發(fā)炎、呼吸困難、生殖器官病變潰瘍以及子宮炎癥等。 重要的是BoHV-1 感染還可以導致免疫抑制，從而導致繼發(fā)性細菌感染，引起牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合癥（BRDC），是引起幼畜死亡的重要原因之一。 急性感染后會建立持續(xù)終生的潛伏感染，長途運輸、疾病和用藥等均能激活潛伏感染的病毒， 從而產(chǎn)生具有感染性的病毒并引起發(fā)病。

大量流行病學調(diào)查表明BoHV-1 在我國廣泛分布，并造成了較大的經(jīng)濟損失。 開發(fā)簡便、快速并且適合大范圍應用的病毒檢測技術(shù)對我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義， 本文就目前常用實驗室檢測技術(shù)進行綜述。

2 實驗室檢測BoHV-1 感染的常用方法及PCR 檢測的優(yōu)勢

目前實驗室檢測BoHV-1 感染的技術(shù)較多，例如細胞培養(yǎng)、組織病理學、血清學、病毒分離鑒定、 電子顯微鏡和聚合酶鏈式反應（PCR）等。 細胞培養(yǎng)技術(shù)是利用BoHV-1 感染細胞造成的細胞病變效應（CPE）的特征性，通過觀察CPE 來進行檢測， 需要細胞培養(yǎng)周期長且檢測的準確性較低； 組織病理學通過檢測組織樣本中病毒基因表達產(chǎn)物來對BoHV-1 感染進行檢測，由于這類病毒裂解性感染是暫時性的，故組織學檢測具有時間局限性； 電子顯微鏡技術(shù)可以通過識別細胞樣本中病毒顆粒從而快速檢測BoHV-1 感染，但其準確性同樣較低；病毒分離鑒定是BoHV-1 感染常用檢測方法，但病毒分離的條件比較苛刻， 病毒失活以及分離時間過久都會影響檢測結(jié)果， 且病毒分離鑒定僅限于實驗室檢驗，很難進行大規(guī)模的臨床樣品檢測；血清學測試則通過利用多種酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對感染牛的血清樣本進行檢測，相較于前面所述的幾種方法，ELISA 技術(shù)操作相對簡單方便，也是目前應用較多的一項檢測技術(shù)。 但是該方法所用試劑盒主要依賴進口產(chǎn)品， 價格較高，不適合大量臨床樣品檢測。

對比上述幾類檢測技術(shù)，PCR 方法具有便捷、靈敏度更高、成本低等優(yōu)勢，可以在較短時間內(nèi)獲得檢測結(jié)果。 PCR 方法所具有的高度靈敏性使其在檢測過程中對于樣品的要求更低，利用眼鼻拭子、精液、腦組織等樣品均可以進行檢測。 不同種類的PCR 技術(shù)（如熒光定量PCR、巢式PCR、多重PCR 等）也可以滿足不同條件下的檢測需求， 并且檢測成本以及檢測環(huán)境的要求也相對較低，適用于大規(guī)模檢測。

3 不同PCR 方法檢測BoHV-1 研究現(xiàn)狀

3.1 常規(guī)PCR 技術(shù)

常規(guī)的PCR 技術(shù)是相對簡便的基因片段擴增實驗方法， 也是最早被嘗試應用于檢測Bo-HV-1 感染的方法之一。 常規(guī)PCR 通過設(shè)計與BoHV-1 病毒基因片段的特異性結(jié)合引物，確定最佳反應條件（如退火溫度、延伸時間等），準確擴增對應病毒基因片段，通過凝膠電泳直觀準確的顯示檢測結(jié)果。

盡管常規(guī)PCR 是成熟的實驗技術(shù)， 大量實驗發(fā)現(xiàn)在實際檢測中很難順利擴增BoHV-1 基因片段，其原因可能在于BoHV-1 基因組中富含CG 堿基，故在引物設(shè)計以及目的片段擴增實驗過程中難以對退火溫度等條件進行優(yōu)化， 常規(guī)PCR 實驗擴增的特異性降低， 從而導致實驗結(jié)果容易出現(xiàn)非目的條帶，甚至可能出現(xiàn)無法擴增目的DNA 片段的情況， 這限制了PCR 技術(shù)在BoHV-1 臨床檢測中的應用。

3.2 巢式PCR

巢式PCR（Nested PCR）也稱為套式聚合酶鏈反應， 是一種在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上改進的實驗技術(shù)， 可以在常規(guī)PCR 特異性偏低的情況下用于PCR 實驗檢測。 這種實驗方法需要設(shè)計兩對不同的PCR 引物，第一對引物用于對目的DNA片段進行常規(guī)的PCR 擴增， 然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板， 利用第二對引物 （被稱為巢式引物），擴增一條相對更短的DNA 片段，可以排除第一輪常規(guī)PCR 擴增中出現(xiàn)的非特異性條帶，通過巢式PCR 技術(shù)可以提高PCR 擴增的特異性。

利用巢式PCR 可以解決常規(guī)PCR 檢測Bo-HV-1 病毒感染實驗中出現(xiàn)的非特異性片段擴增問題，從而提高PCR 檢測的準確性，同時提高其準確性。 目前巢式PCR 實驗技術(shù)已經(jīng)相對成熟，并應用于多種病毒的檢測。 研究顯示在病毒感染后， 在抗體產(chǎn)生之前即可通過巢式PCR 檢測到精液等樣品中的BoHV-1。 當前已經(jīng)有研究利用巢式PCR 檢測牦牛樣本中BoHV-1 感染。隨著研究的深入， 巢式PCR 技術(shù)檢測BoHV-1核酸具有廣闊的應用前景。

3.3 熒光定量PCR 檢測技術(shù)

熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種常用于通過對感染病原微生物基因或其mRNA 表達進行定量實驗室檢測技術(shù)，通過設(shè)計帶有熒光標記的探針對PCR 產(chǎn)物進行特異性標記，可以實時監(jiān)控PCR 反應過程，隨著目的片段的擴增，熒光信號逐漸增強，從而獲得循環(huán)閾值（CT）等相關(guān)數(shù)據(jù)，用于計算分析待檢基因的拷貝數(shù)等所需結(jié)果。國外已有多個實驗室已建立了利用熒光定量PCR 對BoHV-1 臨床樣品進行檢測的技術(shù)。

相較于血清學等檢測方法， 熒光定量PCR具有可再現(xiàn)性、 高特異性和高敏感性等優(yōu)點，縮短了檢測時間， 并實現(xiàn)了對基因進行定量的檢測。 研究表明熒光定量PCR 技術(shù)可以區(qū)分Bo-HV-1 與BoHV-5。 此外在基礎(chǔ)研究中也可以利用熒光定量PCR 檢測BoHV-1 基因表達變化情況。

3.4 其他PCR 相關(guān)檢測方法

除上述幾類常用的PCR 檢測方法外， 還有其他PCR 檢測技術(shù)被用于檢測BoHV-1 檢測及相關(guān)基礎(chǔ)研究。 例如多重聚合酶鏈式反應（Multiplex PCR Assay），可以通過實驗操作在同一的反應體系中使用多對引物，在檢測BoHV-1感染的同時分別檢測與BoHV-1 致病相關(guān)的多種其他牛病病毒，以實現(xiàn)對病畜感染情況進行快速定性檢測，目前這種方法經(jīng)已經(jīng)可以用于檢測并區(qū)分4 種與BoHV-1 相關(guān)的病毒。另外有研究表明PCR 檢測可以與southern 印跡雜交技術(shù)結(jié)合，具有更高的敏感性，可用于檢測精液等樣本中的BoHV-1 病毒。 這些PCR 技術(shù)為PCR 檢測BoHV-1 感染提供了更多選擇。

4 總結(jié)與展望

BoHV-1 作為一種以牛作為唯一自然宿主的病原體，病毒感染主要引起呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的疾病，并對病畜造成免疫抑制，影響病畜種群的經(jīng)濟效益。研發(fā)更加高效準確且適用于對大規(guī)模臨床樣品進行BoHV-1 檢測的產(chǎn)品， 將對BoHV-1 進行高效防控提供重要保障，而在諸多檢測技術(shù)中，PCR 技術(shù)是一個較好的選擇。

相較于其他常用的檢測方法 （如病毒分離鑒定、ELISA 檢測等），PCR 檢測靈敏度較高，對于待檢樣品的量需求較少， 檢測周期相對較短，檢測成本較低，可以應對數(shù)量較多、規(guī)模較大的檢測需求。 不同種類的PCR 技術(shù)也可以滿足不同條件下的檢測需求。 盡管如此，PCR 在檢測BoHV-1 感染方面仍有一些問題需要解決，例如PCR 檢測技術(shù)具有較高的靈敏度和準確性，但容易受到實驗環(huán)境和實驗過程操作等方面的干擾而導致實驗結(jié)果發(fā)生偏差，因此，進一步提高PCR 檢測效率、 準確性和提高實驗穩(wěn)定性才能進一步提高PCR 技術(shù)在BoHV-1 檢測方面的應用價值?？傊?，利用PCR 檢測BoHV-1 的技術(shù)正在不斷完善，隨著研究的推進，PCR 檢測技術(shù)可以為BoHV-1 病毒防治工作提供更加便捷高效的檢測方法。